3.4 Membranassoziation von Atγ-COP und AtSec23p
3.4.5 Membrangebundene Atγ-COP und AtSec23p in Saccharosedichtegradienten
Da die relative Auftrennung der mikrosomalen Membranfraktionen aus Blumenkohl mit der Gelfiltration über die Sephacryl S-1000-Säule nicht möglich war, wurde eine isopyknische Zentrifugation der Membranfraktion im Saccharosedichtegradienten durchgeführt, um sie aufgrund ihrer verschiedenen Dichten aufzutrennen. Die Organellen und ihre Bruchstücke bewegen sich bei der isopyknischen Zentrifugation so lange durch den Gradienten, bis sie einen Punkt erreichen, an dem ihre Dichte mit der des Gradientenmediums übereinstimmt. Dafür muss die Zentrifugation lange genug durchgeführt werden (z. B. 12-16 h bei 100.000 gmax in einem Ausschwingrotor) (Robinson und Hinz, 2000). Durch Verwendung eines vertikalen Rotors kann diese Zeit, wegen der kürzeren Trennstrecke und der höheren g-Zahl, erheblich verkürzt werden.
Da membrangebundene Sec21p und Sec23p im Laufe der Zeit durch die GTP-Hydrolyse von Membranen dissoziiert werden, wurde für die Aufarbeitung der mikrosomalen Membranen der vertikale Rotor mit der kürzeren Zentrifugationszeit ausgewählt. Mikrosomale Membranen wurden zuerst durch eine einstündige Zentrifugation auf einem 55%-igen (w/w) Saccharosekissen gesammelt, um ihre Konzentration zu erhöhen (siehe Kap. 2.2.4.2). Diese
Membranfraktion wurde danach auf einem linearen 20-55 % (w/w) Saccharosedichtegradienten unter Plus-Magnesium-Bedingungen aufgetragen und zentrifugiert. Unter diesen Bedingungen zeigen Membranen eine höhere Schwebedichte, weil die Assoziation der Ribosomen mit ER-Membranen, die magnesiumabhängig ist, erhalten bleibt. Im Gegensatz dazu werden unter Minus-Magnesium-Bedingung Ribosomen von den Membranen abgelöst. Deshalb haben ER-Membranen in Abwesenheit von Magnesium eine niedrigere Dichte. Dadurch kann das ER von anderen Kompartimenten, wie dem GApp, den CCVs und der Plasmamebran besser getrennt werden. Mit der Beobachtung der Verteilung der verschiedenen Proteine unter Plus- und Minus-Magnesium-Bedingungen, kann festgestellt werden, ob ein Protein im ER vorkommt.
Nach der isopyknischen Zentrifugation wurde die Verteilung der unter Kap. 3.4.4 beschriebenen Markerproteine durch Western-Blotting untersucht. Unter Plus-Magnesium-Bedingungen zeigten BiP und RGP, die Aufschluss über die ER- und Golgi-Membranen geben, eine breite Verteilung mit einem Peak bei einer Saccharosedichte von 37 % (w/w) (Abb. 3.14). Bei der Kreuzreaktion der beiden Antikörper mit den ersten Fraktionen in einem Saccharosedichtebereich von 20-22 % (w/w) handelt es sich möglicherweise um die von den Membranen abdissoziierten Proteine, die nun als lösliche Proteine auf dem Gradienten vorkommen. Die PM war in höheren Saccharosedichten im Bereich von 41-43 % (w/w) nachweisbar. Diese hohe Dichte der PM kann mit der Assoziation von Zellwandbruchstücken erklärt werden. β-Adaptin-enthaltende Fraktionen traten in Saccharosedichten von 38-45 % (w/w) auf. Es wurde nachgewiesen, dass dieses Protein sowohl mit CCVs als auch mit der PM assoziiert ist (Robinson 1987; Drucker et al., 1995). Die β-Adaptin-Verteilung überlappte zum Teil mit der PM-ATPase, war im Vergleich jedoch in einem breiteren Saccharosedichtebereich zu finden. Daher kann man davon ausgehen, dass diese Kreuzreaktion nicht nur die Verteilung der PM, sondern auch die der CCVs widerspiegelt. Es ist auch möglich, dass mit Clathrin assoziierte Golgielemente bei der Homogenisation von anderen Zisternen abgetrennt werden und in diesen Fraktionen neben den CCVs vorkommen (siehe Kap. 1.2) (Robinson, 1985). Die Verteilungsprofile von Atγ-COP und AtSec23p zeigten drei Peaks (Abb. 3.14), wobei der Nachweis von AtSec23p in dem Saccharosedichtegradienten sehr schwierig war. Hier hatten sich vermutlich die membrangebundenen COPII-Hüllproteine durch die Aufarbeitung der Membranen unter Verwendung verschiedener Saccharoselösungen (für Saccharosekissen und Saccharosedichtegradienten) von den Membranen abgelöst. Bei dem ersten Peak von Atγ-COP und AtSec23p auf dem Gradienten handelte es sich um von Membranen abdissoziierte Proteine, die nun als lösliche Proteine vorkamen. Der zweite Peak war mit den ER/Golgi-Fraktionen kolokalisiert und der dritte lag mit einer Saccharosedichte von 43-46 % in einem Bereich, der typisch für Transportvesikel ist (Robinson und Hinz, 2000).
Abb. 3.14: Verteilung der mikrosomalen Membranen in einem Saccharosedichtegradienten unter Plus-Magnesium-Bedingungen.
Um eine Auftrennung von ER und GApp im Saccharosedichtegradienten zu erreichen, wurden die Verteilung der mikrosomalen Membranen von Blumenkohl unter Minus-Magnesium-Bedingungen untersucht (siehe Kap. 2.2.4.2). Dabei sollte festgestellt werden, ob Atγ-COP und AtSec23p mit ER oder GApp assoziiert sind. Unter diesen Bedingungen zeigte der ER-Marker BiP eine klassische Verschiebung zu niedrigeren Saccharosedichten mit einem Peak bei 29 % (w/w) Saccharose (Abb. 3.15). Eine kleinere, aber auffällige Verschiebung (von einem Peak bei 37 % zu einem Peak bei 34 % (w/w) Saccharose) wurde auch mit dem GApp-Marker RGP beobachtet. Das wurde durch die in Abb. 3.15 dargestellte Verteilung der Aktivität der latenten IDPase, die ein Markerenzym für den GApp ist, bestätigt. Die Verteilungsprofile der PM-ATPase und von β-Adaptin entsprachen den Plus-Magnesium-Bedingungen und blieben unbeeinflusst von der Magnesiumkonzentration. Die Atγ-COP und AtSec23p enthaltenden Fraktionen traten bei diesem Versuch auch in drei distinkten Proteinpeaks auf, wobei bei beiden Proteinen nur der zweite Peak eine Verschiebung zu einer niedrigeren Saccharosedichte zeigte. Während die Verschiebung von AtSec23p vergleichbar mit der von BiP war, überlappte der zweite Proteinpeak von Atγ-COP mit BiP und RGP. Der Vergleich der Gradienten unter Plus- und Minus-Magnesium-Bedingungen konnte zeigen, dass Atsec23p mit den ER-Membranen und
Atγ-COP mit den Membranen des GApp und/oder des ER assoziiert sind. Darüber hinaus sind diese Proteine auch in den Fraktionen mit hoher Saccharosedichte nachweisbar. Es ist möglich, dass in diesen Fraktionen COP Vesikel vorkommen, deren Proteinhülle noch nicht dissoziiert ist.
Abb. 3.15: Verteilung der mikrosomalen Membranen in einem Saccharosedichtegradienten unter Minus-Magnesium-Bedingungen. Die Aktivität der latenten IDPase als Markerenzym für den GApp und die Verteilung von RGP sind vergleichbar und bestätigen sich gegenseitig.