Die Sequenz der γ-COP-cDNA und die Klonierungsstrategie

Der γ-COP-cDNA-Klon 150F14T7 mit der "GenBank Accession" Nummer T75984 (Newman et al., 1994) wurde beim Arabidopsis Biological Resource Centre (Ohio State University, Columbus, USA) bezogen. Die Sequenzierung ergab, dass die cDNA eine Länge von 1565 bp hat und ein Stoppkodon an bp-Position 1362 besitzt (Abb. 3.1). Das von dieser cDNA abgeleitete Polypeptid (P^✳) besteht daher aus 454 Aminosäuren. Gegen Ende der vorliegenden Arbeit wurde ein weiteres, vollständiges γ-COP (P^✳✳) aus Arabidopsis veröffentlicht, das von einer genomischen Nukleotidsequenz mit der "GenBank Accession" Nummer AL023094 kodiert wird (siehe Anhang 1). Die Aminosäuresequenzen der beiden Polypeptide wurden miteinander verglichen. Dieser Vergleich zeigte, dass es sich bei dem von der cDNA abgeleiteten Polypeptid (P^✳) um ein γ-COP-Fragment handelt und es mit den letzten 417 Aminosäuren am Aminoterminus des vollständigen γ-COP (P^✳✳) (unterstrichen in Anhang 1) zu 88 % identisch und zu 89 % ähnlich ist (für die Bestimmung der Identität und Ähnlichkeit von Aminosäuren siehe Kap. 2.1.10). Ein auffälliger Unterschied zwischen beiden Fragmenten ist, dass ein 36-Aminosäuren langer Abschnitt im vollständigen γ-COP (P^✳✳) fehlt. Diese Sequenz ist in dem von der cDNA abgeleiteten Polypeptid (P^✳) in Position 109-144 vorhanden (unterstrichen in der Abb.

3.1). Abgesehen von dieser Lücke sind beide Fragmente zu 95 % identisch und 96 % ähnlich.

Interessanterweise zeigt das vollständige γ-COP (P^✳✳) aus Arabidopsis genau in dieser Domäne einen Unterschied zu dem homologen Protein Sec21p aus Hefe, das von einer genomischen Nukleotidsequenz mit der "GenBank Accession" Nummer NC_001146 (Goffeau et al., 1996) abgeleitet wird. Ein Sequenzvergleich von dem vollständigen γ-COP (P^✳✳) aus Arabidopsis mit dem Sec21p aus Hefe ergab 35 % identische und 54 % ähnliche Aminosäuren. In Anhang 1 ist der Vergleich der Aminosäuresequenzen der beiden Proteine inklusive ihrer identischen bzw.

ähnlichen Bereiche (schwarz hinterlegt) dargestellt. Der Bereich der letzten 415 Aminosäuren am Aminoterminus des putativen γ-COP (P^✳✳) aus Arabidopsis (unterstrichen in Anhang 1) zeigt zum entsprechenden Bereich von Sec21p aus Hefe 32 % Identität und 47 % Ähnlichkeit. Im Vergleich dazu ist das von der γ-COP-cDNA abgeleitete Polypeptid (P^✳) zu diesem Bereich von Sec21p zu 33 % identisch und zu 49 % ähnlich.

Sal I Mlu I * 30 * 60 *

Abb. 3.1: Nukleotidsequenz der cDNA des Klons 150F14T7 mit abgeleiteter Aminosäuresequenz. Der unterstrichene Teil fehlt in der vollständigen γ-COP-Sequenz aus Arabidopsis (siehe Anhang 1).

* 630 * 660 *

Die cDNA war zwischen den Schnittstellen von Sal I und Not I im Vektor λPRL2 einkloniert.

Das cDNA-Insert wurde komplett mit Sal I und Not I aus diesem Vektor herausgeschnitten und in dem richtigen Leseraster in den mit Sal I und Not I geöffneten Expressionsvektor pGEX-4T-3 kloniert (siehe Anhang 2). Da die cDNA aus 1565 bp und der Vektor aus 4968 bp bestanden, war das Ligationsprodukt 6533 bp groß. Mit dem Ligationsprodukt wurden zunächst E. coli DH5α-Zellen transformiert. Zur Kontrolle der Klonierung wurde das Konstrukt aus einem positiven Klon isoliert und sequenziert. Nachdem die Sequenzierung die Korrektheit der Klonierung bestätigt hatte, wurden E. coli-Zellen des Expressionsstammes BL-21 mit dem Konstrukt transformiert. Durch Mini-Präparation von Plasmid-DNA und zwei unterschiedlichen Restriktionsverdau-Ansätzen wurde die Korrektheit des Konstrukts in den BL-21-Zellen überprüft. Der erste Verdau wurde mit Sal I und Not I durchgeführt. Die Abb. 3.2 A, Bahn 3 zeigt das 1565 bp große Sal I/Not I-Fragment, das in den 4968 bp großen Expressionsvektor pGEX-4T-3 einkloniert war. Da der Expressionsvektor und das cDNA-Insert jeweils eine Schnittstelle für Mlu I hatten (siehe Abb. 3.1 und Anhang 2), wurde dieses Enzym für einen zweiten Verdau verwendet, um ganz sicher zu sein, dass die BL-21-Zellen mit dem richtigen Ligationsprodukt transformiert worden waren. Wenn die Schnittstelle für Sal I als bp-Position 1 definiert wird, ist die erste Schnittstelle für Mlu I (im cDNA-Insert) an bp-Position 8 und die zweite (im Vektor) an bp-Position 4284. Deshalb wurde erwartet, dass durch den Verdau mit Mlu I zwei 4276 und 2257 bp große Fragmente entstehen. Wie Abb. 3.2 A, Bahn 4 zeigt, konnten zwei Fragmente der richtigen Größe nach dem Restriktionsverdau mit Mlu I nachgewiesen werden. Im nächsten Schritt wurde die Expression des GST-Fusionsproteins mit IPTG induziert und das Protein durch eine Glutathion-Sepharose-Säule aufgereinigt (siehe Kap. 2.1.11). Das aufgereinigte GST-Fusionsprotein wurde nach einer SDS-PAGE mit anschließender Coomassiefärbung aus dem Gel eluiert und in dieser Form direkt als Antigen verwendet. In Abb. 3.2 B ist die Fraktion des aufgereinigten Fusionsproteins nach der SDS-PAGE und der Silberfärbung zu sehen. Das Fusionsprotein zeigte eine apparente Molekularmasse von 81 kDa. Dieses Protein wurde von dem gegen Sec21p gerichteten Antikörper nicht erkannt. Der Antikörper gegen GST zeigte aber mit diesem GST-Fusionsprotein eine spezifische Kreuzreaktion (Abb. 3.2 B, Bahn 4). Die Immunisierung eines Kaninchens mit dem Fusionsprotein wurde von der Firma Eurogentec (Seraing, Belgien) durchgeführt. Das Immunisierungsprotokoll ist in Kap. 2.1.11 aufgeführt. Das zur Immunisierung verwendete Antigen wurde beim Western-Blotting von dem Antiserum sehr spezifisch erkannt (Abb. 3.2 B, Bahn 5). Das Präimmunserum ergab dagegen in verschiedenen Verdünnungen kein Signal.

Abb. 3.2: Gewinnung eines Antikörpers gegen γ-COP aus Arabidopsis.

A) Auftrennung der DNA-Fragmente im Agarosegel. Bahn 1: Längenstandard, Bahn 2: der Expressionsvektor nach der Sal I/Not I-Spaltung, Bahn 3: Sal I/Not I-Spaltungsprodukte des Expressionsvektors nach der Einklonierung der γ-COP-cDNA, Bahn 4: Mlu I-Spaltungsprodukte des Expressionsvektors nach der Einklonierung der γ-COP-cDNA.

B) SDS-PAGE und Western-Blotting. Bahn 1: Molekularmassenmarker, Bahn 2 und 3: GST-Fusionsprotein (Antigen) nach der Aufreinigung im sibergefärbten Acrylamidgel, Bahn 4: die Kreuzreaktion des GST-Fusionsproteins mit dem Antikörper gegen GST, Bahn 5:

Kreuzreaktion des GST-Fusionsproteins mit dem gewonnen Antikörper. Pro Bahn wurden 1 µg (Bahn 2), 4 µg (Bahn 3), 0,2 µg (Bahn 4 und 5) Protein aufgetragen.