Mit den gegen Atγ-COP und AtSec23p gerichteten Antikörpern und mit den Antikörpern gegen Zmδ-COP, Zmε-COP, AtSar1p und AtArf1p, die erst in der Endphase der vorliegenden Arbeit verfügbar waren, wurde die Verteilung putativer Bestandteile der Proteinhülle der pflanzlichen COP Vesikel zwischen dem Cytosol und den Membranen der verschiedenen Pflanzen untersucht.
Atγ-COP, AtSec23p, Zmδ-COP und Zmε-COP konnten im Cytosol stärker als in der Membranfraktion nachgewiesen werden. Das spricht dafür, dass diese Proteine in Pflanzenzellen überwiegend in löslicher und weniger in membrangebundener Form vorliegen. Das traf nicht auf
die GTPasen AtSar1p und AtArf1p zu. Während AtArf1p gleichmässig auf Cytosol und Membranen verteilt zu sein scheint, liegt AtSar1p vor allem an Membranen gebunden vor. Diese Verteilung von Sar1p wurde auch von anderen Arbeitsgruppen in verschiedenen Geweben von Arabidopsis (siehe Abb. 2 in Bar-Peled und Raikhel, 1997) und ebenfalls in Hefezellen (Barlowe et al., 1993) nachgewiesen. In Hefe ist mehr als 80 % von Sar1p membrangebunden. Durch eine Überexpression von AtSar1p in Arabidopsis wurde nur die Konzentration des cytosolischen und nicht die des membrangebundenen Proteins erhöht (Bar-Peled und Raikhel, 1997). Das bedeutet, dass in vivo die maximale Membranbindung von AtSar1p in Pflanzenzellen erreicht wird.
Für die proteinbiochemische Charakterisierung von Atγ-COP und AtSec23p wurden die Zellen von Blumenkohlinfloreszenzen verwendet. Diese Zellen sind meristematisch und zeichnen sich daher durch einen aktiven Proteintransport aus. Außerdem sind Blumenkohl und Arabidopsis systematisch verwand und gehören zu der Familie der Cruciferen. Da die gewonnenen COP-Antikörper gegen Proteine aus Arabidopsis gerichtet waren, konnte diese Verwandtschaft vorteilhaft sein. Ein anderer Vorteil von Blumenkohlinfloreszenzen liegt in ihren geringen endogenen proteolytischen Aktivität. Untersuchungen zur Isolation von Hüllproteinen der CCVs hatten gezeigt, dass die Hüllproteine dieser Vesikel in verschiedenen Pflanzen während der Aufarbeitung unterschiedlich stark proteolytisch abgebaut werden (Drucker, 1995). Da die proteolytische Aktivität in der Cytosolfraktion aus Blumenkohlinfloreszenzen im Vergleich zu anderen pflanzlichen Geweben wie Erbsenkotyledonen und Zucchinihypokotylen niedriger ist (Drucker, 1995), ist die Isolierung und Charakterisierung der Proteine aus diesem Gewebe im Hinblick auf den proteolytischen Abbau weniger problematisch. Die Ammoniumsulfat-fraktionierung des Blumenkohlcytosols wurde dazu benutzt, die Konzentration von Atγ-COP und AtSec23p zu erhöhen und einen Teil der endogenen Proteasen abzutrennen (siehe Kap. 3.3.1).
Aus dem Blumenkohlcytosol konnte AtSec23p mit 30 % Ammoniumsulfat und Atγ-COP mit 40 % Ammoniumsulfat gefällt werden. Ähnliche Ammoniumsulfatkonzentrationen wurden für die Aufreinigung des Coatomers aus Säugetierzellen (Waters et al., 1991, 1992; Sheff et al., 1996) und des Sec23-Komplexs aus Hefe (Barlowe et al., 1994) beschrieben. Mit 40 % Ammoniumsulfat konnte AtSar1p vollständig und AtArf1p zu einem großen Teil präzipitiert werden. Da die endogenen Proteasen meist erst mit mehr als 50 % Ammoniumsulfat gefällt wurden, konnte mit einer 40%-igen Ammoniumsulfatfällung eine Cytosolfraktion gewonnen werden, in der die Hüllproteine von pflanzlichen COP Vesikeln angereichert und die proteolytische Aktivität reduziert war. Diese letzte Eigenschaft dieser Cytosolfraktion ist besonders wichtig für die in vitro Untersuchungen der Struktur und Funktion von COP Vesikeln.
Für die in vitro Induktion von COP Vesikeln werden ER- und/oder GApp-Fraktionen mit einer Cytosolfraktion bei 37 °C (Malhotra et al., 1989) für Säugetierzellen oder bei 20-37 °C für Pflanzenzellen (Pimpl, 1997; Pimpl et al., 2000) inkubiert. Bei diesen Temperaturen ist die Aktivität der endogenen Proteasen erheblich höher als bei 4 °C (Demmer, 1991; Drucker, 1995).
Für die in vitro Induktion der pflanzlichen COP Vesikel wurde bisher eine mit 80 % (Pimpl, 1997) oder 65 % (Pimpl et al., 2000) Ammoniumsulfat gewonnene Cytosolfraktion von Blumenkohl verwendet. Das Ergebnis der Ammoniumsulfatfraktionierung spricht jedoch dafür, dass es viel günstiger ist, diese Versuche mit einer mit 40 % Ammoniumsulfat gewonnenen Cytosolfraktion durchzuführen. Damit kann möglicherweise die Ausbeute der induzierten COP Vesikel erhöht und der Abbau der Hüllproteine reduziert werden.
Außer Arf1p und Sar1p kommen andere Hüllproteine von COP Vesikeln in Proteinkomplexen vor (siehe Kap. 1.3.2 und Kap. 1.3.3). Alle diese Komplexe wurden aus Säugetieren und Hefe isoliert und aufgereinigt (Waters et al., 1991, 1992). Mit den aufgereinigten Proteinkomplexen konnten dann in vitro COPI oder COPII Vesikel induziert werden. Das ermöglichte die Untersuchung der Struktur dieser Vesikel sowie der Funktion ihrer strukturellen Bestandteile von Vesikeln bei der Sortierung der Frachtmoleküle. Neben der Charakterisierung der löslichen Atγ-COP und AtSec23p wurde in der vorliegenden Arbeit versucht, diese Proteine mit biochemischen Methoden aufzutrennen. Damit wäre auch eine gezielte in vitro Induktion von pflanzlichen COPI bzw. COPII Vesikeln ermöglicht. Durch Gelfiltrationschromatographie der mit 40 % Ammoniumsulfat gewonnenen Cytosolfraktion wurden Atγ-COP und AtSec23p als Bestandteile der verschiedenen Proteinkomplexe nachgewiesen (siehe Kap. 3.3.2). Das Elutionsprofil von Atγ-COP stimmte mit dem des Coatomers der Säugetierzellen überein (Waters et al., 1991, 1992).
Damit wurde gezeigt, dass Atγ-COP Bestandteil eines ca. 700 kDa großen Proteinkomplexes ist, der als pflanzliches Coatomer betrachtet werden kann. Im Vergleich dazu konnte AtSec23p, wie bei Hefe und Säugetieren (Hicke et al., 1992; Paccaud et al., 1996) in einem kleineren Proteinkomplex mit einer Molekularmasse von ca. 400 kDa nachgewiesen werden. Durch Gelfiltrationschromatographie gelang auch eine partielle Auftrennung der beiden Proteinkomplexen.
Das Ergebnis, dass Atγ-COP und AtSec23p Bestandteile verschiedener Proteinkomplexe sind, wurde durch Behandlung des Cytosols mit Neomycin bestätigt. Es ist bekannt, dass das Coatomer von Hefe und Säugetierzellen an die benachbarten, freien Aminogruppen des di-Lysin-Motivs der membrangebundenen Frachtmoleküle von COPI Vesikeln bindet (Cosson und Letourneur, 1994; Tisdale et al., 1997). Aufgrund dieser Bindung des Coatomers wurden Experimente mit aminoglykosierten Antibiotika durchgeführt, die in ihrer Struktur eine oder mehrere benachbarte Aminogruppen besitzen. Mit diesen Versuchen wurde die Zahl der Bindungsstellen des Coatomers an das di-Lysin-Motiv der Membranproteine untersucht. Dabei konnte das Coatomer durch Behandlung mit Neomycin, Neamin und Sisomycin, die jeweils mindestens zwei benachbarte, freie Aminogruppen besitzen, aus dem Cytosol gefällt werden (Hudson und Draper, 1997). Das war aber nicht der Fall für Antibiotika wie Geneticin und Gentamycin C1, die nur eine benachbarte Aminogruppe haben. Diese Antibiotika konnten zwar
an das Coatomer binden und seine Bindung an das di-Lysin-Motiv und Neomycin verhindern, sie konnten aber keine großen Aggregate mit dem Coatomer bilden. Damit wurde nachgewiesen, dass beide Klassen von Antibiotika gemeinsame Bindungsstellen am Coatomer haben. Hudson und Draper (1997) sind davon ausgegangen, dass das Coatomer mehr als zwei Bindungsstellen für benachbarte Aminogruppen, wie die des di-Lysin-Motivs, besitzt. An diesen Stellen tritt es in Wechselwirkung mit verschiedenen Neomycinmolekülen, die drei benachbarte Aminogruppen besitzen und ebenfalls an mehr als einen Coatomerkomplex binden können. Das führt zur Vernetzung des Coatomers und zur Bildung großer Aggregate. Diese Aggregate können dann durch Zentrifugation vom Cytosol entfernt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde Atγ-COP als Bestandteil des pflanzlichen Coatomers im Gegensatz zum AtSec23-Komplex nach Behandlung mit Neomycin durch Zentrifugation präzipitiert (siehe Kap. 3.3.3). Diese Komplexe lassen sich also aufgrund ihrer verschiedenen Bindungseigenschaften an Neomycin schnell voneinander trennen.
Diese Cytosolfraktion kann nach einer solchen Behandlung für die spezifische in vitro Induktion der COPII Vesikel verwendet werden, weil das Coatomer für die Bildung der COPI Vesikel nicht mehr im Cytosol vorhanden ist. Da das Coatomer bei der Fällung mit Neomycin sehr stabile Aggregate bildet, die nicht mehr gelöst werden können, können die gefällten Coatomermoleküle nicht für die in vitro Versuche verwendet werden. Für diese sind die gewonnen Fraktionen der Gelfiltrationschromatographie geeignet. Dafür würde nur noch Arf1p benötigt (Spang et al., 1998), das auch durch Gelfiltration partiell aufgereinigt werden kann.