Da mit den Antikörpern gegen Atγ-COP und AtSec23p gezeigt werden konnte, dass ihre Antigene sowohl gelöst als auch membrangebunden vorkommen, wurde zunächst versucht, diese Proteine aus dem Cytosol zu charakterisieren. Durch die Ammoniumsulfatfällung sollten Fraktionen mit erhöhter Atγ-COP- und AtSec23p-Konzentration gewonnen werden, die möglichst geringe Mengen endogener Proteasen enthalten. In einem weiteren Schritt konnte dann
erforscht werden, ob beide Proteine, ebenso wie in Hefe und Säugetieren, als Bestandteile der verschiedenen Proteinkomplexe im Cytosol vorliegen.
3.3.1 Ammoniumsulfatfällung von At γ -COP und AtSec23p
Um die Konzentration von Atγ-COP und AtSec23p in der cytosolischen Fraktion zu erhöhen und sie von einem großen Teil der endogenen Proteasen zu trennen (siehe unten), wurde eine Fraktionierung des Cytosols mit Ammoniumsulfat eingesetzt. Für die Isolierung und Konzentrierung von Proteinen ist ihre Fällung mit anorganischen Salzen eine sehr geeignete Methode. Dabei wird Ammoniumsulfat am häufigsten zur Fraktionierung von Proteinen benutzt (Cooper, 1980). In Rohpräparationen mit großem Volumen wird das Salz in trockener Form zugegeben. Beim Lösen des Ammoniumsulfats wird eine große Anzahl von Wassermolekülen pro Ammoniumsulfat-Molekül gebunden. Je mehr Ammoniumsulfat in der Lösung vorhanden ist, desto weniger Wasser steht für die Wechselwirkung mit den Proteinen zur Verfügung. An einem bestimmten Punkt ist nicht mehr genug Wasser vorhanden, um eine Reihe von Proteinen in Lösung zu halten, so dass diese ausfallen. Das Aussalzen kann deswegen als ein Dehydratations-Prozess bezeichnet werden.
Nach der Fraktionierung der cytosolischen Proteine von Blumenkohlinfloreszenzen (siehe Kap. 2.2.3.1), wurde die Verteilung der Hüllproteine durch Western-Blotting untersucht. Wie Abb. 3.6 zeigt, wurde Atγ-COP mit Ammoniumsulfatkonzentrationen bis 50 % (Sättigung) gefällt, wobei die größte Menge beim Schritt von 30 % zu 40 % Ammoniumsulfat gefällt wurde.
Im Vergleich dazu fiel AtSec23p bereits bei 40 % Ammoniumsulfat vollständig aus. Der größte Teil dieses Antigens wurde bei den Schritten von 0 zu 20 % und von 20 bis 30 % Ammoniumsulfat gefällt. Das Verhalten der GTPasen AtSar1p und AtArf1p bei der Ammoniumsulfatfraktionierung war ebenfalls verschieden. AtArf1p blieb zum Teil bis zur Zugabe von 60 % Ammoniumsulfat in Lösung, wobei die größte Menge von diesem Protein durch die Erhöhung der Ammoniumsulfatkonzentration von 30 % zu 40 % ausfiel. AtSar1p wurde dagegen durch die Zugabe von 40 % Ammoniumsulfat vollständig präzipitiert.
Ein Problem der Cytosol- und Membranisolierung von Pflanzenmaterial ist die Freisetzung der in der Vakuole vorhandenen Proteasen bei der Homogenisation. Durch ihre Aktivität werden viele lösliche Proteine sowie extrinsische Membranproteine im Laufe der Aufarbeitung abgebaut.
Diese proteolytische Aktivität kann durch Zugabe der Proteaseinhibitoren und durch niedrige Temperaturen reduziert, aber nicht vollständig verhindert werden. Die Ammoniumsulfat-fraktionierung bietet die Möglichkeit, bei bestimmten Salzkonzentrationen die Proteasen von anderen Proteinen zu trennen. Daher wurde die Aktivität der Proteasen in Ammoniumsulfat-fraktionen mit dem Azocaseintest gemessen (siehe Kap. 2.4). Wie man bereits in der Abb. 3.6 sieht, ist diese Aktivität in den ersten drei Fraktionen niedriger als im Cytosol. Erst nach der
Zugabe von 50 % Ammoniumsulfat wird sie höher als im Cytosol und bei 60 % erreicht sie ihr Maximum. Daher kann mit Zugabe von 30 % und 40 % Ammoniumsulfat eine cytosolische Fraktion aus Blumenkohl gewonnen werden, die im Vergleich zum Cytosol hohe Konzentration der untersuchten Hüllproteine der COPI und COPII Vesikel und weniger Proteasen beinhaltet.
Abb. 3.6: Verteilung von Atγ-COP, AtSec23p, AtArf1p und AtSar1p sowie der Proteaseaktivität (auf Basis des Azocaseintests) in Ammoniumsulfatfraktionen des Cytosols aus Blumenkohl.
3.3.2 Atγ-COP und AtSec23p als Bestandteile von Proteinkomplexen
Sec21p und Sec23p in Hefezellen und ihre Homologen in Säugetieren sind Bestandteile von Proteinkomplexen (siehe Kap. 1.3.2 und Kap. 1.3.3). Um zu prüfen, ob Atγ-COP und AtSec23p im Cytosol von Pflanzen isoliert oder in Proteinkomplexen vorkommen, wurde eine Gelfilteration der cytosolischen Proteine aus Blumenkohlinfloreszenzen durchgeführt (siehe Kap. 2.2.3.2). Mit dieser Methode werden Proteine bzw. Proteinkomplexe aufgrund unterschiedlicher Größe getrennt und ihre Größe mit Hilfe der geeigneten Molekularmassen-marker geschätzt. Da vorher gezeigt worden war, dass die meisten Atγ-COP und Atsec23p einer Cytosolfraktion aus Blumenkohl mit 40 % Ammoniumsulfat gefällt werden können und die Proteaseaktivität in dieser Ammoniumsulfatfraktion im Vergleich zum Cytosol deutlich reduziert ist (siehe Kap. 3.3.1), wurde zunächst eine entsprechende Fällung durchgeführt. Die Proteine der so gewonnenen Fraktion wurden entsprechend ihrer Größe durch die Gelfiltration über eine Sepharose CL-6B-Säule aufgetrennt. Diese Säule hat einen Trennbereich von 10-4000 kDa. Die anschließende Western-Blot-Analyse zeigte, dass Atγ-COP in den Fraktionen 23 bis 30 eluiert wird (Abb. 3.7). Die größten Antigen-Mengen wurden dabei in den Fraktionen 26 und 27 nachgewiesen. Da Atγ-COP trotz seiner Molekularmasse von 100 kDa vor dem Molekularmassenmarker Thyroglobulin (669 kDa) eluiert wurde, deutet dieser Versuch darauf hin, dass dieses Protein ein Bestandteil eines Proteinkomplexes ist, der eine Molekularmasse von etwas über 669 kDa hat. AtSec23p mit einer Molekularmasse von 85 kDa wurde in den Fraktionen 27 bis 34 mit einem Peak bei den Fraktionen 30, 31 und 32 vor der β-Amylase (200 kDa) eluiert. Damit wurde gezeigt, dass AtSec23p auch als Bestandteil eines Proteinkomplexes mit der Molekularmasse von über 200 kDa in der Cytosolfraktion vorkommt. Das Ergebnis dieser Gelfiltrationschromatographie lässt darauf schließen, dass Atγ-COP und AtSec23p im Cytosol als Bestandteile verschiedener Proteinkomplexe vorliegen.
Abb. 3.7: Immunoblots der durch Gelfiltration über eine Sepharose CL-6B-Säule aufgetrennten Cytosolfraktionen. Atγ-COP wird vor Thyroglobulin und AtSec23p vor der β-Amylase eluiert.
Molekularmassenmarker: Th, Thyroglobulin (669 kDa); Ap, Apoferritin (443kDa); Am, β-Amylase (200 kDa) und BSA (66 kDa).
3.3.3 Neomycinfällung von Atγ-COP
Um zu verifizieren, dass Atγ-COP und AtSec23p als Bestandteile von zwei Proteinkomlexen mit verschiedenen Bindungseigenschaften vorkommen, wurden cytosolische Proteine mit Neomycin gefällt. Bestimmte aminoglykosylierte Antibiotika - wie Neomycin - bilden durch eine direkte Kreuzreaktion mit dem Coatomer aus Säugetieren und Hefe große Aggregate, die durch Zentrifugation aus der löslichen Phase getrennt werden können (Hudson und Draper, 1997). Alle diese Antibiotika besitzen in ihrer Struktur mindestens zwei Paare von benachbarten Aminogruppen, ähnlich wie die Struktur des di-Lysin-Signals, das an das Coatomer bindet. Es ist bekannt, dass das Coatomer aus Säugetieren zwei oder mehr Bindungsstellen für die benachbarten Aminogruppen hat (Hudson und Draper, 1997). Neomycin, das drei Paare von Aminogruppen hat, vernetzt durch Kreuzreaktion mit diesen Bindungsstellen das Coatomer. Um die Wechselwirkung des pflanzlichen Coatomers mit Neomycin zu untersuchen, wurden zu einer mit 40 % Ammoniumsulfat gewonnenen Cytosolfraktion aus Blumenkohl verschiedene Konzentrationen von Neomycin gegeben. Nach der Zentrifugation wurden die Überstände durch Western-Blotting analysiert (siehe Kap. 2.2.3.3). Atγ-COP konnte nach Zugabe von 1-10 mM Neomycin in der Cytosolfraktion (Überstand) nicht mehr nachgewiesen werden (Abb. 3.8). Im Vergleich dazu blieb AtSec23p unbeeinflusst von dieser Neomycinkonzentration im Cytosol (Überstand). Da vorher gezeigt worden war, dass Atγ-COP als ein Bestandteil eines Komplexes
im Cytosol vorkommt (siehe Kap. 3.3.2), kann man davon ausgehen, dass in diesem Fall der Proteinkomplex mit Neomycin präzipitiert wird. Dieser Versuch bestätigt das Ergebnis der Gelfiltration, dass Atγ-COP und AtSec23p Bestandteile verschiedener Proteinkomplexe sind.
Abb. 3.8: Selektive Fällung von Atγ-COP mit Neomycin. AtSec23p wird von Neomycin nicht präzipitiert.