Mit der Saccharosedichtegradientenzentrifugation wurde nachgewiesen, dass die Hüllproteine der pflanzlichen COP Vesikel sowohl in der ER/GApp-Fraktion als auch in einer Membranfraktion von hoher Dichte angereichert werden. Nun sollte mit Hilfe der Immunlokalisierung von COPI-Proteinen geklärt werden, mit welchen intrazellulären Strukturen diese Proteine assoziiert sind.
Dafür wurde zunächst versucht, COPI-Hüllproteine in den Zellen von Blumenkohlinfloreszenzen zu lokalisieren. Diese Zellen wurden nach einer Aldehyd-/Osmiumfixierung in Kunststoff (London Resin White) eingebettet und mit einem Ultramikrotom geschnitten. Mit keinem der Antikörper gegen Hüllproteine der pflanzlichen COPI Vesikel konnte eine signifikante Markierung innerhalb der Zellen beobachtet werden. Daher wurde mit Hilfe der Tokuyasu-Technik (Tokuyasu, 1980, 1986) versucht, eine bessere Lokalisierung der relevanten Proteine zu erreichen (siehe Kap. 2.9.2). Die Zellen werden hierbei lediglich nach einer leichten Aldehydfixierung mit einer Saccharoselösung infiltriert und anschließend eingefroren. Sie werden dann bei niedrigen Temperaturen, meist zwischen −95 und −120 °C geschnitten (siehe Kap. 2.9.3). Das heißt, es wird keine Entwässerung, die die Antigenizität vieler Proteine schwächen kann, und keine Einbettung in Kunststoff, die die Antigene teilweise maskiert, durchgeführt. Da die Antigene geschont werden, kann mit dieser Methode bei der Immunlokalisierung von Proteinen oft eine größere Markierungsdichte erreicht werden (van Bergen en Henegouwen, 1989). Für die Durchführung der Tokuyasu-Technik bei Pflanzenzellen sind die großen Unterschiede bezüglich der mechanischen Eigenschaften der gefrorenen, zellulären Kompartimente problematisch. Insbesondere Stärkekörner in Amyloplasten, Zellwände und Vakuolen beeinträchtigen die Herstellung von guten Kryoschnitten. Erste Immunmarkierungen der Blumenkohlinfloreszenzen wiesen zudem einen erheblichen unspezifischen Hintergrund auf. Mit dem Ausweichen auf Arabidopsis- bzw. Maiswurzelspitzen wurde das verhindert, da diese Gewebe vermutlich weniger glykolisierte Proteine enthalten.
Zudem erwies es sich als Vorteil, die Pflanzen zu bearbeiten, gegen deren Proteine die COPI-Antikörper gerichtet waren.
Zu Beginn der Immunogoldmarkierung der Kryoschnitte wurden die gewonnenen Antiseren gegen Hüllproteine der pflanzlichen COPI Vesikel verwendet. Dabei wurden zwar Dictyosomen markiert, allerdings wiesen auch Zellwände und Stärkekörner in Amyloplasten eine Markierung auf. Daher wurden Immunglobuline aller vorhandenen Antiseren über eine Protein A-Sepharose Säule aufgereinigt (siehe Kap. 2.7). Nach Immunogoldmarkierung der Kryoschnitte von Arabidopsis- und Maiswurzelspitzen mit den so gewonnenen Antikörpern war sowohl an den seitlichen Enden der Zisternen als auch in unmittelbarer Nähe am cis-, median- und trans-Bereich der Dictyosomen eine Markierung zu sehen (siehe Abb. 3.16, 3.17 und 3.18). Im Lumen der
Zisternen und im Cytoplasma konnten jedoch kaum Goldpartikel gefunden werden. Die Markierung in der Nähe der Zisternen fand sich oft an kleinen Vesikeln mit einem Durchmesser von etwa 60 nm, deren 10-15 nm dicke cytoplasmatische Proteinhülle im Elektronenmikroskop auffiel (siehe Abb. 3.16, 3.17 und 3.18). Die markierten Vesikel hatten eine sehr große Ähnlichkeit mit COP Vesikeln auf Kryoschnitten von Säugetierzellen (siehe z. B. Orci et al., 1997). Diese Vesikel waren eindeutig keine CCVs, die mit ihrer 25-30 nm dicken Proteinhülle im trans-Bereich der Dictyosomen zu sehen waren (Abb. 3.17 B). Sowohl CCVs als auch Schleimvesikel, die besonders in den Zellen der Maiswurzelhaube vorkommen (Mollenhauer und Morré, 1994), wurden mit den COP-Antikörpern nicht markiert (Abb. 3.16 B und 3.17 B). Das bestätigt die Vermutung, dass die mit den COP-Antikörpern markierten Vesikel pflanzliche COPI Vesikel sind, die somit in der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal nachgewiesen werden konnten. Die Lokalisierung von AtArf1p in Zellen der Maiswurzelspitzen führte zu einem vergleichbarem Ergebnis. Mit dem Antikörper gegen AtArf1p wurden Dictyosomen und die 60 nm großen COPI Vesikel markiert (Abb. 3.17 C, D). Damit konnten eindeutig zwei intrazelluläre Strukturen (GApp und COPI Vesikel) identifiziert werden, mit denen Hüllproteine der COPI Vesikel assoziiert sind. Deshalb kann angenommen werden, dass es sich bei dem zweiten Peak von Atγ-COP im Saccharosegradienten um die Membranen des GApp und beim dritten Peak um COPI Vesikel handelt.
Um eine genaue Zuordnung der pflanzlichen COPI-Hüllproteine bzw. COPI Vesikel zu den verschiedenen Bereichen des GApp treffen zu können, wurde eine statistische Analyse der Immunogoldmarkierungen durchgeführt. Dafür wurde die Verteilung der Goldpartikel anhand von 25 Dictyosomen für jede Markierung mit dem jeweiligen COPI-Antikörper ausgewertet.
Dabei wurden die Goldpartikel an den Zisternen und an den Vesikeln gezählt. Um eine Zuordnung der COPI Vesikel zum GApp zu gewährleisten, wurden ausschließlich Vesikel in die Statistik aufgenommen, die nicht weiter als 250 nm von einem Dictyosom entfernt waren. Cis-und trans-Bereich der Golgistapel wurden aufgrCis-und der zisternalen Cis-und der interzisternalen Breite unterschieden (siehe Kap. 1.2). Die Auszählung, deren Ergebnis in Tabelle 3.1 dargestellt ist, ergab eine ungleichmäßige Verteilung der Goldpartikel an den Zisternen sowie an den Vesikeln. Beim Vergleich der Markierung der Zisternen und Vesikel konnte festgestellt werden, dass durchschnittlich mehr als 80 % der Goldpartikel an COP Vesikeln in der Nähe der Zisternen zu finden waren. Die Markierung der Vesikel fand sich überwiegend in der Nähe des cis-Bereichs der Dictyosomen. Alle Zisternen der Dictyosomen zeigten eine Immunogoldmarkierung. In diesem Fall waren auch die cis-Zisternen stärker als andere Zisternen und das TGN markiert. Die Hüllproteine der COPI Vesikel waren also in den untersuchten Pflanzenzellen sowie in Säugetierzellen (Oprins et al., 1993) hauptsächlich im cis-Bereich der Dictyosomen lokalisiert.
Abb. 3.16: Immunogoldmarkierung auf Kryoschnitten von Maiswurzelspitzen mit dem Antikörper gegen Atγ-COP. A) Markierung der Dictyosomen und der COPI Vesikel. Pfeilspitzen deuten auf markierte COPI Vesikel. B) Schleimvesikel (SV) sind im Gegensatz zu den COPI Vesikeln nicht markiert. c, t = cis- und trans-Bereich der Golgistapel; Strichlänge 100 nm.
Abb. 3.17: Immunogoldmarkierung auf Kryoschnitten von Maiswurzelspitzen mit den Antikörpern gegen Zm-δ-COP (A), Zm-ε-COP (B) und AtArf1p (C und D). Pfeilspitzen deuten auf markierte COPI Vesikel, Pfeile auf CCVs. c, t = cis- und trans-Bereich der Golgistapel.
Strichlänge 100 nm.
Abb. 3.18: Immunogoldmarkierung auf Kryoschnitten von Arabidopsiswurzelspitzen mit den Antikörpern gegen Atγ-COP (A), Zm-δ-COP (B) und Zm-ε-COP (C). Pfeilspitzen deuten auf markierte COPI Vesikel. c, t = cis- und trans-Bereich der Golgistapel. Strichlänge 100 nm.
Tabelle 3.1: Verteilung der Immunogoldmarkierung mit Antikörpern gegen pflanzliche COPI Vesikel an Dictyosomen auf Kryoschnitten von Arabidopsis- und Maiswurzelspitzen. Für jeden Antikörper wurde die Verteilung der Goldpartikel an 25 Dictyosomen ausgezählt.
Goldpartikel an Zisternen Goldpartikel an