3.1.1 Bakterienstämme
Es wurde eine institutseigene Stammsammlung von probiotischen Mikroorganismen angelegt (siehe Anh.: 9.5).
Sie beinhaltete sowohl Stämme, die von anderen Instituten zur Verfügung gestellt wurden, der Kultursammlung der ATCC (American TypeCulture Collection, Rockville, MD, USA), der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland) und der LMG (Laboratorium voor Microbiologie, Gent, Belgien) als auch Eigenisolate. Letztere wurden aus fermentierten Milchprodukten und pharmazeutischen Präparaten gewonnen. Es wurden 10 Stämme der Gattung Lactobacillus, 7 Stämme der Gattung Bifidobacterium und 1 Stamm der Spezies E. coli verwendet. Die Stämme mit Stammhaltungsnummer und ihre Herkunft sind in Tabelle 15 aufgelistet.
3MATERIAL UND METHODE 52
. = Bifidobacterium3) Wien = Universität für Bodenkultur
1) Spezies2) SubspeziesErhalten von3)Synonym Ursprung B.animalisWien DSM 20105, ATCC 27536,Hühnerfaeces B.bifidumT Wien DSM 20456, ATCC 29521 Kot gestillter Säuglinge B.breveT Wien ATCC 15700,Darm, adult B.infantisWien DSM 20088, ATCC 15697 Darm, adult B.lactisWien BB 12 fermentiertes Milchprodukt B.longumTWien DSM 20219, ATCC 15707 Darm, adult B.longumWien BB 536 fermentiertes Milchprodukt L.acidophilusT Wien DSM 20079, ATCC 4356 Human L.acidophilusWien La 74-2 fermentiertes Milchprodukt L.caseiT Wien DSM 20011, ATCC 393 Käse L.caseiparacaseiWien Hansen 01 fermentiertes Milchprodukt L.delbrueckii bulgaricusT Wien DSM 20081, ATCC 11842 fermentiertes Milchprodukt L.johnsoniiT Wien DSM 10533, ATCC 33200 humanes Blut L.paracaseiEigenisolatL. casei Shirota fermentiertes Getränk L.paracaseitoleransTWien DSM 20258, ATCC 25599 pasteurisierte Milch L.reuteriT Wien DSM 20016, ATCC 23272 Darm, adult, Hum L.rhamnosusT Wien DSM 20021, ATCC 7469 nicht bekannt E.coliEigenisolatE. coli Nissle 1917 Darm, adult . = Lactobacillus Gregor-Mendel-Str. 33 . = Escherichia A-1180 Wien
Eingesetzte Bakterienstämme = Typstamm
3.1.2 Produkte
3.1.2.1 Milchmischerzeugnisse
Neben den in Reinkultur vorliegenden Bakterienstämmen der Stammsammlung wurden auch direkt aus Produkten isolierte Bakterien untersucht. Bei dem Großteil der mit probiotischen Bakterien versetzten Nahrungsmittel handelt es sich um fermentierte Milchprodukte, die sowohl in fester als auch in flüssiger Form und mit verschiedenen Fettgehaltsstufen im Handel sind. Enthalten sind laut Deklaration teils probiotische Monokulturen, teils neben den eingesetzten probiotischen Stämmen auch normale Joghurtstarterkulturen.
Produkt 1, 2, 3, 4 und 5 wurden zur Vitalitätsbestimmung im FACS genutzt, während Produkt 1, 2, 5, 7, 8, 9 und 10 in einem weiteren Versuch zusätzlich quantitativ untersucht wurden.
Parallel dazu wurde für jedes Produkt die Keimzahl mittels Oberflächenspatelverfahren (OSV) bestimmt. Eine Übersicht der untersuchten Milchmischerzeugnisse und ausgelobten Bakterien bietet Tabelle 16.
Tabelle 16: Milchmischerzeugnisse und deklarierte Bakterien
Nr. Deklaration als deklarierte Bakterien Fett %
1 Joghurt mild L.LC1 3,5
2 Probiotischer Joghurt-Drink L. casei defensis 1,6
3 Joghurt mild L. acidophilus
Bifidobacterium
3,7
4 Probiotischer Joghurt L .casei 1,8
5 Fermentiertes Milchgetränk B. breve < 0,1
6 Joghurt mit spez. Bulgaricus-Kulturen
9 Joghurt mit probiotischen Kulturen
B. lactis BB12 L. acidophilus LA5
1,6
10 Probiotischer Joghurt-Drink B. lactis BB12 L. acidophilus LA5
1,7
3.1.2.2 Andere Produkte
Außer Milchmischerzeugnissen werden auch zunehmend andere Produkte mit probiotischen Bakterien versehen. Dazu zählen verschiedene Arzneimittel, aber auch Kaugummi, Tropfen und Tabletten, in denen wahlweise eine Reinkultur (z.B. E. coli Nissle 1917, Produkt Nr. 11) oder auch Kombinationen aus verschiedenen probiotischen Bakterien (L. acidophilus, L. paracasei, L. salivarius, B. bifidum, B. lactis, Lc. lactis, Produkt Nr.13) eingesetzt werden.
Tabelle 17 gibt einen Überblick über die untersuchten Produkte, die keine Milchmischerzeugnisse sind.
Tabelle 17: Probiotische Produkte ohne Milchzusatz und deklarierte Bakterien Nr. Deklaration als deklarierte Bakterien Sonstiges
11 mikrobielles Arzneimittel E. coli Nissle 1917 Ampulle 12 mikrobielles Arzneimittel E. coli Nissle 1917 Hartkapsel,
pulvergefüllt 13 Nahrungsergänzungsmittel L. acidophilus, L. paracasei,
L. salivarius, B. bifidum, B. lactis, Lactococcus lactis
Pulver
3.1.3 Nährmedien
Zur Anzucht der verschiedenen Spezies kamen unterschiedliche Medien zum Einsatz.
In MRS-Bouillon und auf MRS-Agar wurden Laktobazillen angezüchtet, zur näheren Identifizierung und bei Mischkulturen wurden MRS-V (MRS-Agar mit Vancomycin, [SAXELIN 1996]) und X-Glu (Chromogener Agar mit 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-ß-D-Glucopyranoside, [KNEIFEL et al. 1993]) eingesetzt. Der Einsatz von MRS-V erlaubte eine Identifizierung von L. casei, X-Glu von L. acidophilus.
Zur Anzucht von Bifidobakterien diente RCM-Bouillon und RCM–Agar sowie MUP (RCM mit Mupirocin, [KOPEINIG et al. 2002]) als Selektiv-Agar.
M 17 Agar diente zur Anzucht von Streptokokken, insbesondere S. thermophilus.
E. coli wurden auf PC-Agar angezüchtet. Eingesetzte Nährmedien und das Wachstum der verschiedenen Spezies sind Tabelle 18 zu entnehmen.
Tabelle 18: Nährböden und Bouillon zur Bakterienanzucht
1) Oxoid = Hampshire, England
Medium Hersteller1) nachgewiesene Bakterien
MRS- Bouillon Oxoid (CM0359) Lactobacillus spp.
MRS-Agar Oxoid (CM0361) Lactobacillus spp.
MRS-V-Agar Eigene Herstellung
(nach SAXELIN 1996) L. casei MUP-Agar Eigene Herstellung
(nach KOPEINIG et al. 2002) Bifidobacterium spp.
M 17-Agar Oxoid (CM0785) S. thermophilus
Plate Count Agar Oxoid (CM0325) E. coli
RCM-Bouillon Difco (218081) Bifidobacterium spp.
X-Glu-Agar Eigene Herstellung
(nach KNEIFEL et al. 1993) L. acidophilus
Difco = Becton-Dickinson, Heidelberg- Wieblingen
Eine detaillierte Beschreibung und Zusammensetzung der Nährmedien ist im Anhang aufgelistet (Anh.: 9.1).
3.1.4 Durchflusszytometrie
Eingesetzt wurde ein Fluoreszenz-Durchflusszytometer, Modell FACSCalibur® (Becton Dickinson, Heidelberg) mit angeschlossener Computereinheit.
Als Farbstoffe zur Unterscheidung zwischen toten und vitalen Bakterienzellen wurden 3 Substanzen (SYTO®9, TO-PRO®-3, PJ) eingesetzt.
SYTO®9 ist ein grüner DNA-Farbstoff mit einer Anregung bei 488 nm und einer Emission bei 500 nm, der sowohl tote als auch lebende Bakterien anfärbt und besonders gut in Kanal Fl-2 und Fl-3 sichtbar ist.
TO-PRO®-3 ist ein roter DNA-Totfarbstoff, der von allen Zellen aufgenommen wird, aber nur in toten Zellen mit geschädigter Membran bestehen bleibt. TO-PRO®-3 wird bei 640 nm angeregt, emittiert bei 660 nm und ist in Fl-4 sichtbar.
PJ ist ein ebenfalls rot fluoreszierender DNA-Totfarbstoff (Anregungswellenlänge bei ca. 535 nm, Emission bei ca. 617 nm), der nur defekte Zellen anfärbt und in Fluoreszenz-kanal 3 ausgewertet wird.
Zur Quantifizierung wurden Beads (PeakFlow™Orange flow cytometry reference beads 2,5 μm, 1,2 x 108) zugegeben. Diese aus Polystyrol bestehenden Mikrosphären haben eine Absorption von 570 nm und eine Emission von 575 nm, der Fluoreszenzfarbstoff ist in den Partikel eingebracht. Im Lösungsmedium sind Aqua dest., 0,05 Tween£20 und 2 mM Salzsäure enthalten, so dass die Beads in ein genügend großes Probenvolumen eingebracht werden müssen, um Wechselwirkungen mit den Bakterien zu vermeiden.
Eine Liste der verwendeten Reagenzien befindet sich im Anhang (Anh.: 9.2).
3.1.5 Technische Geräte
Eine detaillierte Auflistung der technischen Geräte, Glas- und Einmalartikel befindet sich im Anhang (Anh.: 9.2.3).