3 Eigene Untersuchungen
3.1 Material und Methoden
3.1.10 Probenentnahme
Kotsammlung in den Versuchen 1, 2, 3 und 6
Die Kotsammlung erfolgte jeweils um 10:00 Uhr morgens durch eine vollständige Sammlung der Kotmengen aus den Boxen und einer gründlichen Reinigung der Metallsiebe unter den Boxen. Die Faeces wurden anschließend ausgewogen und sofort bei -20 °C bis zur Verarbeitung gelagert.
Die Kotproben wurden auf folgende Parameter untersucht:
• uS-Menge (g)
• TS-Menge (g)
• TS-Gehalt (% der uS)
• Rohnährstoffe (g/kg TS)
• Chromoxid (g/kg TS)
• C15 (g/kg TS)
• C17 (g/kg TS)
„Frischkotsammlung“ im Versuch 3 und Gewinnung der Blutproben (Versuche 1, 2, 3, 5) Die Tiere wurden am letzten Tag der Kotsammlung mit einer Injektionsnarkose14 90 Min. und 210 Min. nach der Fütterung narkotisiert. Es erfolgte dann die Gewinnung der Blutproben durch Punktion der Vena jugularis. Anschließend wurden Kotproben direkt aus dem Rektum entnommen.
Bei den Kontrolltieren erfolgte die Einleitung der Narkose und die Blutentnahme zu den Zeitpunkten: 0, 90, 210, 270 und 330 Min. nach Angebot und Aufnahme des Futters.
Die Proben wurden auf folgende Parameter untersucht:
Kot
• TS-Gehalt (% der uS)
• pH-Wert
Blut
• Triglyceride (mmol/l)
• freie Fettsäuren (µmol/l)
• Vit. E15(µg/ml) Chymussammlung
Die Sammlung des gesamten Chymus erfolgte ppr. über einen Zeitraum von 12 Stunden (7:45 bis 19:45). Hierzu wurde die ileocaecalen Umleitungsfistel sofort nach der Fütterung geöffnet. Die caecale Öffnung ließ sich durch eine kleine Metallkappe verschließen, wohingegen an der ilealen Öffnung ein Auffangbehältnis befestigt wurde. Ein gekühltes Becherglas diente zur Aufbewahrung des gesammelten Chymus. Nach einem Zeitintervall von jeweils zwei Stunden erfolgte die Bestimmung des pH-Wertes und der Menge an
14 Kombinationsnarkose aus Dormicum® und Ketavet®
15 Nur bei Versuch 2 und folgenden Enzymzulagen: 0 Enzyme und 24 NN
ursprünglicher Substanz, bevor der Chymus in einem austarierten Schälchen bei -20 °C bis zur weiteren Verarbeitung gelagert wurde. Es wurden folgende Parameter bestimmt:
Alle zwei Stunden
• uS- Menge (g)
• pH-Wert
Je Sammlungsperiode (12 Stunden)
• TS-Menge (g)
• TS-Gehalt (% der uS)
• Rohnährstoffe (g/kg TS)
• Zucker (g/kg TS)
• Stärke (g/kg TS)
• Chromoxid (g/kg TS)
Nach jeder Sammelphase wurde die Menge an Natrium, Kalium und Chlor substituiert, welche die Tiere durch die Chymusentnahme verloren hatten. Hierzu wurden pro g entnommenen Chymus 1 ml einer wässrigen Lösung (2,05 g NaCl und 0,36 g HCl/l) in das Caecum infundiert.
Gewinnung der Blutproben für die Versuche 5 und 6
Die Gewinnung der Blutproben erfolgte unter Verwendung des Dauerkatheters, welche vor jeder Probenentnahme mit einer verdünnten Heparinlösung gespült wurden. Anschließend wurde ca. 1 ml Blut gewonnen und verworfen, wodurch eine Verdünnung der Probe sicher ausgeschlossen werden konnte. Die Blutentnahme erfolgte unter Verwendung von Serumröhrchen der Fa. Sarstedt. Für den Versuch 5 wurden 10 ml und für den Versuch 6 5 ml Blut entnommen. Nach jeder Blutentnahme wurde der Katheter mit der verdünnten Heparinlösung gefüllt, nur nach der letzten Blutentnahme kam die konzentrierte Heparinlösung zum Einsatz. Die Blutproben wurden auf folgende Parameter untersucht:
Versuch 5
• PABA (µg/dl)
Versuch 6
• C15 (mg/l)
• C17 (mg/l) 3.1.11 Probenvorbereitung
Kot
Die Kotproben wurden direkt nach der Sammlung gewogen und bei -20 °C eingefroren.
Nachdem am Ende der Kotsammlung alle Proben durchgefroren waren, wurden sie in austarierte Plastikschälchen eingewogen. Es folgte eine Gefriertrocknung über vier Tage.
Nach der Rückwaage der Proben bewährte sich der Grindomix® zum Vermahlen der Proben zu einem Pulver. Aus jeder Tagesprobe ließ sich der TS-Gehalt bestimmen, so war die
genutzt wurde. Beim MB-Test (Versuch 6) erfolgte die Bestimmung der C15 und C17 in den Tageskotproben.
In den rektal entnommenen Kotproben wurde der TS-Gehalte und der pH-Wert ermittelt. Vor der Messung des pH-Wertes wurde der Kot in einem Verhältnis von 1:5 mit destilliertem Wasser vermengt.
Chymus
Der jeweils innerhalb der zweistündigen Sammelperiode gewonnene Chymus wurde mit einem Glasstab homogenisiert und der pH-Wert ermittelt. Anschließend kam der Chymus in ein austariertes Plastikschälchen und wurde bei -20 °C eingefroren. Am Ende der Sammlung erfolgte die Gefriertrocknung der Proben über drei Tage. Jede einzelne Tagesprobe wurde gemahlen, der Chromoxidgehalt und der TS-Gehalt bestimmt und ein Aliquot angefertigt.
Dieses Aliquot konnte dann für die Weender Analyse genutzt werden sowie für die Bestimmung von Zucker, Stärke und Chromoxid.
Blutproben
• Triglyceride und freie Fettsäuren
Nach der Gewinnung der Blutproben wurden diese zur Serumgewinnung bei 3500 U/min (~3000 gZ) zentrifugiert. Anschließend erfolgte die Lagerung der Serumproben bei -20 °C in 2 ml Reagiergefäße der Fa. Sarstedt. Durch die Verwendung des Testsatzes Nobi Flow Triglyceride-GPO® (Firma Labordiagnostica GmbH) ließ sich der Gehalt an Triglyceriden im Serum bestimmen. Die Bestimmung der freien Fettsäuren erfolgte im klinischen Labor der Klinik für Rinderkrankheiten der Tierärztlichen Hochschule Hannover.
• C15 und C17
Die Blutproben wurden bei 3500 U/min (~3000 gZ) zentrifugiert. Auch hier wurde das Serum abpipetiert und bei -20 °C in 2 ml Reagiergefäße der Fa. Sarstedt gelagert. Die Bestimmung von C15 und C17 erfolgte in Anlehnung an LEPAGE und ROY (1986) gaschromatographisch.
• PABA
Die Blutproben wurden bei 4000 U/min (~3776 gZ) zentrifugiert, anschließend erfolgte die Lagerung des gewonnenen Serums bei -20 °C. Zur Bestimmung der Parameter diente die BRATTON-MARSHALL-Methode (1939) in Anlehnung an LANKISCH et al. (1986).
3.1.12 Vorversuche zur Durchführung des NBT-PABA-Tests beim Schwein
Dieser Vorversuch war notwendig, da dieser Test bisher noch nicht beim Schwein angewendet wurde und daher keine Informationen über Resorption und Elimination der Testsubstanzen beim Schwein vorlagen. Des Weiteren musste der Einfluss einer Enzymsupplementierung vor Testbeginn untersucht sowie eine geeignete Futterration ausgewählt werden.
• Versuchstiere
Für die Untersuchung zur Überprüfung der Anwendbarkeit des NBT-PABA-Tests beim Schwein standen zwei Minischweine (Tier 1 und 2) des Instituts für Tierernährung der Tierärztlichen Hochschule Hannover zur Verfügung. Die Tiere dienten als Kontrolltiere.
Für die Vorversuche zur Auswahl einer geeigneten Futterzubereitung stand ein Minischwein (Tier 66) der Zuchtlinie Ellegaard als Kontrolltier mit Dauervenenkatheter zur Verfügung.
Um die Belastung der Tiere durch ein Aussetzen der Enzymzulage möglichst gering zu halten, wurde durch zwei Versuchsansätze überprüft, ob das Aussetzen der Enzymzulage drei Tage vor Testbeginn nötig ist. Diese Untersuchung wurde an vier Minischweinen (Tier 71, 72, 74, 75) der Zuchtlinie Ellegaard durchgeführt (s. Tabelle 26).
Tabelle 26: Übersicht zu den Versuchstieren im Vorversuch für den NBT-PABA-Test
Tier-Nr. Ø Körpermasse (kg) Geschlecht PL Venenkatheter Proben-Material
1 16,0 m - - Harn
2 16,0 m - - Harn
66 33,4 w - + Blut
71 30,7 w + + Blut
72 30,0 w + + Blut
74 26,7 w + + Blut
75 28,7 w + + Blut
• Aufstallung und Haltung
Zu Versuchsbeginn wurden die zwei Tiere (Tier 1 und 2) in ca. 0,96 m2 große Stoffwechselkäfige eingestallt. Durch Tröge am vorderen Ende der Käfige hatten die Tiere ständig freien Zugang zum Wasser. In diesen Trögen wurde den Tieren auch das Futter angeboten. Die Belichtungsdauer betrug 10 Stunden, von 6:00 bis 16:00. Die Aufstallung und Haltung der Tiere 66, 71, 72, 74 und 75 erfolgte wie unter Punkt 3.1.5 beschrieben.
• Versuchsfutter
Die Tiere bekamen in der Phase der Harnsammlung jeweils 125 g VF um 8:00 und 20:00 zugeteilt. Am ersten Versuchstag erfolgte die Zuteilung des Futters incl. 0,475 g NBT-PABA bzw. 0,147 g PABA erst nachdem eine Harnprobe als Nullwert gewonnen werden konnte. Um eine geeignete Futterration für den NBT-PABA-Test zu finden, wurden drei Rationen getestet:
1. 250 g VF 2. 125 g VF
3. 500 ml Fresubin diabetes® (Zusammensetzung: s. Punkt 3.1.6)
Die Untersuchungen für die Notwendigkeit der Unterbrechung der Enzymsupplementierung vor Testbeginn wurden mit 500 ml Fresubin diabetes® durchgeführt.
• Versuchsplan
Nach der Gewinnung einer Harnprobe, die als Nullwert verwendet wurde, erhielten die Tiere das Versuchsfutter incl. 0,457 g NBT-PABA bzw. 0,147 g PABA. Die Testdauer betrug drei Tage (s. Tabelle 27).
Tabelle 27: Versuchsdurchführung Vorversuch PABA-Test
Tier Versuchsfutter Testsubstanz Dosierung
1
2 NBT-PABA 0,475 g
1 2
125 g
PABA 0,147 g
Zur Ermittlung einer geeigneten Futterration wurde jeder Versuchsansatz mindestens zweimal getestet, wodurch gleichzeitig die Reproduzierbarkeit überprüft werden konnte. Das VF wurde am Morgen des Testtages mit 800 ml Wasser vermengt. Fresubin diabetes® ließ sich ohne Zugabe von Wasser verwenden. Nach Zugabe vom 1 g NBT-PABA, erfolgte die Zuteilung des Futters. Während des gesamten Versuches erfolgte immer eine vollständige Aufnahme der Futterzubereitungen.
Es wurden zwei Testansätze überprüft:
1. Ohne Unterbrechung der Enzymsupplementierung vor Testbeginn erhielten die Tiere am Morgen des Testtages 500 ml Fresubin diabetes® sowie 1 g NBT-PABA.
2. Nachdem die Enzymsupplementierung drei Tage vor Testbeginn ausgesetzt wurde, erhielten die Tiere am Morgen des Testtages 500 ml Fresubin diabetes® sowie 1 g NBT-PABA.
• Probenentnahme
Unter den Stoffwechselkäfigen waren Auffangbehältnisse angebracht, die eine vollständige Sammlung der Harnproben gewährleisteten.
Die Gewinnung der Blutproben erfolgte wie unter Punkt 3.1.10 beschrieben.
• Probenvorbereitung
Die Harnproben wurden in unregelmäßigen Abständen aus den Behältnissen entfernt, in Bechergläser umgefüllt und der pH-Wert gemessen. Für den späteren Nachweis der Testsubstanz erfolgte eine Verdünnung der Proben im Verhältnis 1:100 mit destilliertem Wasser. Die Proben wurden bei -20 °C bis zur weiteren Verarbeitung eingefroren.
Die Vorbereitung der Blutproben erfolgte wie unter Punkt 3.1.11 beschrieben.
Ergebnisse des Vorversuches
A) PABA-Wiederfindung im Harn beim Schwein
Der Vorversuch für die Anwendbarkeit des NBT-PABA Tests beim Schwein zeigte eine hohe Ausscheidung von PABA im Harn (s. Tabelle 28).
Die im Harn ermittelten pH-Werte blieben unbeeinflusst und sind dem Anhang zu entnehmen.
Da dem Schwein kein festes Trinkschema auferlegt werden konnte sowie auf die Verwendung von diuresefördernden Medikamenten oder die Anwendung einer erhöhten NaCl-Konzen-tration im Futter verzichtet werden sollte, erfolgte die Harnsammlung im Unterschied zum Menschen über drei Tage. Die Wiederfindungsrate im Harn wurde wie folgt berechnet:
)
Tabelle 28: PABA-Wiederfindung (%) im Harn
Tier Testsubstanz Wiederfindung
NBT-PABA 73,7 %
1 PABA 85,0%
NBT-PABA 83,6 %
2 PABA 68,8 %
Die ermittelten Wiederfindungsraten im Harn stimmen mit den erhobenen Daten beim Menschen von FETTES et al. (1978), FREISE und HOFMANN (1979), LANG et al. (1980) sowie von STROMBECK und HARROLD (1982) überein. Aufgrund dieser Ergebnisse kann davon ausgegangen werden, dass der Test auch beim Schwein anwendbar ist.
B) Bestimmung einer geeigneten Futterration
Bei der Untersuchung der drei unterschiedlichen Futterrationen erwies sich die Sonden-nahrung Fresubin diabetes® als am Besten geeignet. Zwar lag hier der Serumspiegel der PABA-Konzentration auf einem niedrigeren Niveau, die einzelnen Werte waren jedoch re-produzierbar und die Kinetik zeigte einen ruhigen und klaren Verlauf (s. Abbildung 8, 9 und 10). Bei Einsatz von 250 g Versuchsfutter konnte ein deutlicher Anstieg der PABA-Konzentrationen im Serum bei dem Kontrolltier in dem Zeitraum von 60 bis 120 Minuten beobachtet werden. Die Verwendung von 125 g VF erwies sich als ungünstig, da die Reproduzierbarkeit nicht gegeben war. Während am ersten Versuchstag in den ersten 60 Min.
ppr. das Maximum der PABA-Konzentration ermittelt werden konnte, war am zweiten Versuchstag ein nahezu konstanter Verlauf auf niedrigem Niveau zu beobachten. Im Unterschied dazu ließ sich am dritten Versuchstag ein Anstieg der PABA-Konzentration im Serum erst ab 120 Min. ppr. nachweisen. Dieser unterschiedliche Verlauf der PABA-Konzentration könnte durch die Magenentleerung bedingt sein. Obwohl GYR (1975) eine Beeinflussung des NBT-PABA-Tests durch die Magenentleerung nicht nachweisen konnte, schließt er wie auch WEIZMANN et al. (1985) eine solche Beeinflussung nicht aus. Die römischen Zahlen beziffern unterschiedliche Versuchstage.
250 g VF
0 100 200 300 400
30 60 120 180 240 300
Minuten
µg/dl
I II III
Abbildung 8: Entwicklung der PABA-Konzentration im Serum nach oraler Applikation von NBT-PABA (Tier 66)
125 g VF
0 100 200 300 400
30 60 120 180 240 300
Minuten
µg/dl
I II III
Abbildung 9: Entwicklung der PABA-Konzentration im Serum nach oraler Applikation von NBT-PABA (Tier 66)
500 ml Fd
0 100 200 300 400
30 60 120 180 240 300
Minuten
µg/dl
I II
Abbildung 10: Entwicklung der PABA-Konzentration im Serum nach oraler Applikation von NBT-PABA (Tier 66)
C) Einfluss einer Enzymzulage vor Testbeginn auf die PABA-Konzentration im Serum
Die PABA-Konzentrationen im Serum bei Pl-Tieren unterschieden sich, unabhängig vom Absetzen einer Enzymsupplementierung drei Tage vor Testbeginn, nach oraler Applikation von NBT-PABA nicht signifikant voneinander (s. Tabelle 29).
Tabelle 29: Entwicklung der PABA-Konzentrationen im Serum nach oraler Applikation von NBT-PABA bei Pl-Tieren ohne und mit Enzymzulage vor Testbeginn
Zeit 60 min. 120 min. 180 min. 240 min. 300 min. 360 min.
Pl-Tiere ohne Enzymsupplementierung vor Testbeginn
21,3 ± 6,98 a 10,2 ± 2,50 a 8,13 ± 3,98 a 8,35 ± 4,43 a 9,54 ± 4,81 a 12,7 ± 7,83 a Pl-Tiere mit Enzymsupplementierung vor Testbeginn
15,6 ± 6,06 a 12,2 ± 6,87 a 8,57 ± 10,8 a 11,2 ± 15,2 a 9,42 ± 15,6 a 15,9 ± 16,8 a Aufgrund dieser Ergebnisse fand während der NBT-PABA Versuche eine Enzymsupplemen-tierung bis zum Versuchsbeginn statt. Bei Testbeginn wurde je nach Versuchsplan eine isolierte orale Applikation von NBT-PABA oder eine in Kombination von NBT-PABA und der entsprechenden Enzymdosierung mit dem Futter Fresubin diabetes® getestet.
3.1.13 Vorversuche zur Durchführung des MB-Tests beim Schwein
Die Vorversuche für diesen MB-Test waren notwendig, da diese Methode bisher beim Schwein noch nicht durchgeführt wurde. Somit waren keine Kenntnisse, über die Resorption der Testsubstanzen, die Notwendigkeit des Aussetzens der Enzymsupplementierung vor Testbeginn sowie die optimale Futtertemperatur vorhanden.
• Versuchstiere
Für den Versuch standen acht Kontrolltiere und sieben pankreasgangligierte Göttinger Minischweine zur Verfügung. Bei den Tieren wurde die Ligatur des Pankreasganges und die Implantation des Katheters wie in Punkt 3.1.4 durchgeführt. Nähere Angaben zu den Tieren sind der Tabelle 2 zu entnehmen.
• Aufstallung und Haltung
Die Tiere wurde wie unter Punkt 3.1.5 beschrieben gehalten.
• Versuchsfutter
In diesem Versuchsabschnitt wurde die Notwendigkeit eines Aussetzens der Enzymsupplementierung vor Testbeginn oder einer Erwärmung des Futters überprüft.
Als Ration wurde Fresubin diabetes® verwendet, dessen Zusammensetzung den Tabellen 9, 10 und 11 zu entnehmen ist. Die Fütterung der Tiere erfolgte um 8:00 mit der Testmahlzeit Fresubin diabetes®, während die Tiere am Abend (20:00) mit 250 g Versuchsfutter gefüttert wurden.
• Versuchsplan
A) Es wurden zwei Ansätze untersucht:
1. Ohne eine Unterbrechung der Enzymsupplementierung vor Testbeginn erhielten die Tiere am Morgen des Testtages 500 ml Fresubin diabetes® (erwärmt) vermengt mit C15 und THA (s. Tabelle 30).
2. Nachdem die Enzymsupplementierung drei Tage vor Testbeginn ausgesetzt wurde, erhielten die Tiere am Morgen des Testtages 500 ml Fresubin diabetes® (erwärmt) mit C15 und THA vermengt (s. Tabelle 30).
Tabelle 30: Versuchsdurchführung im Vorversuch zur Anwendung des MB-Tests Tiergruppe n Enzymzulage vor Testbeginn
KT 4 -
Pl 3 -
Pl 3 +
B) Es wurden zwei Ansätze untersucht:
1. Den Tieren wurde am Morgen des Testtages die Sondennahrung Fresubin diabetes® bei Zimmertemperatur, vermengt mit der Testsubstanz (C15, THA), angeboten.
2. In einem weiteren Ansatz wurde das Futter vor der Fütterung auf 37 °C erwärmt. Die Testsubstanzen C15 und THA wurden in einem Wasserbad bei 70 °C geschmolzen und anschließend mit dem Futter vermengt. Das Futter wurde dann den Tieren in angewärmten Stahlnäpfen angeboten.
C) In einem weiteren Versuchsansatz wurde überprüft, ob eine Ausscheidung der Testsubstanz mit dem Kot beobachtet werden kann. Das Futter wurde in einem ersten Ansatz bei Zimmertemperatur und später in einem weiteren Ansatz erwärmt angeboten. Für diesen Versuchsansatz standen vier weitere Kontrolltiere (drei davon mit ileocaecaler Umleitungs-fistel) und drei pankreasgangligierte Tiere mit ileocaecaler Umleitungsfistel zur Verfügung.
Dem Futter wurde für diesen Versuchsansatz am Morgen des Testtages 2,5 g/kg Chromoxid
beigemengt. Die Enzymsupplementierung am Morgen des Testtages wurde je nach Fragestellung durchgeführt.
• Probenentnahme
Die Gewinnung der Blutproben und die Durchführung der Kotsammlung erfolgte wie unter Punkt 3.1.10 beschrieben.
• Probenvorbereitung
Die Probenvorbereitung erfolgte wie unter Punkt 3.1.11 beschrieben.
Ergebnisse des Vorversuches
A) Auswirkung einer Enzymzulage vor Testbeginn auf die Konzentration von C15/C17 im Serum bei Pl-Tieren
Nach oraler Applikation von C15 und THA mit dem Futter konnte unabhängig davon, ob die Enzymsupplementierung 72 oder lediglich 12 Stunden vor Testbeginn ausgesetzt wurde, ein annähernd paralleler Verlauf der Konzentrationen von C15 und C17 im Serum beobachtet werden (s. Abbildung 11). Nach Applikation des Triglycerides THA wurde die maximale Konzentration von C17 im Zeitraum 360 und 420 Min. ppr. ermittelt. Das Maximum der freien Fettsäure C15 konnte im Serum 240 und 300 Min. ppr. beobachtet werden, wobei ein erster deutlicher Anstieg bereits nach 120 Min. ppr. erfolgte.
C15
Abbildung 11: Entwicklung der Konzentrationen von C15 (oben) und C17 (unten) im Serum nach oraler Applikation von C15 und THA (Pl-Tiere ohne und mit Aussetzten der Enzymzulage vor Testbeginn)
Aufgrund dieser Ergebnisse wurde in den folgenden Versuchen zum MB-Test die Enzymsupplementierung vor Testbeginn nicht unterbrochen.
B) Auswirkung der Temperatur des Futters und der Testsubstanz auf das Resorptions-verhalten von C15/C17
Die Erwärmung des Futters hatte weder bei den Kontrolltieren noch bei den Pl-Tieren einen deutlichen Einfluss auf die Konzentration von C15 im Serum (s. Abbildung 12, 13). Nach Erwärmung des Futters und der Testsubstanzen konnte bei Kontrolltieren und Pl-Tieren ein Anstieg von C17 im Serum beobachtet werden. Bei den Kontrolltieren konnte ein signifikanter Anstieg ab 240 Minuten ppr. verzeichnet werden, während bei den Pl-Tieren lediglich ein tendenzieller Anstieg von C17 beobachtet werden konnte. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde das Futter in den folgenden Versuchen erwärmt angeboten.
C15
Warm C15 0,00 0,66 5,37 5,42 5,18 6,29 7,14 7,66 7,69 Kalt C15 1,15 1,22 3,45 4,49 4,27 5,11 5,53 4,63 4,88 0 60 120 180 240 300 360 420 480
Warm THA 4,56 3,97 4,66 5,75 6,55 8,10 10,26 10,41 10,78 Kalt THA 3,53 3,36 3,12 3,32 2,19 2,19 2,24 1,94 2,15
0 60 120 180 240 300 360 420 480 Abbildung 12: Entwicklung der Konzentrationen von C15 (oben) und C17 (unten) im Serum nach
oraler Applikation von C15 und THA (KT; unterschiedlich temperiertes Futter)
C15
PL Warm C15 1,12 2,39 9,01 7,08 13,8 11,8 11,1 8,21 5,21 Pl kalt C15 0,00 3,35 3,78 4,19 4,48 8,26 9,13 8,26 8,90
Pl Warm THA 4,23 2,54 3,26 3,03 5,45 6,97 9,59 8,33 8,71 Pl Kalt THA 1,36 1,40 1,59 1,07 0,39 2,16 2,58 2,44 1,62 0 60 120 180 240 300 360 420 480
Abbildung 13: Entwicklung der Konzentrationen von C15 (oben) und C17 (unten) im Serum nach oraler Applikation von C15 und THA (Pl-0 Tiere; unterschiedlich temperiertes Futter)
C) Bestimmung der Konzentration von C15 und C17 im Kot
Durch die Erwärmung des Futters konnten keine signifikanten Veränderungen der Wiederfindung von C15 und C17 im Kot beobachtet werden; tendenziell war die Konzentration von C15 im Kot nach Erwärmung geringer (s. Abbildung 14, 15). Die beobachtete Wiederfindung von C17 über 100 % wird später näher erläutert.
0
KT kaltes Futter KT warmes Futter Pl kaltes Futter ohne Enzyme Pl kaltes Futter + 24 N Pl warmes Futter ohne Enzyme Pl warmes Futter + 24 N
a a
a
a
a
a
0 50 100 150 200 250
C17
% Wiederfindung
KT kaltes Futter KT warmes Futter Pl kaltes Futter ohne Enzyme Pl kaltes Futter + 24 N Pl warmes Futter ohne Enzyme Pl warmes Futter + 24 N
a a a
a a
a
Abbildung 15: Wiederfindung (%) von C17 im Kot vom Schwein nach oraler Applikation von THA (unterschiedlich temperiertes Futter; KT; Pl-Tieren ohne/mit Enzymzulage)
3.1.14 Angewandte Untersuchungsmethoden pH-Wert
Die Messung des Wertes wurde in den Kot- und Chymusproben mit einem digitalen pH-Meter (Firma Knick) durchgeführt.
Rohnährstoffe
Die Bestimmung der Rohnährstoffe erfolgte mittels Weender Futtermittelanalyse nach den Vorschriften der VDLUFA in der Fassung von NAUMANN und BASSLER (1997).
• Trockensubstanzgehalt (TS-Gehalt) der Kot- und Chymusproben:
Die Proben wurden als ursprüngliche Substanz (uS) gewogen, in einer Gefriertrocknungsanlage dehydriert und erneut gewogen. Das gefriergetrocknete Material wurde durch eine 12-stündige Trocknung in einem Trockenschrank bei 103 °C nachgetrocknet und der TS-Gehalt über die Gewichtsdifferenz bestimmt.
• Rohasche (Ra):
Der Gehalt der Rohasche ließ sich durch die Gewichtsdifferenz nach einer Veraschungszeit von 12 Stunden bei 550 °C im Muffelofen ermitteln.
• Rohprotein (Rp):
Die Erfassung des Rohproteingehaltes erfolgte durch Aufschluss des Probenmaterials mit konzentrierter Schwefelsäure (95-97 %) und Überführen des Stickstoffs in Ammoniumsulfat.
Durch Zugabe von 30 %iger Natronlauge wurde Ammoniak freigesetzt und in 2 %ige Borsäure überführt.
Die Menge des entstandenen Ammoniaks wurde mittels Titration mit 0,3 molarer Salzsäure bestimmt. Der Rohproteingehalt wurde dann über folgende Formel berechnet:
Rp = N * 6,25
• Rohfett (Rfe)
Das Fett wurde durch Kochen mit konzentrierter Salzsäure aufgeschlossen. Im weiteren Verlauf erfolgte eine Fettextraktion mit Petroläther im Soxhletapparat. Anschließend wurde mittels eines Rotationsverdampfers der Petroläther abdestilliert und der Fettgehalt durch Rückwaage rechnerisch ermittelt.
• Rohfaser (Rfa)
Zunächst erfolgte eine Vorentfettung der Proben unter Verwendung von Petroläther.
Anschließend wurden die Proben jeweils mit siedender 5 %iger Schwefelsäure und siedender 5 %iger Natronlauge je 30 min gekocht. Der Rückstand wurde gewaschen, getrocknet und gewogen und bei einer Temperatur von 500 °C im Muffelofen verascht. Der beim Veraschen auftretende Massenverlust entspricht dem Rohfasergehalt der Probe.
• Stärke
Die Bestimmung des Stärkegehaltes erfolgte nach den Vorschriften der VDLUFA. In einer ersten Bestimmung wurde das Probenmaterial mit einer verdünnten Salzsäure einer Säurehydrolyse unterzogen. Der folgende Schritt bestand aus der Klärung, Filtrierung und polarimetrischen Messung der Lösung.
Im zweiten Schritt erfolgte die Bestimmung eines Blindwertes. Hierfür wurde die Probe mit 40 %igen Ethanol extrahiert und anschließend eine Säurehydrolyse durchgeführt. Auch hier wurde die Lösung geklärt, filtriert und polarimetrisch gemessen.
Die Ermittlung des Stärkegehaltes der Probe erfolgte rechnerisch über die Differenz der Ergebnisse.
• Zucker
Die Bestimmung des Zuckers erfolgte ebenfalls nach den Vorschriften der VDLUFA. Durch die Reduktion des Kupfer(II) Salzes mit dem Invertzucker zu Kupfer(I)-oxid konnte mittels iodometrischer Titration des nicht verbrauchten Kupfers auf den Zuckergehalt der Probe geschlossen werden.
• Chromoxid
Die Methode von PETRY und RAPP (1970) diente der Ermittlung des Chromoxidgehaltes.
Anhand eines Oxidationsgemisches aus Schwefelsäure, Perchlorsäure und Natriummolybdat erfolgte die Überführung des in der Probe vorhandenen Chromoxids während einer Nassveraschung in Chromat. Durch Natronlauge wurde die Probe alkalisiert. Mittels einer anschließenden photometrischen Messung bei 365 nm konnte die Extinktion bestimmt und der Chromgehalt errechnet werden.
• Organische Substanz (oS) und Stickstofffreie Extraktstoffe (NfE)
Diese beiden Parameter wurden rein rechnerisch nach folgenden Formeln bestimmt:
oS = TS - Ra
NfE = TS – (Ra + Rp + Rfe + Rfa)
• PABA
Die Bestimmung des Paraaminobenzoesäuregehaltes im Serum und im Harn erfolgte nach der
Die Bestimmung des Paraaminobenzoesäuregehaltes im Serum und im Harn erfolgte nach der