3 Eigene Untersuchungen
3.1 Material und Methoden
3.1.14 Angewandte Untersuchungsmethoden
Die Messung des Wertes wurde in den Kot- und Chymusproben mit einem digitalen pH-Meter (Firma Knick) durchgeführt.
Rohnährstoffe
Die Bestimmung der Rohnährstoffe erfolgte mittels Weender Futtermittelanalyse nach den Vorschriften der VDLUFA in der Fassung von NAUMANN und BASSLER (1997).
• Trockensubstanzgehalt (TS-Gehalt) der Kot- und Chymusproben:
Die Proben wurden als ursprüngliche Substanz (uS) gewogen, in einer Gefriertrocknungsanlage dehydriert und erneut gewogen. Das gefriergetrocknete Material wurde durch eine 12-stündige Trocknung in einem Trockenschrank bei 103 °C nachgetrocknet und der TS-Gehalt über die Gewichtsdifferenz bestimmt.
• Rohasche (Ra):
Der Gehalt der Rohasche ließ sich durch die Gewichtsdifferenz nach einer Veraschungszeit von 12 Stunden bei 550 °C im Muffelofen ermitteln.
• Rohprotein (Rp):
Die Erfassung des Rohproteingehaltes erfolgte durch Aufschluss des Probenmaterials mit konzentrierter Schwefelsäure (95-97 %) und Überführen des Stickstoffs in Ammoniumsulfat.
Durch Zugabe von 30 %iger Natronlauge wurde Ammoniak freigesetzt und in 2 %ige Borsäure überführt.
Die Menge des entstandenen Ammoniaks wurde mittels Titration mit 0,3 molarer Salzsäure bestimmt. Der Rohproteingehalt wurde dann über folgende Formel berechnet:
Rp = N * 6,25
• Rohfett (Rfe)
Das Fett wurde durch Kochen mit konzentrierter Salzsäure aufgeschlossen. Im weiteren Verlauf erfolgte eine Fettextraktion mit Petroläther im Soxhletapparat. Anschließend wurde mittels eines Rotationsverdampfers der Petroläther abdestilliert und der Fettgehalt durch Rückwaage rechnerisch ermittelt.
• Rohfaser (Rfa)
Zunächst erfolgte eine Vorentfettung der Proben unter Verwendung von Petroläther.
Anschließend wurden die Proben jeweils mit siedender 5 %iger Schwefelsäure und siedender 5 %iger Natronlauge je 30 min gekocht. Der Rückstand wurde gewaschen, getrocknet und gewogen und bei einer Temperatur von 500 °C im Muffelofen verascht. Der beim Veraschen auftretende Massenverlust entspricht dem Rohfasergehalt der Probe.
• Stärke
Die Bestimmung des Stärkegehaltes erfolgte nach den Vorschriften der VDLUFA. In einer ersten Bestimmung wurde das Probenmaterial mit einer verdünnten Salzsäure einer Säurehydrolyse unterzogen. Der folgende Schritt bestand aus der Klärung, Filtrierung und polarimetrischen Messung der Lösung.
Im zweiten Schritt erfolgte die Bestimmung eines Blindwertes. Hierfür wurde die Probe mit 40 %igen Ethanol extrahiert und anschließend eine Säurehydrolyse durchgeführt. Auch hier wurde die Lösung geklärt, filtriert und polarimetrisch gemessen.
Die Ermittlung des Stärkegehaltes der Probe erfolgte rechnerisch über die Differenz der Ergebnisse.
• Zucker
Die Bestimmung des Zuckers erfolgte ebenfalls nach den Vorschriften der VDLUFA. Durch die Reduktion des Kupfer(II) Salzes mit dem Invertzucker zu Kupfer(I)-oxid konnte mittels iodometrischer Titration des nicht verbrauchten Kupfers auf den Zuckergehalt der Probe geschlossen werden.
• Chromoxid
Die Methode von PETRY und RAPP (1970) diente der Ermittlung des Chromoxidgehaltes.
Anhand eines Oxidationsgemisches aus Schwefelsäure, Perchlorsäure und Natriummolybdat erfolgte die Überführung des in der Probe vorhandenen Chromoxids während einer Nassveraschung in Chromat. Durch Natronlauge wurde die Probe alkalisiert. Mittels einer anschließenden photometrischen Messung bei 365 nm konnte die Extinktion bestimmt und der Chromgehalt errechnet werden.
• Organische Substanz (oS) und Stickstofffreie Extraktstoffe (NfE)
Diese beiden Parameter wurden rein rechnerisch nach folgenden Formeln bestimmt:
oS = TS - Ra
NfE = TS – (Ra + Rp + Rfe + Rfa)
• PABA
Die Bestimmung des Paraaminobenzoesäuregehaltes im Serum und im Harn erfolgte nach der BRATTON-MARSCHALL-Methode (1939) modifiziert nach SMITH et al. (1945), BORNSCHEIN (1977) und LANKISCH et al. (1986), die hier leicht modifiziert wurde. Die Berechnung der PABA-Konzentration erfolgte in Anlehnung an KRAFT und DÜRR (1999).
Das Prinzip der Methode beruht auf der Reaktion von PABA und aller anderen 4-Amino-benzolderivate in saurer Lösung mit Nitrit zu Diazoniumsalzen. Überschüssiges Nitrit wird durch die Zugabe von Ammoniumsulfamat zerstört. Durch die Zugabe von N-Naphthyl-Äthylendiamin kommt es zu einer Verbindung der beiden Substanzen und es entsteht ein fliederfarbener Azofarbstoff, der photometrisch bei 546 nm gemessen werden kann (MÜLLER et al. 1984). Die Harnproben wurden zuvor in einem Verhältnis von 1:100 mit destilliertem Wasser verdünnt (THIENHAUS u. NIEDERAU 1979). Die Durchführung ist in Abbildung 16 schematisch dargestellt.
Abbildung 16: Schematische Darstellung des PABA-Nachweises im Serum
Der Standard wurde folgendermaßen angesetzt:
Eine Stammlösung mit 600 mg PABA in 100 ml 15 %ige Trichloressigsäure wurde auf die Gebrauchslösung von 150 µg/100 ml 15 % Trichloressigsäure verdünnt.
Auswertung:
Von jeder Probe wurden Doppelproben angesetzt. Die Bestimmungen wurden wiederholt, wenn die Extinktionen mehr als 0,02 differierten. Der gebildete Mittelwert aus beiden Extinktionen diente für die Berechnung der PABA-Konzentration im Serum. Dies erfolgte auch bei dem Standard und dem Leerwert.
Die Berechnung des PABA-Gehaltes wurde folgendermaßen durchgeführt:
PABA/dl
Die Bestimmung der Fettsäuren im Serum erfolgte in Anlehnung an LEPAGE und ROY (1986). Das Prinzip der Methode beruht auf einer Einschritt-Reaktion, in der die veresterten Fettsäuren in den Proben unter Zugabe von Acetylchlorid zu Methylester umgeestert werden.
Die Gaschromatographie ermöglicht eine Auftrennung dieser Fettmethylester.
1,2 ml Serum + 1,2 ml 30 %ige Trichloressigsäure
800 µl Überstand in ein
10 Min bei 4000 U/Min.
+ 20 µl 0,1 %ige Natriumnitrit-Lsg.
+ 50 µl destl. Wasser
N-Naphtyl-Äthylendiamin-Lsg.
Mischen
bei 546 nm im Photometer messen
Bedingungen für die Gaschromatographie:
Gerät: ATI Unicam 610 Flammenionisationsdetektor (FID) Säulen: Supelco SP 2380; Länge: 30 m; Durchmesser: 0,53 mm Schichtdicke: 0,2 µm
Trägergas: Stickstoff Vordruck: 1 bar
Die Durchführung ist in Abbildung 17 schematisch dargestellt:
Abbildung 17: Schematische Darstellung des Nachweises von C15 und C17 im Serum
Die Bestimmung der Fettsäuren C15 und C17 in den Futter- und Kotproben wurde entsprechend den Bestimmungen der VDLUFA durchgeführt.
Die Bestimmung der Fettsäuren C15 und C17 in den Futter- und Kotproben wurde, ist in der Abbildung 18 schematisch dargestellt:
Abbildung 18: Schematische Darstellung des Nachweises von C15 und C17 in Futter- und Kotproben
0,2 ml Probe + 1,5 ml Methanol + 0,5 ml Hexan + interner Standard C13
+ 0,2 ml Acetylchlorid
60 Min. bei 100 °C
Überstand (Hexanphase; enthält Fettmetylester) in den Gaschromatographen
10 g Probe + Petroläther Probe in Fettkolben filtrieren + Zugabe vom internen Standard C13
Petroläthermittels
Abkühlen + gesättigte NaCl-Lösung bis Phasengrenzfläche im Hals des Rundkolbens zu sehen ist
Heptanphase in Reagenzglas überführen
+ einige Körnchen wasserfreies Natriumsulfat
Lösung 1:100 mit n-Heptan verdünnen
Filtration
gaschromatographische Bestimmung
1 Min. sieden
Auswertung:
Durch die Peakflächen eines bekannten internen Standard (C13) konnte auf den Gehalt der zu ermittelnden Fettsäuren C15 und C17 geschlossen werden. So ließ sich die Konzentration der beiden Fettsäuren im Serum bestimmen.
mg/l
Die Berechnung der Konzentration von C15 und C17 im Kot erfolgte analog zum Serum.
g/kg
Die Berechnung der Wiederfindungsrate von C15 und C17 im Kot wurde nach folgendem Schema berechnet:
Die Nachweisgrenze für die Einzelfettsäuren liegt bei 1mg/l.