Laboruntersuchungen

3.4.1 Leukozytenzahl und Leukozytendifferenzierung

Die Bestimmung der Leukozytenzahl und der Leukozytendifferenzierung wurde direkt auf dem Gestüt aus den gekühlten EDTA-Blutproben durchgeführt. Sie erfolgte mit Hilfe des „Vet ABC^®“ (ABX Hématologie, Montpellier/Frankreich) mittels Durchflusszytometrie. Zur Zählung und Differenzierung der korpuskulären Bestandteile des Blutes arbeitete das Gerät mit Widerstands- und Hochfrequenzmessung sowie über reagenzvermittelte Zelllyse zur Leukozytendifferenzierung.

Für die Widerstandsmessung wird in der Zählkammer des Gerätes ein Gleichspannungsfeld angelegt. Werden nun Blutzellen durch die Zählkapillare geleitet, verändern diese den elektrischen Widerstand im System. Diese Veränderungen der Stromstärke sind proportional zur jeweiligen Zellgröße.

Bei der Hochfrequenzmessung wird ein Wechselstromfeld genutzt, wodurch die unterschiedliche Energieaufnahme jeder Zelle gemessen wird. Die Fähigkeit zur Energieaufnahme lässt Rückschlüsse auf die Struktur und Größe des Zellkerns zu sowie auf das Kern-/Plasmaverhältnis. Die reagenzvermittelte Zelllyse unterstützt die Leukozytendifferenzierung, indem das Reagenz je nach Zelltyp zum Schrumpfen der Zelle führt (Lymphozyten) oder keine Veränderung bewirkt (PNG). Die Gesamtleukozytenzahl wurde in x 10⁹/l angegeben.

3.4.2 Serum Amyloid A-Analyse

Die Analyse von SAA wurde mit einem Teil der aliquotierten eingefrorenen Serumproben bei der Firma Biocontrol in Moers durchgeführt. Serum Amyloid A (= SAA) wurde mittels eines immunturbidimetrischen Latexagglutinationstest bestimmt. In dieser Studie wurde der „LZ Test ‚Eiken’ SAA“ (Eiken Chemical Co. Ltd., Tokyo/Japan) verwendet. Das Reagenz enthält mit polyklonalen Antikörpern beschichtete Latexpartikel. Das SAA in der Serumprobe bindet mit den Anti-SAA-Antikörpern und verursacht eine Trübung, die photometrisch mit Hilfe eines automatischen Analysegerätes gemessen wurde. Die gemessene Extinktion konnte mit einer Kalibrationskurve, die aus einer von der Firma gelieferten Standardkurve erstellt wurde, verglichen werden.

Die bei -20 °C gelagerten Serumproben wurden unmittelbar vor der Messung auf Raumtemperatur aufgetaut. Die SAA-Werte wurden mit dem „Hitachi-916“

(Hoffmann-La Roche AG, Grenzach-Wyhlen; Abb. 6) nach einer Inkubationszeit von zehn Minuten und bei einer Wellenlänge von 570 nm gemessen.

Mit dem Test können SAA-Werte bis 500 µg/ml bestimmt werden. Die benötigte Menge an frischem oder bei -20 °C gelagertem Serum betrug 3 µl pro Messung.

Bilirubin und Hb haben keinen Einfluss auf die Messergebnisse der SAA-Werte (WADA et al. 1997).

Dieser Testkit wurde zur Bestimmung von SAA aus dem Blut von Fohlen von STONEHAM et al. (2001) verwendet. Der „LZ Test ‚Eiken’ SAA“ (EikenChemical Co.

Ltd, Tokyo/Japan) hat eine sehr gute Testsicherheit bei der Bestimmung von SAA beim erwachsenen Pferd im mittleren und oberen Messbereich gezeigt (JACOBSEN et al.

2005). Die SAA-Werte wurden in µg/ml angegeben.

Abb. 6: „Hitachi-916“ (Hoffmann-La Roche AG, Grenzach-Wyhlen) eingesetzt zur Bestimmung des Serum Amyloid A-Wertes beim Fohlen

3.4.3 Haptoglobin-Analyse

Die Ermittlung der Hp-Werte erfolgte im Labor der veterinärmedizinischen Fakultät der Justus-Liebig-Universität in Gießen aus den aliquotierten Serumproben.

Die Bestimmung von Haptoglobin (= Hp) erfolgte mit Hilfe des „Phase Range Haptoglobin Testkit“ (Tridelta Development Limited, Bry/Irland). Der Test weist Hp über die Pseudoperoxidaseaktivität des Hämoglobins im Serum nach. Ein niedriger pH-Wert hemmt die Aktivität der Pseudoperoxidase. Befindet sich aber Hp in der

Serumblutprobe, bildet das Hp mit dem Hb einen Komplex und die Pseudoperoxidaseaktivität bleibt trotz niedrigem pH-Wert erhalten. Die Proben dürfen keine Hämolyse aufweisen. KENT (1987) beschrieb, dass eine Zugabe von Hb zu einer Serumprobe einen Abfall von bis zu 25 % an mittels Immunoturbidimetrie messbarem Hp bedingen kann.

Zur Durchführung der Hp-Analyse wurde das automatische Analysegerät „ABX Pentra 400 Chemistry Analyzer“ (HORIBA Medical, Kyoto, Japan; Abb. 7) genutzt. Die bei -20 °C gelagerten Serumproben wurden aufgetaut und zunächst mit Hb und Hb-Verdünner (Reagenz 1) versetzt. Anschließend werden Chromogen und Subtrat (Reagenz 2) dazugegeben und fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.

Abb. 7: „ABX Pentra 400“ (HORIBA Medical, Kyoto, Japan) eingesetzt zur Haptoglobin- und Ceruloplasminbestimmung beim Fohlen

Die Pseudoperoxidase katalysiert während der Inkubationszeit einen Farbwechsel. Direkt nach Ablauf der Inkubationszeit wurde die optische Dichte bei 600 nm photometrisch gemessen. Die Pseudoperoxidaseaktivität steigt mit der Anzahl der Hb-Komplexe im Serum an und somit korreliert die Farbintensität mit der Hp-Konzentration. Der Hp-Wert im Serum kann direkt über eine Standartreihe verglichen werden. Die Nachweisgrenze für den Hp-Testkit liegt zwischen

0,12 mg/ml und 2,0 mg/ml. Die Referenzwerte liegen nach Herstellerangaben für das adulte Pferd bei 2,19 ± 1,54 mg/ml Hp und für das Fohlen bei 5,35 ± 2,36 mg/ml Hp.

3.4.4 Ceruloplasmin-Analyse

Die Bestimmung der Ceruloplasmin (= CP) -Werte erfolgte im Labor der veterinärmedizinischen Fakultät der Justus-Liebig-Universität in Gießen aus den restlichen aliquotierten Serumproben. Dazu wurde eine automatische spektrophotometrische Methode genutzt, die von CERÓN und MARTINEZ-SUBIELA (2004) zur Messung von CP beim Hund im Serum beschrieben wurde. Die Nachweismethode für das CP basiert auf dessen oxidativer Aktivität. Als Substrat diente die Substanz p-Phenylenediamine (= PPD) in Lösung mit einem Natriumacetatpuffer bei einem pH von 5,2. Die verwendete Methode ist zur Anwendung in der Humanmedizin beschrieben (LEWIS et al. 1989; SUNDERMAN u.

NOMOTO 1970). Über manuelle Methoden zum Nachweis von CP durch die PPD-Oxidase wurde beim Hund berichtet (CONNER et al. 1988 a; SOLTER et al. 1991).

Die bei -20 °C gelagerten Serumblutproben wurden aufgetaut und jeweils 10 µl der Probe mit 100 µl der PPD-Lösung vermischt. Die Inkubationszeit betrug fünf Minuten bei Raumtemperatur. Das in der Probe enthaltene CP katalysiert die Oxidation von PPD, was sich durch einen Farbwechsel hin zu einem violettfarbenen Produkt zeigte. Am Ende der Inkubationszeit wurde die optische Dichte mit Hilfe des automatischen Analysegerätes „ABX Pentra 400 Chemistry Analyzer“ (HORIBA Medical, Kyoto, Japan; Abb. 7) bei 550 nm Wellenlänge gemessen. Die Farbintensität des Produktes ist proportional zur CP-Konzentration im Serum. Die CP-Werte wurden in mg/ml angegeben.

3.4.5 Fibrinogen-Analyse

Die Analyse der Fibrinogenwerte aus dem eingefrorenen Citratplasma wurde im Labor der Klinik für Pferde der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover durchgeführt. Die Fb-Bestimmung wurde mittels eines Koagulometers nach dem Verfahren nach CLAUSS (1957) durchgeführt. Dazu wurde ein Thrombinreagent mit einer Pufferlösung verwendet. Die Methode basiert auf der Umwandlung von Fb in das

unlösliche Fibrin. Die Reaktion wird durch das Enzym Thrombin katalysiert. Die Zeitspanne bis zur vollständigen Koagulation des Fibrins wird von der Fb-Konzentration bestimmt. Die Menge an Fb in einer Probe ist in Relation zur Thrombingerinnungszeit linear (CLAUSS 1957). Die Kalibration der Fb-Messung kann so über vom Hersteller angegebene Standards erfolgen.

Das bei -20 °C gefrorene Citratplasma wurde unmittelbar vor der Messung aufgetaut und es wurden jeweils 100 µl Plasma mit 900 µl Pufferlösung gemischt.

200 µl dieses Gemisches wurden zur Analyse in den Koagulometer eingefüllt. Nach einer zweiminütigen Inkubationszeit wurden 25 µl Thrombinreagent dazugegeben und mittels einer Stoppuhr am Koagulometer die Zeit bis zur Gerinnung der Probe gemessen. Der ermittelte Wert konnte mit einer laboreigenen und testspezifischen Tabelle verglichen werden und der gesuchte Fb-Wert in mg/dl angegeben werden.