Kreuzreaktivität in der Immunoaffinitätschromatographie

DIETRICHET AL. (1995) charakterisierten aus einer Hybridom-Zellkultur stammende monoklo-nale Antikörper u.a. für ZEA, T-2 Toxin, DAS, 3-AcDON und Fus X und verglichen diesbe-züglich ihrer Eigenschaften mit polyklonalen Antikörpern. Dabei wurde die Spezifität der mo-noklonalen ZEA-Antikörper eine Kreuzreaktivität gegenüber ZAN (182,7 %), α-ZAL (82,9 %), β-ZAL (74,1 %), α-ZOL (133,7 %) und β-ZOL (24,5 %) festgestellt. Die T-2 Toxin-Antikörper zeigen eine Kreuzreaktivität gegenüber Acetyl T-2 Toxin (114 %) und HT-2 Toxin (0,7 %).

CHU ET AL. (1979) entwickelten polyklonale T-2 Toxin-Antikörper nach Immunisierung von Hasen mit Rinderserumalbumin-T-2-hemisuccinat. Die gewonnenen Antikörper zeigten eine große Bindungsaffinität gegenüber T-2 Toxin, geringere gegenüber HT-2 Toxin und gerings-te gegenüber T-2 Triol. Kreuzreaktionen dieser Antikörper gegen NEO, T-2 Tetraol, 8-Acetyl-NEO waren nur sehr schwach. Für DAS, Trichodermin, DON und Verrucarin A zeigten diese keine Kreuzreaktionen. Die Empfindlichkeit dieses Assays lag in einem Bereich von 1 - 20 ng Analyt pro Kilogramm.

Hinsichtlich einer Multitoxin-Analytik war es daher für die vorliegende Arbeit wichtig, die Kreuzreaktivität der verwendeten IAC-Säulen zu charakterisieren.

88 Bundesinstitut für Risikobewertung Die zurzeit kommerziell verfügbaren DON-, T-2 Toxin- und ZEA-IAC-Säulen wurden auf die Fähigkeit getestet, mit weiteren Fusarientoxinen oben beschriebene Kreuzreaktivitäten ein-zugehen.

Für diese Untersuchungen wurden Toxin-Standardlösungen mit den entsprechenden Puffer-lösungen (bezogen auf die jeweiligen Herstellerangaben) verdünnt und direkt (ohne Anwe-senheit von Matrix) auf die IAC appliziert. Neben diesen direkten Aufgaben wurden diese Untersuchungen in bestimmten Fällen auch in Anwesenheit von Matrix durchgeführt, um eine routinemäßige Analysentauglichkeit einer eventuell vorhandenen Kreuzreaktivität zu belegen.

6.4.1 Deoxynivalenol Immunoaffinitätschromatographie-Säulen

In nachfolgender Tabelle sind die Wiederfindungsergebnisse der Kreuzreaktivität Untersu-chungen zwischen verschiedenen DON-IAC-Säulen und De-epoxy-DON (DOM-1) wiederge-geben.

Tab. 27: Untersuchung der Kreuzreaktivität von DOM-1 an DON-IAC-Säulen (n = 2) DON IAC Konz.

[µg/kg] DOM-1 Wdf.

[%]

Biopharm® 200 104 108

VICAM® 200 57 56,5

Nach Tab. 27 wurde bei Biopharm^® IAC-Säulen DOM-1 zu 100 % zurückgehalten. Dahinge-gen zeigten die VICAM^® IAC-Säulen geringere Wiederfindungen im Bereich von 57 %. Somit ließ sich feststellen, dass der Zielanalyt DON in den VICAM^® IAC-Säulen eingesetzten Anti-körper spezifischer gebunden wurde als das in den Biopharm^® IAC-Säulen der Fall war.

Demnach wäre ein Einsatz von DOM-1 als Internen Standard bei gleichzeitiger Nutzung von BIOPHARM^® IAC-Säulen möglich.

Tab. 28: Untersuchung der Kreuzreaktivität von Typ B Trichothecenen an BIOPHARM^® DON-IAC-Säulen ohne Matrix (n = 2)

Tab. 29: Untersuchung der Kreuzreaktivität von Typ B Trichothecenen an BIOPHARM® DON-IAC-Säulen mit Matrix (n = 2) 15-AcSCP und dem Typ B Trichothecen Trichothecin wurden keine Kreuzreaktionen der Biopharm^® DON-IAC-Säulen beobachtet. Die Tab. 28 und Tab. 29 verdeutlichen ebenfalls,

Bundesinstitut für Risikobewertung 89

dass mittels Biopharm^® DON-IAC-Säulen die Erfassung der aufgeführten Typ B Trichothece-ne zusätzlich zu DON nicht möglich war.

6.4.2 T-2 Toxin-Immunoaffinitätschromatographie-Säulen

Werden die Befunde der untersuchten Kreuzreaktivität betrachtet, so wurde zunächst die spezifische Bindung der T-2 Toxin-Antikörper gegenüber dem Zieltoxin bestätigt (Tab. 30 und 31)

Tab. 30: Wiederfindung von Typ A Trichothecenen an VICAM^® T-2 Toxin-IAC-Säulen ohne Matrix (n = 2) Charge 1 Charge 2

Die Kreuzreativität von HT-2 Toxin konnte anhand der zufriedenstellenden Wiederfindungen belegt werden. Die resultierende mittlere Wiederfindung von HT-2 Toxin ohne Matrix beträgt 92,5 % (Tab. 30). Bei weiteren Untersuchungen in Gegenwart von Matrix belaufen sich diese im Mittel auf 75 % bei einer gleichzeitigen mittleren Wiederfindung von 100 % von T-2 Toxin (Tab. 31).

Ein weiteres Typ A Trichothecen, das eine geringe Kreuzreaktivität mit den untersuchten IAC-Säulen aufweist, war 3-AcDAS mit einer Wiederfindung von kleiner als 10 %.

Tab. 31: Wiederfindung von Typ A Trichothecenen bei VICAM®-T-2 Toxin-IAC-Säulen mit Matrix ausge-hend von Extrakten aus der ASE-Multi-Trichothecen-Methode (n = 2)

Matrix Konz.

[µg/kg] Wdf.

[%] RSDr [%]

Maisgrieß 50 100 13,0

Vollkorn-Haferflocken 100 83 6,0 T-2 Toxin

Weizen 500 86 19,3

Maisgrieß 50 55 5,5

Vollkorn-Haferflocken 100 71 2,1 HT-2 Toxin

Weizen 500 100 3,0

Maisgrieß 50 3 4,0

Vollkorn-Haferflocken 100 2 4,3 3 Ac DAS

Weizen 500 3 10,0

Die Analytik von Typ A Trichothecenen stellt hohe Anforderungen bezüglich der nachzuwei-senden T-2 Toxin Konzentration. Der entsprechende Konzentrationsbereich befindet sich im Spurenbereich von < 100 µg/kg. In diesem Konzentrationsbereich sollten zufriedenstellende Wiederfindungen sowohl für T-2 Toxin als auch für den Internen Standard d3-T-2 Toxin ge-funden werden. Wie Tab. 32 verdeutlicht, erfüllt d3-T-2 Toxin diese Anforderung in einem Konzentrationsbereich von 10 µg/kg bis 50 µg/kg bei den verwendeten VICAM^®-T-2 Toxin-IAC-Säulen.

Tab. 32: Wiederfindung von d3-T-2 Toxin an VICAM®-T-2 Toxin-IAC-Säulen ohne Matrix (n=3) Konzentration

90 Bundesinstitut für Risikobewertung 6.4.3 Zearalenon-Immunoaffinitätschromatographie-Säulen

Zur Prüfung der Kreuzreaktivität von Zearalenon und dessen Derivaten wurden IAC-Säulen der Firmen Biopharm^®, Red Rabbit^® und VICAM^® verwendet. Für diesen Zweck wurde eine Mix-Lösung von Zearalenon und dessen Derivaten hergestellt. Diese wurde direkt eingesetzt und den Herstellerangaben entsprechend aufgebracht.

Tab. 33: Untersuchung der Kreuzreaktivität von ZEA und dessen Derivate an IAC-Säulen unterschiedli-cher Hersteller (n = 3)

Biopharm® Red Rabibt® VICAM®

Konz.

Die zur Routineanalytik herangezogenen IAC-Säulen der Fa. Biopharm^® und VICAM^® zeigen für Zearalenon und den Derivaten sehr gute Wiederfindungen. Die IAC-Säulen der Firma Red Rabbit^® zeigten in der Tendenz geringere Wiederfindungen. Lediglich für ZAN zeigten sich Auffälligkeiten bei den IAC-Säulen der Fa. Biopharm^® mit einer mittleren Wiederfindung von 155,5 % und einer relativen Standardabweichung von 40,5 %. Dieser Befund stellt im Vergleich zu den weiter aufgeführten Wiederfindungen einen Extremwert dar. Eine Erklärung für diese Abweichung könnte in produktionsbedingten Chargenunterschieden zu finden sein.

Die Ergebnisse zur Kreuzreaktivität waren im Hinblick auf Metabolisierungs- und Carry-Over-Untersuchungen von Zearalenon von Bedeutung, da neben dem natürlich vorkommenden Zearalenon auch das α-ZOL und die aufgeführten Stoffwechselprodukte ebenfalls mit dieser Technik erfasst wurden. Weiterhin war die Bestimmung der Kreuzreaktivität von unterschied-lichen Zearalenon-Derivaten für den Einsatz eines Internen Standards wie d4-α-ZOL für die Methodenentwicklung erforderlich. Daraus resultierten die Methoden zur Bestimmung von ZEA in Konsummilch und in pflanzlichen Speiseölen.