Bestimmung von Typ A und Typ B Trichothecenen in Bier

SCOTT ET AL. (1993) entwickelten eine Methode zur Bestimmung von DON, NIV, α-ZOL, β-ZOL und ZEA in Bier mittels GC-MS nach vorheriger Heptafluorobutrlimidazol-Derivatisierung. Wiederfindungsuntersuchungen im Konzentrationsbereich von 5 - 20 ng/mL lagen im Bereich von 90 bis 103 %. Die Nachweisgrenzen der Methode wurden zu 0,1 - 1,5 ng DON/mL, 0,01 - 0,3 ng NIV/mL, 2,5 - 3ng α-ZOL und β-ZOL und 1,5 - 2 ng ZEA/mL be-stimmt. In 29 von 50 untersuchten Bieren konnte DON nachgewiesen werden. Von den posi-tiven Proben lagen 9 über 5 ng/mL bis hin zu 50 ng/mL. NIV konnte ebenfalls in drei Proben nachgewiesen werden (0,1 - 0,84 ng/mL). ZEA und dessen Derivate konnten in keiner der untersuchten Bierproben quantitativ bestimmt werden. SCOTT (1996) untersuchte mögliche Veränderungen von ZEA und DON innerhalb des Brauprozesses. Dabei konnte der Über-gang dieser Mykotoxine aus kontaminiertem Getreide in Bier bestätigt werden. DON, das während des Brauprozesses erhalten bleibt, wurde mit hoher Inzidenz in kanadischen und europäischen Bieren nachgewiesen.

Bei einem durchschnittlichen Stammwürzegehalt von 10 % und den daraus abzuleitenden niedrigen DON-Konzentrationen in der Biermatrix wurde für die im Rahmen dieser Arbeit entwickelte Methode die Technik der LC-MS/MS für einen selektiven und empfindlichen Nachweis von DON gewählt. In die Methodenentwicklung wurde sowohl ein einzelner Extre-lut^®-Aufreinigungsschritt als auch eine kombinierte Aufreinigung mittels Extrelut^®- und IAC-Säulen untersucht. Die Wiederfindungsuntersuchungen wurden in verschiedenen Biermatri-zes (Hefeweizen, Ale, Vollbier Pils und Starkbier) in einem Konzentrationsbereich von 10 bis 100 µg/L durchgeführt.

Bundesinstitut für Risikobewertung 117

Tab. 51: Ergebnisse der Wiederfindungsuntersuchung von DON in vier unterschiedlichen Bier-Matrizes (n = 3)

In Tab. 51 sind die Wiederfindungsergebnisse der Extrelut^®-Aufreinigung und der kombinier-ten Extrelut^®- und IAC-Aufreinigung gegenübergestellt. Dabei weist der ausschließlich über Extrelut^® aufgereinigte Extrakt eine höhere mittlere Wiederfindung von 81 % gegenüber einer mittleren Wiederfindung von 71 % bei der kombiniert eingesetzten Aufreinigung auf. Dabei wurde deutlich, dass der zeitintensive, zweite Aufreinigungsschritt über die DON-IAC-Säulen letztendlich zu sauberen Extrakten führte. Dies wurde insbesondere dadurch belegt, dass diese Extrakte ebenfalls mittels HPLC-UV untersucht werden konnten.

Tab. 52: Mittlere Wiederfindungen der unterschiedlichen Aufreinigungsverfahren zur Bestimmung von DON in Bier

Für eine deutliche Darstellung der breiten Anwendungsmöglichkeit dieser effektiven Extre-lut^®-Aufreinigung wurden für eine Charakterisierung der Methode weitere Typ A und Typ B Trichothecene herangezogen. Für die in nachstehender Tab. 53 zusammengefassten Toxine wurden dabei Wiederfindungs-untersuchungen durchgeführt.

Tab. 53: Wiederfindungsuntersuchungen von Typ A und Typ B Trichothecen in Bier (ohne NIV) Wiederfindungsfunktion Mittlere

Die Ergebnisse der Wiederfindungsuntersuchungen (Tab. 53 und Tab. A-18, Anhang, Ab-schnitt III) zeigten überwiegend zufriedenstellende Resultate. Es wurde ein mittlerer Wieder-findungsbereich von 62 bis 86 % der untersuchten Trichothecene bestimmt. Allein die Er-gebnisse der Wiederfindungen für Nivalenol sind mit durchschnittlich 3,1 % unbefriedigend.

Ein Grund kann darin liegen, dass NIV die polarste Verbindung innerhalb der Typ B Tri-chothecene ist und während der 20-minütigen Verweildauer auf der Extrelut^®-Säule sehr stark an das Sorbens adsorbiert und somit nicht mehr eluiert werden konnte bzw. die Eluti-onsstärke des Lösungsmittels zum Brechen der Adsorption ungenügend war.

118 Bundesinstitut für Risikobewertung Für DON wurden Wiederfindungen im Bereich von 80,0 bis 88,9 % (nur Extrelut) und 72,1 bis 79,1 % (Extrelut in Verbindung mit IAC-Säule) erzielt. Werden die RSDr für DON für die Wiederfindungsuntersuchungen betrachtet, so liegen diese im Bereich 100-500 µg/kg inner-halb der Vorgabe von einer RSDr ≤ 20 % gemäß Richtlinie 2005/38/EG. Für T-2 Toxin wur-den Wiederfindungen im Bereich von 57,7 bis 70,5 % und für HT-2 Toxin von 87,3 - 101,6 % erzielt. Betrachtet man die RSDr für die durchgeführten Wiederfindungsuntersuchungen für HT-2 Toxin im Konzentrationsbereich von 100 - 200 µg/kg und für T-2 Toxin im Konzentrati-onsbereich von 50 - 250 µg/kg, so lagen diese innerhalb den genannten Vorgaben (RSDr ≤ 40 %) Die untersuchten und hier aufgeführten Leistungskriterien in der Analytik von Fusarientoxinen wurden mit dieser Methode im vollen Umfang erfüllt.

Somit ist diese Methode für die gleichzeitige Bestimmung von Typ A und Typ B Trichothece-nen, ausgenommen NIV, in Verbindung mit einem Tandem-Massenspektrometer geeignet.

Abb. 46: MRM-Overlay-Chromatogramm (LC-APCI-MS/MS) einer aufgestockten Schwarzbier-Probe (50 µg/L je Toxin) nach einfacher Extrelut Aufreinigung

Die Bestimmung von DON konnte nach zweifacher Aufreinigung über Extrelut^® -Festphasenextraktion und anschließendem IAC-Säulen Clean-Up ebenfalls mit HPLC-UV durchgeführt werden. Ein entsprechendes Chromatogramm einer natürlich kontaminierten Probe (Hefeweizenbier) ist nachfolgend in Abb. 47 dargestellt.

Wie Abb. 47 verdeutlicht, ist DON nach zweifacher Aufreinigung durch Extrelut und IAC-Säule mittels UV-Detektion bei den Wellenlängen 218 nm und 236 nm bestimmbar. Das Chromatogramm derselben Biermatrix nach einer einfachen Aufreinigung über eine Extrelut Säule zeigte eine zu große Matrixbelastung, als dass eine routinemäßige HPLC-UV-Methode zu etablieren wäre. Es wurde deutlich, dass der zeitintensive, zweite Aufreinigungsschritt über die DON IAC-Säulen letztendlich zu saubereren Extrakten führte, die zuletzt mittels einfachen HPLC-UV-Systemen analysierbar wären.

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Abb. 47: Overlay-Chromatogramm (HPLC-dual-UV) einer natürlich kontaminierten Bier-Probe (Hefewei-zenbier, hell) nach Aufreinigung mittels Extrelut und anschließender IAC-Säule

0 20000 40000

0 5 10 15 20 25 30

Zeit [M inuten]

Absorption [mAbs]

Wellenlänge 218 nm Wellenlänge 236 nm

Zur weiteren Charakterisierung von Leistungsparametern der Biermethode wurden Wieder-holbarkeitsuntersuchungen anhand von natürlich kontaminiertem Starkbier durchgeführt. Die Ergebnisse der Validierungsdaten sind in Tab. 54 zusammengefasst. Eine statistische Aus-wertung mittels ANOVA (Tab. A-19, Anhang, Abschnitt III) zeigt für die Standardabweichung unter Wiederholbedingungen ein zufriedenstellendes Ergebnis.

Tab. 54: Ergebnisse der Wiederholbarkeitsuntersuchungen von DON in natürlich kontaminiertem Stark-bier (n = 10) mittels LC-MS/MS

Tag 1 Tag 2 Tag 3 33,7 34,7 34,2 32,3 25,7 29,0 35,8 33,8 34,8 41,2 39,0 40,1 32,0 37,3 34,7 39,0 38,5 38,8 31,7 39,3 35,5 35,2 38,8 37,0 30,3 31,5 30,9 31,8 35,3 33,6

Mittelwert [µg/kg] 34,9

Median [µg/kg] 34,8

Spannweite [µg/kg] 15,5

STABW [µg/kg] 3,6

VK [%] 10,2

Grubbs Ausreißer Test Keine Ausreißer

r [µg/kg] 10,2

sr [µg/kg] 3,6

RSDr [%] 10,2

sr (Horwitz) [µg/kg] 9,3

RSDr (Horwitz) [%] 26,5

Hor 0,4

DON

120 Bundesinstitut für Risikobewertung 6.11 Qualitätskontrollkarten der eingesetzten Enzym-Linked-Immunosobent-Assay Die ELISA-Techniken wurden sowohl für Screening-Untersuchungen unterschiedlicher Le-bensmittelkategorien als auch zur quantitativen Analyse eingesetzt. Für die Qualitätssiche-rung der verwendeten DON- und ZEA-ELISA’s wurde bei jeder durchgeführten ELISA eine Qualitätskontroll-Reihe mitgeführt. Diese QC-Reihe bestand aus vier Kavitäten (siehe auch Methoden M1 und M2 im Anhang unter Abschnitt II). Als Matrix für die ZEA dc-ELISA wurde ZEA 185 und für die DON dab-ELISA DON 311 eingesetzt. Somit konnte für beide ELISA eine Kontrollkarte mit den in Tab. A-20 (Anhang, Abschnitt III) beschriebenen Kontrollgren-zen eingesetzt werden. Im Zeitraum dieser Untersuchungen wurden die zur Verfügung ge-stellten Antikörper und Antiseren für die DON- und ZEA- Untersuchungen ausschließlich aus einer Charge verwendet.

Im Verlauf der durchgeführten DON ELISA wurden wie in Abb. 48 dargestellt die positi-ve 3 s Kontrollgrenze einmal und die positipositi-ve 2 s Kontrollgrenze fünfmal überschritten. Die negative 2 s Kontrollgrenze wurde einmal unterschritten. Die Stabilitätsuntersuchungen von DON 311 (siehe Abb. 48) zeigten über den gesamten Zeitraum keine Tendenzen. Somit ist die hier feststellbare abnehmende Tendenz auf methodische Umstände (Alterung der mo-noklonalen Antikörper oder der Anti-Maus-IgG-Anitserum) zurückzuführen. Da es sich hierbei um eine halbquantitative Analysentechnik („Screeningverfahren“) handelt, sind die Über- bzw. Unterschreitungen der 2 s- und 3 s-Kontrollgrenzen aus diesem Grund als nicht gravie-rend zu beurteilen. Die Kreuzvalidierung der ELISA-Technik mit der HPUV bzw. LC-MS/MS (siehe Abschnitt 6.12.1) zeigt indes gute Ergebnisse.

Abb. 48: Qualitätskontrollkarte der DON-ELISA mit Vergleichsmaterial DON 311

0

Die ZEA-Qualitätskontrollkarte zeigt über den gesamten Verlauf der ELISA-Untersuchungen im Rahmen der vorgegebenen Kontrollgrenzen sehr streuende Ergebnisse. Es wurde keine auffällige Tendenz über diesen Zeitraum festgestellt. Somit können lagerungsbedingte Effek-te bei den Antikörpern und -KonjugaEffek-ten ausgeschlossen werden. Aus der ZEA-Kontrollkarte geht hervor, dass die untere 3 s Kontrollgrenze viermal und die 2 Kontrollgrenze dreimal unterschritten wurde. Eine Überschreitung der oberen 2 s-Kontrollgrenze konnte in zwei Fällen beobachtet werden. Wie bereits in Abschnitt 6.4.3 (IAC-Säulen) diskutiert, sind neben den Isomerverbindungen von ZEA ebenfalls eine Vielzahl von Matrixbestandteilen für mögliche ZEA-Überbefunde verantwortlich. Da es sich hierbei um eine halbquantitative Analysentechnik („Screeningverfahren“) handelt, sind die Über- bzw.

Unterschreitungen der 2 s- und 3 s-Kontrollgrenzen als nicht zu drastisch zu beurteilen,

zei-Bundesinstitut für Risikobewertung 121

gen aber auch die Limitierungen dieses Verfahrens. Die Kreuzvalidierung (siehe Abschnitt 6.12.5) der HPLC-FLD und LC-MS/MS mit der ELISA zeigt durch die Steigung der Mittelwert-linie ebenfalls die Neigung zu Überbefunden an.

Abb. 49: Qualitätskontrollkarte der ZEA-ELISA mit Vergleichsmaterial ZEA 185

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Mittelwertlinie 2 s Bereich 3 s Bereich Daten

6.12 Methodenvergleich und Kreuzvalidierung