Größenausschlusschromatographie – Bestimmung von Fusarientoxinen in Spei- Spei-seöl

Das Problem dieser Aufgabenstellung lag in der Auswahl und Optimierung eines geeigneten Aufreinigungsverfahrens für ZEA und weiteren Fusarientoxinen in pflanzlichen Speiseölen.

Bislang sind in der Analytik von Fusarientoxinen wenige Veröffentlichungen bekannt, die über die Möglichkeit der Gelpermeationschromatographie als Probenaufarbeitung berichten.

Die nachstehend beschriebenen Methoden zur Analytik von Mykotoxinen in Lebens- und Futtermitteln wurden auf der Grundlage von stärke- und faserbasierenden Getreideprodukten entwickelt.

HAGAN UND TIETJEN (1975) entwickelten eine dünnschichtchromatographische Methode zur Trennung von Öl und verschiedenen Mykotoxinen. In einem ersten dünnschichtchroma-tographischen Entwicklungsschritt wurde die Lipidfraktion abgetrennt. Erst anschließend er-folgt die eigentliche Trennung der Mykotoxine (u.a. auch Zearalenon). MALAIYANDI UND B AR-RETTE (1978) beschrieben eine Methode zur Bestimmung von Zearalenon in Maiskeimöl mit mehrmaliger Flüssig-Flüssig-Partitionierung und anschließender Aufreinigung über ein Silica-Gel (Typ G-60). Das in Benzol gelöste Maiskeimöl wurde hierbei mit 1 %iger Natronlauge extrahiert, die anschließend mit Chloroform extrahiert wurde. Diese Methode wies bei einer Dotierungskonzentration von 250 µg/kg eine Wiederfindung von 66 % und bei einer Dotie-rungskonzentration von 1.000 µg/kg eine Wiederfindung von 87 % auf.

So entwickelten HETMANSKI UND SCUDAMORE (1989) eine Methode zur Bestimmung von 14 unpolaren Mykotoxinen u.a. Zearalenon, Zearalenol, Ochratoxin A und Ochratoxin B und

Bundesinstitut für Risikobewertung 113

Aflatoxin B1, B2, G1, G2. Diese Methode basiert auf der Extraktion von Getreideerzeugnissen (Lebensmittel und Tierfutter) durch Dichlormethan/Salzsäure (10/1; V/V) und einer anschlie-ßenden Aufreinigung über eine Bio-Beads S-X3 Größenausschluss-Säule mit einem Di-chlormethan/Ethylacetat/Ameisensäure-Eluenten (49,9/49,9/0,2; V/V/V) bei einem Durchfluss von 4 mL/min. Bei diesen GPC-Bedingungen eluierten die genannten Mykotoxine in einem Elutionsvolumen von 81 bis 130 mL. Sowohl für Zearalenon (Konzentration = 40 µg/kg) als auch für Zearalenol (Konzentration = 200 µg/kg) erzielte diese Methode eine mittlere Wieder-findung (n = 3) von 84 % bei der Dotierung auf Weizenmatrix.

DUNNE ET AL. (1993) beschrieben eine Aufreinigung über GPC für Zearalenon, Ochratoxin A und B und Aflatoxin B1, B2, G1. Dabei wurde die Extraktion und Aufreinigung vergleichbar zu der oben beschriebenen Methode von HETMANSKI UND SCUDAMORE (1989) durchgeführt. Die Wiederfindungsversuche wurden in Extrakten von Weizen-, Maiskörnern, und Palmenkernen vorgenommen. Dabei wurde für Zearalenon in Maiskörnern eine Wiederfindung von 49,7 %, in Palmenkernen von 17,2 % und in Weizenkörnern von 71,6 % ermittelt. Ebenfalls KOTAL ET AL. (1999) beschrieben eine Methode zur Bestimmung von sieben Trichothecenen (DON, NIV, T-2 Tetraol, FusX, DAS, T-2 Toxin und HT-2 Toxin) mittels GPC. Dabei erfolgte die Ex-traktion mit einem Acetonitril/Methanol-Gemisch (1:1; V/V) bzw. Acetonitril/Wasser-Gemisch (1:1; V/V). Ein Extrakt-Aliquot wurde eingeengt und der Rückstand in Chloroform gelöst. An-schließend wurde bei einem Durchfluss von 0,6 mL/min über eine Bio-Beads S-X3 Säule mit Dichlormethan/Ethylacetat (1/1; V/V) eluiert. Dabei wurde die erste 8 mL Fraktion verworfen, die folgende 7 mL Fraktion gesammelt. Die chromatographische Trennung und Detektion erfolgte über GC-ECD nach vorheriger Derivatisierung mittels Trifluoressigsäureanhydrid.

Bei einer Wiederfindungskonzentration von jeweils 2 mg/kg Trichothecen konnten Wiederfin-dungen im Bereich von 72 - 105 % bestimmt werden. Die Nachweisgrenzen der einzelnen Trichothecene bewegten sich im Bereich von 40 - 200 µg/kg.

RADOVA ET AL. (1998) setzten die GPC-Technik für eine Multi-Toxin-Methode für Typ A und Typ B Trichothecene ein. Für die GPC-Trennung wurde Bio-Beads S-X3 Material verwendet mit Chloroform als mobiler Phase (Durchfluss = 0,6 mL/min). Die Detektion der Trichothece-ne erfolgte mittels GC-ECD. Mit dieser GPC-Aufreinigung konnte die Matrix nur bis zu eiTrichothece-nem gewissen Grad entfernt werden, da nur bei einer dotierten Konzentration von 2000 µg/kg je Trichothecen gute Wiederfindungen (86 - 97 %) verzeichnet wurden. Durch verbleibende Matrixbestandteile im Injektor und am Säuleneingang wurde der routinemäßige Einsatz die-ser Methode erschwert.

RANFFT ET AL. (1990) beschrieben eine Methode zur simultanen Bestimmung von ZEA und OTA in Getreide nach Extraktion mit Chloroform und anschließender Aufreinigung über GPC.

Die mittlere Wiederfindung wurde für ZEA zu 97 % in einem Konzentrationsbereich von 3,5 bis 85 µg/kg bestimmt.

Durch die im Rahmen dieser Arbeit entwickelte Methode wurden erstmals Zearalenon, des-sen Metabolite und Typ A und Typ B Trichothecene in überwiegend lipidhaltiger Matrix nach-gewiesen und quantifiziert. Durch geeignete Vorversuche wurde das in Abb. 14 (Abschnitt 5.7) dargestellte Fraktionierungsbild für die Mykotoxine erhalten.

114 Bundesinstitut für Risikobewertung

Abb. 43: HPLC-FLD-Overlay-Chromatogramm einer natürlich kontaminierten Maiskeimölprobe mit (schwarz) und ohne (rot) anschließender Aufreinigung über IAC

0 10 20 30

0 250000 500000 750000 1000000

Zearalenon

Aufarbeitung:

GPC

Aufarbeitung:

GPC und IAC

Intensität, mAbs

Zeit [Minuten]

In Abb. 43 ist deutlich zu erkennen, dass nach erfolgter GPC-Aufreinigung (unteres Chroma-togramm) und anschließender Fluoreszenz-Bestimmung für diese Detektion ein weiterer Auf-reinigungsschritt notwendig (siehe oberes Chromatogramm) war, da die Störungen durch Matrixeinflüsse zu groß waren. Dies war bei einer GPC nachfolgenden LC-MS/MS-Bestimmung nicht notwendig (Abb. 44).

Abb. 44: MRM-Overlay-Chromatogramme (LC-ESI-MS/MS) einer natürlich kontaminierten Maiskeimölpro-be mit ausschließlicher GPC-Aufreinigung (oMaiskeimölpro-beres Chromatogramm) und mit nachgeschalteter ZEA-IAC-Säulen-Aufreinigung (unteres Chromatogramm)

Wiederfindungsuntersuchungen

Die Wiederfindungsuntersuchungen von ZEA wurden in Maiskeim-, Soja- und Weizenkeimöl durchgeführt und sind in nachfolgender Tabelle für beide eingesetzten Detektionsverfahren zusammengefasst.

Bundesinstitut für Risikobewertung 115

Tab. 49: Ergebnisse der Wiederfindungsuntersuchungen von Zearalenon in drei verschiedenen Speise-ölen (n = 3)

Die im Rahmen dieser Arbeit entwickelte Methode zur Bestimmung von ZEA in pflanzlichen Speiseölen zeigte für die GPC-Aufreinigung mit folgender LC-MS/MS-Bestimmung eine mitt-lere Wiederfindung von 99,4 % über einen Konzentrationsbereich von 10³. Die nacheinander eingesetzte Aufreinigung von GPC und IAC-Säule für die Bestimmung mittels HPLC-FLD zeigte eine mittlere Wiederfindung von 88,2 % über einen Konzentrationsbereich von 2 · 10². (Tab. 50). Die relativen Standardabweichungen beider Methoden lagen in einem Bereich von kleiner 10 % und erfüllen somit die Leistungskriterien gemäß Richtlinie 2005/38/EG für ZEA.

In Anbetracht der Polarität der Typ A und Typ B Trichothecene wurden geringe Konzentrati-onen in der Matrix pflanzliche Speiseöle erwartet. Die für ZEA entwickelte GPC-Methode wurde auf die Bestimmung von Trichothecenen in Speiseölen übertragen. Eine detaillierte Aufstellung der Wiederfindungsuntersuchungen ist im Anhang unter Tab. A-14 (Anhang, Abschnitt III) zusammengestellt.

Tab. 50: Wiederfindungsfunktionen der HPLC-FLD- und der LC-MS/MS-Methoden zur Bestimmung von ZEA in pflanzlichem Speiseöl

Die Zusammenfassung der Wiederfindungsergebnisse zu den entsprechenden Wiederfin-dungsfunktionen in Tab. A-16 (Anhang, Abschnitt III) zeigt, dass VOL, DON, NIV Trichothe-cin und DAS gute mittlere Wiederfindungen in einem Bereich von 65 bis 120 % über alle un-tersuchten Matrizes erzielten. Sowohl für die Typ B Trichothecene 3-AcDON, 15-AcDON und FusX als auch für die Typ A Trichothecene 3-AcSCP, 15-AcetoxyDAS, HT-2 Toxin und T-2 Toxin konnten Wiederfindungen von 29 - 78 % bei teilweise sehr großen relativen Standard-abweichungen bis 60 % (Tab. A-14, Anhang Abschnitt III) nachgewiesen werden. Somit be-sitzt diese Methode einen sehr großen Streubereich. Dies kann dadurch erklärt werden, dass diese Methode für die Bestimmung von ZEA in Speiseölen entwickelt und optimiert wurde.

Der Fraktionierungsbereich der GPC-Technik wurde auf ZEA optimiert und dementspre-chend bestand die Möglichkeit, dass das resultierende Elutionsfenster in der GPC für die aufgeführten Trichothecene nicht im Optimum lag. Dies wird aus Abb. 15 (Abschnitt 5.7) ebenfalls deutlich. Trichothecene sind polare Verbindungen und somit in dieser lipidreichen Matrix und dem verwendeten Lösungsmittelgemisch Cyclohexan/Ethylacetat schwer löslich.

Dieser Umstand kann dazu führen, dass wie gezeigt diese Methode zu einer höheren Streu-ung neigt.

Trotzdem konnte mit dieser Technik in Hanfölproben eine Vielzahl von Trichothecenen nachgewiesen werden (Abb. 45). Durch Verwendung des Internen Standards konnten die unbefriedigenden Wiederfindungen in der Berechnung des Gehaltes berücksichtigt werden.

116 Bundesinstitut für Risikobewertung

Abb. 45: MRM-Overlay-Chromatogramm (LC-APCI-MS/MS) einer natürlich kontaminierten, kaltgepressten Hanfölprobe