Isolierung von Nukleinsäuren

3.1.1 Analytische Plasmid-Isolierung (Minipräparation)

Zur schnellen Präparation von Plasmid-DNA aus einer Vielzahl von Bakterienklonen wurden 2 ml LB-Medium, versehen mit dem geeigneten Antibiotikum, mit einer Einzelkolonie transformierter Bakterien inokuliert. Die Kultur wurde bei 37°C üN bei 225 UpM inkubiert.

1,5 ml der Kultur wurden in ein Schnappdeckel-Reaktionsgefäß überführt und die Bakterien durch einminütiges Zentrifugieren bei 16000 x g sedimentiert. Das Sediment wurde nach Verwerfen des Überstandes in 400 µl STET-Puffer resuspendiert, 30 µl frisch angesetzte Lysozym-Lösung zugesetzt und die Suspension mit Hilfe eines Strudelmischers durchmengt. Die Ansätze wurden 5 min bei RT inkubiert und dann einem einminütigen Hitzeschock von 100°C unterzogen. Die Ansätze wurden 5 min auf Eis abgekühlt und danach bei 4°C für 15 min bei 16000 x g zentrifugiert. Das aus Zellresten und hieran haftender genomischer DNA bestehende Sediment wurde entfernt. Der die Plasmid-DNA und RNA enthaltende Überstand wurde mit 400 µl Isopropanol vermischt. Das Präzipitat der Plasmid-DNA wurde durch 30-minütiges Zentrifugieren bei 4°C und 18000 UpM sedimentiert, der Überstand wurde verworfen und die DNA mit 400 µl kaltem 70% Ethanol gewaschen. Nach Zentrifugation (10 min, 4°C, 18000 UpM) wurde der Überstand verworfen und die Plasmid-DNA nach Lufttrocknung in 50 µl TE-Puffer mit 0,1% RNase2000 aufgenommen. Die Plasmid-DNA-Lösung wurde bei -20°C gelagert.

3.1.2 Präparative Plasmid-Isolierung (Midipräparation)

Zur Präparation größerer Mengen hochreiner Plasmid-DNA wurde der Plasmid-Präparationssatz der Firma Quiagen verwendet. Dazu wurden 50 ml LB Medium, versehen mit dem geeigneten Antibiotikum, mit einer Einzelkolonie transformierter Bakterien inokuliert. Die Kultur wurde nach Inkubation üN bei 37°C und 225 UpM in ein 50 ml Schraubdeckelgefäß überführt und die Bakterien durch 15-minütiges Zentrifugieren bei 20°C und 7000 UpM sedimentiert. Alle weiteren Schritte wurden, wie vom Herstellen empfohlen, durchgeführt. Die Plasmid-DNA-Lösung wurde bei -20°C gelagert.

Methoden

3.1.3 Präparative, endotoxinfreie Plasmid-Isolierung (Maxipräparation)

Für die Transfektion embryonaler Stammzellen der Maus werden große Mengen sehr reiner Plasmid-DNA benötigt. Die Aufreinigung erfolgte mit Hilfe des Qiagen EndoFree MaxiKits der Firma Qiagen. 100 ml LB-Medium, versetzt mit dem geeigneten Antibiotikum, wurden mit einer Einzelkolonie des gewünschten Bakterienklons inokuliert und über Nacht bei 37°C und 225 UpM inkubiert. Die Präparation erfolgte über Anionenaustausch-Säulen (Qiagen-tip 500), prinzipiell wie unter 3.2.2 beschrieben. Die Plasmid-DNA wurde in 200 µl endotoxinfreiem TE-Puffer gelöst. Die Plasmid-DNA-Lösung wurde bei -20°C gelagert.

3.1.4 Isolierung genomischer DNA aus Maus-Schwanzspitzen

Zur Isolierung genomischer DNA aus Maus-Schwanzspitzen wurden Schwanzbiopsien (etwa 0,5 cm) in 0,5 ml Laird-Lysis-Puffer (Laird et al., 1991) mit 6 "l Proteinase K (20 mg/ml) bei 56°C über Nacht lysiert. Haare und unlösliche Zellrückstände wurden durch Zentrifugation (13000 UpM, 10 min, 4°C) abgetrennt und der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt.

Durch Zugabe von 0,5 ml Isopropanol und mehrmaliges Invertieren wurde die DNA gefällt und durch erneute Zentrifugation (13000 UpM, 15 min, 4°C) sedimentiert. Nach sorgfältiger Entfernung des Überstandes wurde die DNA durch Zugabe von 0,5 ml Ethanol (70 %) und anschließendes Invertieren gewaschen. Nach Entfernung des Überstandes wurde die DNA an der Luft getrocknet, in 50-150 µl TE-Puffer aufgenommen und üN bei 56°C im Wasserbad gelöst.

Diese DNA-Lösungen wurden zu Genotypisierungen mittels PCR eingesetzt.

3.1.5 Isolierung genomischer DNA aus Organen

Organe wurden, entsprechend der Angaben von Strauss (1998), direkt nach der Präparation in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die gefrorenen Gewebeproben (bis zu 1 g) wurden in vorgekühlten Schraubzylindern mit Metallstäben und einem Hammer zu Pulver zerkleinert, das in 15 ml-Zentrifugationsröhrchen (Sarstedt) gesammelt wurde. Anschließend wurde das Gewe-bepulver mit 1,2 ml Laird-Lysis-Puffer und 6 µl Proteinase K je 100 mg Gewebe versetzt und 2-3 Tage im Wasserbad bei 55°C inkubiert, bis keine Gewebeklumpen mehr sichtbar waren. Diese Organlysate wurden zusammen mit gleichem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (1:1:24; Roth) für 30 sec mit dem Strudelmischer durchmischt und 10 min zentrifugiert (Zen-trifuge J-21C, Rotor JS 13.1, 2500 UpM, 4°C). Die obere wässrige Phase wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt und mit dem 0,5-fachen Volumen Ammoniumacetatlösung (7,5 M) und dem 2-fachen Volumen Ethanol (100%) vorsichtig geschwenkt, bis die DNA präzipitierte.

Methoden Nach Sedimentation der DNA (2500 UpM, 5 min, 4°C) wurde der Überstand verworfen, das DNS-Sediment mit 5 ml Ethanol (70%) gewaschen und erneut zentrifugiert (2500 UpM, 5 min, 4°C). Der Überstand wurde vorsichtig entfernt, das DNA-Sediment für 5-10 Minuten bei RT ge-trocknet und anschließend in einem geeigneten Volumen TE-Puffer üN bei 56°C in Lösung gebracht, dann bei 4°C gelagert. Diese DNA-Lösungen wurden zur Genotypisierung mittels PCR- und Southern Blot-Analyse verwendet.

3.1.6 Isolierung genomischer DNA aus embryonalen Stammzellen der Maus

In 6-Loch-Schalen konfluent gewachsene Stammzell-Kulturen wurden nach Entfernung des Mediums zweimal mit PBS^- gewaschen, mit einer Mischung aus 1 ml ES-Lysis-Puffer und 5 µl Proteinase K-Stammlösung versetzt und für 30 min bei RT schwenkend inkubiert. Hiernach wurden die Schalen mit Parafilm luftdicht verschlossen und üN bei 56°C inkubiert. Zur Fällung der DNA wurde den Ansätzen nach Abkühlen auf RT das gleiche Volumen an Isopropanol zugesetzt, und für 30 min schwenkend bei RT inkubiert. Die DNA-Flocke wurde mit einer umgebogenen Pipettenspitze aus der Lösung gehoben, in Ethanol (70%) getaucht und an der Luft getrocknet. Nach dem Trocknen wurde die DNA mit 200 µl TE-Puffer versetzt und zum Lösen für 1 bis 2 Tage bei 56°C inkubiert. Die auf diese Weise gewonnene DNA wurde für PCR- und Southern Blot-Analysen verwendet.

3.1.7 Aufreinigung von DNA aus embryonalen Dottersäcken

Für eine schnelle Gewinnung genomischer DNS aus embryonalen Dottersäcken wurde der präparierte Dottersack in ein Mikroreaktionsgefäß gegeben, in dem 100 "l des alkalischen Lysis Reagenz (pH 5,0) vorgelegt waren. Nach Erhitzen auf 95°C für 30 min und anschließendem Abkühlen auf Eis wurde die Lösung durch Hinzufügen des entsprechenden Volumens Neutralisationsreagenz (pH 12,0) auf etwa pH 8,0 neutralisiert und kurz abzentrifugiert. Für die anschließende PCR-Analysen wurden 1 bis 5 "l des Überstandes eingesetzt.

3.1.8 Aufreinigung von DNA aus Agarosegelen

Die gewünschten DNA-Fragmente wurden nach Gelelektrophorese unter UV-Licht (365 nm) mit einem Skalpell aus dem Agarosegel herausgeschnitten. Die Aufreinigung der DNA aus dem Agarosestück erfolgte mit dem QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) nach Angaben des Herstellers.

Methoden

3.1.9 Isolierung von Gesamt-RNA aus Geweben

Mittels des Reagenzes TRIzol, einer homogenen Lösung aus Phenol und Guanidiniumthiocyanat (Chomczynski und Sacchi, 1987), lässt sich Gesamt-RNA aus Kulturzellen und Geweben geschützt vor RNasen isolieren. Hierzu wurde Gewebe frisch präpariert, gewogen und sofort in flüssigem Stickstoff tiefgefroren. Unter einem Abzug wurden pro 100 mg Gewebe 1 ml TRIzol hinzugegeben und das Gewebe mit Hilfe eines Ultraschallstabes gelöst. Der Ansatz wurde für 5 min bei RT inkubiert. Zum Lysat wurden pro ml TRIzol 0,2 ml Chlorofom gegeben, der Ansatz wurde 5 min bei Raumtemperatur geschüttelt und daraufhin 15 min bei 4°C und 12000 UpM zentrifugiert. Die obere Phase wurde in ein neues 13 ml Schraubdeckel-Reaktionsgefäß überführt, mit 0,5 ml 2-Propanol/ml TRIzol versehen, durch Invertieren des Gefäßes durchmischt und 10 min bei RT inkubiert. Nach Zentrifugation für 10 min bei 4°C und 12000 UpM wurde der Überstand verworfen und die gefällte RNA mit 3 ml 75% RNA-Ethanol gewaschen. Nach Zentrifugation für 5 min bei 4°C und 7500 UpM wurde der Überstand entfernt und die RNA luftgetrocknet. Die getrocknete RNA wurde in 400 µl DMPC-Wasser gelöst und in 2 ml Schraubdeckel-Reaktionsgefäße überführt. Für die photometrische Vermessung und ein Testgel zur Überprüfung auf RNA-Abbau wurden sofort zweimal 10 µl RNA-Lösung abgenommen. Nach vollständiger Lösung der RNA durch 5-minütige Inkubation bei 65°C wurden die RNA-Proben bei -70°C gelagert.