Erzeugung von Mäusen mit Glattmuskel-spezifischer Deletion von Connexin43 im Uterus

Neben den zuvor dargestellten Untersuchungen zur funktionellen Bedeutung von Cx43 Gap Junction-Kanälen durch induzierbare, Zelltyp-spezifische Inaktivierung in glatten Muskelzellen des Gastrointestinaltrakts wurden dieselben Mausmutanten auch im Hinblick auf das Fehlen von Cx43 in Myometrium-Zellen des Uterus charakterisiert. Um das Expressionsprofil von Cx43 im Uterus mit Hilfe des LacZ-Reportergens vollständig darstellen zu können, wurden Cx43^del/+ -Tiere eingesetzt (Theis et al., 2001).

4.1.2.1 Im Myometrium führt SM-CreER^T2 zu einer Deletion von Cx43 in 30-40% der glatten Muskelzellen in vivo

Nach SM-CreER^T2-vermitteleter Deletion der Cx43 kodierenden Region wurde eine Expression des LacZ-Reportergens in 30-40% aller Cx43-exprimierenden myometrialen Muskelzellen, verglichen mit der nahezu ubiquitären X-Gal-Färbung in Cx43^del/+-Tieren, beobachtet. Der variierende Umfang der LacZ-Expression hing dabei wahrscheinlich mit dem unterschiedlichen Grad der Tamoxifen-Induktion der Cx43^fl/fl:SM-CreER^T2-Mäuse zusammen. In nicht-induzierten Cx43^fl/fl:SM-CreER^T2-Mäuse oder Cx43^fl/fl-Kontrollen wurde nie eine Blaufärbung beobachtet (Abb. 4.1.6 A-C).

spezifische Immunfluoreszenz-Untersuchungen zeigten eine geringe Reduktion der Cx43-Immunreaktivität im Tamoxifen-behandelten Cx43^fl/fl:SM-CreER^T2-Uterus (Abb. 4.1.6 D, E). Da bekannt ist, dass Cx43, außer in glatten Muskelzellen, auch in anderen Zelltypen des Myometriums exprimiert wird, handelt es sich bei den Cx43-positiven Zellen wahrscheinlich um Fibroblasten, Gefäß-assoziierte Endothelzellen und Mastzellen (Reynolds and Redmer, 1999;

Yeh et al., 1997; Oviedo-Orta and Howard Evans, 2004).

Abb. 4.1.6 Untersuchungen zur Effizienz der SM-CreER^T2-vermittelten Deletion von Cx43 im Myometrium.

A-C Die X-Gal-Färbung von Uteruskryoschnitten zeigte die Deletion von Cx43 in der longitudinalen und zirkulären Muskelschicht Tamoxifen-behandelter Cx43^fl/fl:SM-CreER^T2-Tiere (B) im Gegensatz zu unbehandelten Kontrollen (A). Cx43^del/+-Tieren zeigten eine LacZ-Expression in nahezu jeder Zelle (C).

D, E Cx43-Immunfluoreszenz-Analyse von Uterusgewebe der Genotypen Cx43^fl/fl:SM-CreER^T2, nicht

Ergebnisse behandelt (D), und Cx43^fl/fl:SM-CreER^T2, Tamoxifen-behandelt (E). In (D) ist das reguläre Cx43-Expressionsmuster (rote Signale) erkennbar, während die Glattmuskel-spezifische Deletion zu einer geringen Reduktion der Cx43-Immunfluoreszenzsignale führte (E). Die glatte Muskulatur wurde durch Verwendung SM-Aktin-spezifischer Antikörper (grün) dargestellt. LM: longitudinale Glattmuskelschicht, CM: zirkuläre Glattmuskelschicht, S: Stroma. Größenbalken: 50 µm.

4.1.2.2 Der Verlust von Cx43 in primären Glattmuskel-Zellkulturen führt zu einer Reduktion des interzellulären Farbstofftransfers

Um zu untersuchen, ob das oben genannte Ausmaß der Cx43-Deletion einen funktionalen Effekt zeigt, d.h. die Eigenschaft des Myometriums als gekoppeltes Synzytium beeinflusst, wurden Primärzellkulturen glatter Muskelzellen aus Uteri unbehandelter und Tamoxifen-behandelter Cx43^fl/fl:SM-CreER^T2-Mäuse angelegt. Mikroinjektionen des Farbstoffes Lucifer Yellow führten in nicht-induzierten Kulturen zu einer Kopplung von 0-4 Zellen mit einem durchschnittlichen Farbstrofftransfer in 2,07 Zellen. Die Kopplung Cx43-deletierter glatter Muskelzellen war auf durchschnittlich 0,47 Zellen reduziert (Farbstofftransfer in 0-2 Zellen). Abb. 4.1.7 zeigt repräsentative Beispiele der Kopplung.

Abb. 4.1.7 Mikroinjektion von Lucifer Yellow in Primärzellkulturen glatter Muskelzellen des Maus-Uterus.

A-D Repräsentative Aufnahmen des Lucifer Yellow-Transfers in konfluenten Primärzellkulturen myometrialer Zellen (A, C) sowie Phasenkontrast-Aufnahmen (B, D) der injizierten Zelle (*).

Unbehandelte Zellen (A, B) wiesen eine höhere Farbstoffkopplung auf als Tamoxifen-behandelte

Cx43^fl/fl:SM-CreER^T2-Primärzellen (C, D). Größenbalken: 50 !m.

Ergebnisse Eine Reduktion des Cx43-Protein-Gehalts um mehr als 60% in kultivierten primären Glattmuskelzellen Tamoxifen-behandelter im Vergleich zu unbehandelten Cx43^fl/fl :SM-CreER^T2-Mäusen wurde durch Immunfluoreszenz- und Immunoblot-Analysen nachgewiesen (Abb. 4.1.8)

Abb. 4.1.8 Überprüfung der Cx43-Deletion in Primärzellkulturen glatter Muskelzellen des Uterus.

A, B Die Immunfluoreszenz-Analyse von myometrialen Primärzellkulturen mit Cx43-spezifischen Antikörpern (rot) zeigte die Reduktion der Cx43-Expression in Tamoxifen-behandelten (B) im Vergleich zu unbehandelten Cx43^fl/fl:SM-CreER^T2-Mäusen (A). Die glatten Muskelzellen wurden durch eine Gegenfärbung mit SM-Aktin-spezifischen Antikörpern (grün) dargestellt. C Cx43-Immunoblot-Untersuchungen von Lysaten unbehandelter (SMC n.b.) und behandelter Glattmuskel-Kulturzellen (SMC Tam.) zeigten nach !-Aktin-Abgleich eine Reduktion der Cx43-Proteinexpression um 63% in mit Tamoxifen-induzierten Cx43^fl/fl:SM-CreER^T2-Mäusen. HeLa Cx43: Lysat Cx43-exprimierender HeLa-Zellen. Größenbalken: 50 !m.

4.1.2.3 Die zelltypspezifische Deletion von Cx43 in myometrialen Glattmuskelzellen in vivo beeinflusst das Geburtsverhalten

Der Geburtszeitpunkt des ersten Jungtieres schwangerer unbehandelter und Tamoxifen-behandelter Cx43^fl/fl:SM-CreER^T2-Weibchen wurde aufgezeichnet, um mögliche Veränderungen des Geburtsvorgangs durch die Reduktion der Cx43-vermittelten Gap Junction-Kopplung zu untersuchen. Wie in Abb. 4.1.9 A gezeigt ist, warfen 89% (16 von 18) der nicht mit Tamoxifen behandelten Cx43^fl/fl:SM-CreER^T2-Mäuse an Tag 19,5 zwischen 4 und 8 Uhr morgens. Nur 11%

(2 von 18) dieser Gruppe warfen zwischen 8 und 12 Uhr. Im Gegensatz dazu setzte die Geburt bei 82% (14 von 17) der schwangeren Tamoxifen-induzierten Cx43^fl/fl:SM-CreER^T2-Mäuse erst nach acht Uhr morgens ein. Sechs dieser „spät-gebärenden“ Tiere warfen ihr erstes Jungtier, das häufig verstorben und teilweise degradiert war, an Tag 20 bis 22 der Schwangerschaft (Abb.

4.1.9 B). Ein normales Geburtsverhalten, d.h. der Wurf des ersten Jungtieres zwischen 4 und 8 Uhr an Tag 19,5, wurde nur bei 18% (3 von 17) der Tamoxifen-induzierten Cx43^fl/fl :SM-CreER^T2-Weibchen beobachtet. Zusätzlich wurden schwangere homozygot gefloxte Cx43^fl -Mäuse, die kein Cre-Transgen exprimierten, untersucht. Nur drei von 16 Tamoxifen-behandelten und keins von 18 unbehandelten Cx43^fl/fl-Weibchen zeigte eine Verzögerung des

Ergebnisse Geburtsprozesses (Daten nicht gezeigt). In Cx43^del/+-Tieren konnte keine Veränderungen des Geburtsverhaltens festgestellt werden (nicht gezeigt).

Abb. 4.1.9 Auswirkung der Cx43-Deletion auf den Geburtsprozess.

Der Geburt des ersten Jungtieres unbehandelter und Tamoxifen-behandelter Cx43^fl/fl:SM-CreER^T2-Mäuse wurde beobachtet. Das Einsetzten der Geburt bis 8.00 Uhr morgens wurde als normal klassifiziert, ein Geburtsbeginn zu späteren Zeitpunkten wurde als verlängerte Tragezeit dargestellt. In A werden die Ergebnisse als Prozentzahlen in Bezug auf die Länge der Schwangerschaft, in B als gleitender Durchschnitt der absoluten Tierzahlen bezogen auf den Wurfzeitpunkt an Tag 19 bzw. 20 bis 22 dargestellt.

4.1.2.4 Die Expressionsstärke ausgewählter Kontraktions-assoziierter Protein-Gene und der Progesterongehalt wird durch die Deletion des Cx43-Locus nicht verändert Die Analyse myometrialer cDNA schwangerer Mäuse an Tag 16,5 (d16,5) und zum Zeitpunkt der Geburt (d19) durch quantitative Real-Time PCR zeigte keine signifikanten Veränderungen in der Expressionsstärke der Kontraktions-assoziierten Protein-Gene (CAP) Oxytozin Rezeptor (d16,5: p=0.98; d19: p=0.09), Prostaglandin Rezeptor (d16,5: p=0.39; d19: p=0.85) und c-fos (d16,5: p=0.14; d19: p=0.87) zwischen unbehandelten und Tamoxifen-behandelten Cx43^fl/fl :SM-CreER^T2-Tieren (Abb. 4.1.10). Von denselben Tieren wurde zusätzlich die Konzentration des im Blut zirkulierenden Progesterons bestimmt. Durch Radio-Immuno-Analyse wurden signifikant reduzierte Mengen an Progesteron von Tag 16,5 im Vergleich zum Tag der Geburt in unbehandelten und Tamoxifen-behandelten Cx43^fl/fl:SM-CreER^T2-Weibchen festgestellt (p=0,0003 bzw. p=0,0004). Diese Ergebnisse zeigen, dass Tamoxifen-behandelte Cx43^fl/fl :SM-CreER^T2-Tiere in Bezug auf die Expression der CAP-Gene und den Progesterongehalt nicht von unbehandelten Kontrollen zu unterscheiden sind. Damit kann ausgeschlossen werden, dass der unter Punkt 4.1.2.3 beschriebene Phänotyp auf die Reduktion der Cx43-Expression zurückzuführen ist und nicht mit molekularen Änderungen anderer Art zusammenhängt.

Ergebnisse

Abb. 4.1.10 Quantitative Real-Time PCR-Analyse myometrialer cDNA und Bestimmung des Blut-Progesterongehalts.

Die zeitliche Veränderung des Expressionsniveaus der Kontraktions-assoziierten Protein-Gene A Oxytozin Rezeptor (OTR), B Prostaglandin Rezeptor (FP) und C c-fos von unbehandelten (weiße Balken) und Tamoxifen-behandelten (schwarze Balken) Cx43^fl/fl:SM-CreER^T2-Mäusen wurde als Verhältnis der Expressionsstärke des jeweiligen Gens zur Expression der 18S-RNA dargestellt. D Die Menge des im Blut zirkulierenden Progesterons wurde durch Radio-Immuno-Analyse bestimmt. Alle Proben wurden von Mäusen an Tag 16 zwischen 10.00 und 10.30 Uhr und während der Geburt gewonnen. Die Daten sind als ± SEM (n = 5) dargestellt.

4.1.3 Überprüfung der SM-CreER

-vermittelten Deletion in glatten