3. Methoden
3.4 Nukleinsäure-Analysen
3.4.1 Die Polymerase-Kettenreaktion
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) dient der Vervielfältigung von spezifischen DNA-Sequenzen. Da als Ausgangsmaterial theoretisch ein einzelnes DNA-Molekül mit der Zielsequenz genügt, eignet sich diese Methode zum Nachweis spezifischer DNA-Sequenzen in einem heterogenen Nukleinsäuregemisch. Für weitere theoretische Grundlagen sei auf Dieffenbach und Dveksler (1995) verwiesen.
Die angegebene MgCl2-Lsg. (25 mM), der PCR-Puffer (10x) und die Taq-Polymerase (5 U/µl) stammten von der Firma Promega. Die dNTP-Lösung (Hybaid-AGS) hatte eine Konzentration von 2 mM bzw. 10 mM, die spezifischen Oligonukleotide wurden in der Konzentration von 25 pmol/µl eingesetzt. Alle Reaktionsansätze wurden mit 50 µl Mineral-Öl (Sigma) überschichtet. Nach Beendigung des PCR-Programmes wurden die Proben gelelektrophoretisch analysiert. In den jeweiligen PCR-Rezepten sind die Namen der Oligonukleotide kursiv geschrieben, die Sequenzen sind unter 2.11 aufgeführt.
a) Cx43fl-neu PCR
Reaktionsansatz: Reaktionsprogramm:
DNA 2 µl Temperatur Dauer [min] Zyklen
43delforw 1 µl 94°C 4 1
UMPR 1 µl 94°C 2
PCR-Puffer 2,5 µl 65°C 1 25
MgCl2 2 µl 72°C 1,5
dNTPs (2 mM) 1,5 µl 72°C 10 1
Taq-Polymerase 1 µl
A. bidest 14 µl
Diese PCR liefert im heterozygoten Cx43fl/+-Zustand ein Cx43-Wildtyp-Amplikon bei 500 bp und ein Cx43fl-Amplikon bei etwa 630 bp.
Methoden b) 2lox43 PCR
Reaktionsansatz: Reaktionsprogramm:
DNA 1 µl Temperatur Dauer [min] Zyklen
43twoloxforw 1 µl 94°C 4 1
43delrev 1 µl 92°C 1
PCR-Puffer 2,5 µl 65°C 0,75 28
MgCl2 1,5 µl 72°C 0,75
dNTPs (2 mM) 2 µl 72°C 10 1
Taq-Polymerase 0,5 µl A. bidest 15,5 µl
Diese PCR lieferte den Nachweis der selektiven Deletion der loxP-markierten tk/neo-Selektions-cassette eines Cx43fl-Allels (PCR-Amplikon: 420 bp), bei der die Sequenz der loxP-markierten Cx43-kodierenden Region im Locus erhalten bleibt (Theis et al., 2001).
c) PCR zum Nachweis der (spezifischen) Cre-Rekombinase in transgenen Mäusen
Reaktionsansatz: Reaktionsprogramm:
DNA 1 µl Temperatur Dauer [min] Zyklen
IntCre-rev 0,2 µl 94°C 5 1
up-* 0,2 µl 94°C 1
PCR-Puffer 2,5 µl 60°C 1 40
MgCl2 2 µl 72°C 2
dNTPs (10 mM) 0,2 µl 72°C 10 1
Taq-Polymerase 0,5 µl A. bidest 18,4 µl
Ein vorhandenes Amplikon zeigt die Anwesenheit der kodierenden Region der (spezifischen) Cre-Rekombinase im Genom der transient transfizierten HM1 ES-Zellen oder der untersuchten Mäuse an.
* IntCre: Amplikon von etwa 420 bp für alle Cre-Transgene (Interne Cre-PCR) Nestin: Amplikon von etwa 600 bp spezifisch für das Nestin-Cre Transgen pgk1: Amplikon von etwa 500 bp spezifisch für das PGK-Cre Transgen
d) PCR zum Nachweis der Flp-Rekombinase in transgenen Mäusen
Reaktionsansatz: Reaktionsprogramm:
DNA 1 µl Temperatur Dauer [min] Zyklen
USP Flp 0,2 µl 96°C 5 1
DSP Flp 0,2 µl 95°C 0,5
PCR-Puffer 2,5 µl 68°C 1 35
MgCl2 2 µl 72°C 1,5
dNTPs (10 mM) 0,2 µl 72°C 10 1
Taq-Polymerase 0,5 µl A. bidest 18,4 µl
Ein Amplikon von etwa 1,2 kb zeigt die Anwesenheit der kodierenden Region der Flp-Rekombinase im Genom der untersuchten Mäuse an.
Methoden e) Cx43eGFP PCR
Reaktionsansatz: Reaktionsprogramm:
DNA 1 µl Temperatur Dauer [min] Zyklen
Cx43rev2 1 µl 95°C 5 1
EGFP3B 1 µl 95°C 0,5
PCR-Puffer 2,5 µl 69°C 2 35
MgCl2 2 µl 72°C 1
dNTPs (2mM) 2 µl 72°C 10 1
Taq-Polymerase 1 µl
A. bidest 14,5 µl
Ein Amplikon von etwa 1,9 kb zeigt die Anwesenheit der kodierenden Region des Cx43- und eGFP-Reportergens in Cx43TetOeGFP-Mäusen.
f) CaMKII-tTA PCR
Reaktionsansatz: Reaktionsprogramm:
DNA 1 µl Temperatur Dauer [min] Zyklen
Tet23 1 µl 94°C 3 1
Tet27 1 µl 94°C 0,5
PCR-Puffer 2,5 µl 55°C 0,5 35
MgCl2 2 µl 72°C 1
dNTPs (2mM) 2 µl 72°C 10 1
Taq-Polymerase 1 µl
A. bidest 14,5 µl
Ein Amplikon von etwa 220 bp zeigt die Anwesenheit der kodierenden Region des CaMKII! -tTA-Transgens im Genom der untersuchten Mäuse.
g) TetO-lacZ PCR
Reaktionsansatz: Reaktionsprogramm:
DNA 1 µl Temperatur Dauer [min] Zyklen
F 1 µl 94°C 2 1
B 1 µl 94°C 0,75
PCR-Puffer 2,5 µl 53°C 0,5 35
MgCl2 3,5 µl 72°C 1
dNTPs (2mM) 1 µl 72°C 10 1
Taq-Polymerase 1 µl
A. bidest 14,5 µl
Ein Amplikon von etwa 410 bp zeigt die Anwesenheit der kodierenden Region des TetO-lacZ-Transgens.
Methoden h) delta-Neo PCR
Reaktionsansatz: Reaktionsprogramm:
DNA 1 µl Temperatur Dauer [min] Zyklen
E3rev 0,2 µl 94°C 5 1
E3forw 0,2 "l 94°C 1
neo 0,2 µl 70°C 2 35
PCR-Puffer 2,5 µl 72°C 1
MgCl2 2 µl 72°C 10 1
dNTPs (2mM) 1 µl
Taq-Polymerase 0,5 µl A. bidest 17,4 µl
Ein Amplikon von etwa 550 bp zeigt die Anwesenheit der Neomycin-Selektionskassette an, ein Amplikon von 850 bp das Fehlen dieser Region in Cx45KI36-Mäusen.
i) Cx45flox PCR
Reaktionsansatz: Reaktionsprogramm:
DNA 1 µl Temperatur Dauer [min] Zyklen
E3rev 0,2 µl 94°C 4 1
I5FCfor 0,2 µl 94°C 2
PCR-Puffer 2,5 µl 67°C 1 35
MgCl2 2 µl 72°C 1
dNTPs (10 mM) 0,1 µl 72°C 10 1
Taq-Polymerase 0,5 µl A. bidest 18,5 µl
Ein Amplikon von etwa 500 bp zeigt die Anwesenheit des Wildtyp Cx45-Locus, ein Fragment von 600 bp den gefloxten Cx45-Locus und ein 650 bp großes Amplikon den Cx45KI36-Locus an.
3.4.2 RT-PCR-Analysen
Die RT-PCR dient zum Nachweis von Transkripten. Bei dieser Methode wird mRNA in vitro mit Hilfe des Enzyms Reverse Transkriptase (aus dem Moloney Murine Leukemia Virus) in cDNA umgschrieben und als Matrize für eine spezifische PCR Reaktion eingesetzt.
3.4.2.1 Reverse Transkription zur cDNA-Herstellung
Nach der Aufreinigung von Gesamt-RNA aus Gewebe (siehe 3.1.9) wurde die RNA mit Hilfe von Oligo-dT Startermolekülen revers transkribiert. Hierzu wurde zuerst ein Ansatz von 2 µl Gewebe-RNA (5 µg/µl) und 1 µl Oligo-dT (0,5 "g/"l) auf 12 µl mit DMPC-H2O aufgefüllt. Der Ansatz wurde für 10 min bei 70°C denaturiert und anschließend für 2 min auf Eis abgekühlt. Für die reverse Transkription wurden dann 1 "l dNTPs (je 10 mM), 4 "l 5x Puffer, 2 "l DTT (0,1
Methoden M), 1 "l RNasin (40 U/"l) und 1 "l Superscipt II Reverse Transkriptase (200 U/"l) zugefügt.
Nach der reversen Transkription für 50 min bei 42°C wurde der Ansatz für 15 min bei 70°C denaturiert. Die so gewonnene cDNA konnte bei -70°C gelagert werden.
3.4.2.2 PCR zur Amplifikation umgeschriebener RNA
Bei allen im Folgenden beschriebenen PCRs handelt es sich um Temperatur-Erniedrigungs-PCRs. Durch stetiges Erniedrigen der Anlagerungstemperatur der Startermoleküle pro Zyklus um ein Grad werden unspezifische Bindungen verhindert. Um eine Amplifizierung von genomischer DNA auszuschließen, wurden Ansätze mit (wenn möglich) intronüberspannenden Startermolekülpaaren gewählt.
a) PCR zur Amplifikation von Cx36
Reaktionsansatz: Reaktionsprogramm:
cDNA 1 µl Temperatur Dauer [min] Zyklen
Cx36 USP 5 µl 94°C 3 1
Cx36 DSP 5 µl
PCR-Puffer 5 µl
MgCl2 3 µl
94°C 65°C&55°C
72°C
1 1 2
10
dNTPs 2 µl
Taq-Polymerase 1 µl
A. bidest 28 µl
94°C 55°C 72°C
1 1 2
25
72°C 7 1
Das amplifizierte intronüberspannened cDNA-Fragment hat eine Größe von 448 bp.
b) PCR zur Amplifikation von LacZ
Reaktionsansatz: Reaktionsprogramm:
cDNA 1 µl Temperatur Dauer [min] Zyklen
LacZ DSP 5 µl 94°C 3 1
LacZ USP 5 µl
PCR-Puffer 5 µl
MgCl2 3 µl
94°C 65°C&55°C
72°C
1 1 2
10
dNTPs 2 µl
Taq-Polymerase 1 µl
A. bidest 28 µl
94°C 55°C 72°C
1 1 2
25
72°C 7 1
Das amplifizierte cDNA-Fragment hat eine Größe von 430 bp.
Methoden
c) PCR zur Amplifikation von Aktin
Reaktionsansatz: Reaktionsprogramm:
cDNA 1 µl Temperatur Dauer [min] Zyklen
Aktin USP 5 µl 94°C 3 1
Aktin DSP 5 µl
PCR-Puffer 5 µl
MgCl2 3 µl
94°C 65°C&55°C
72°C
1 1 2
10
dNTPs 2 µl
Taq-Polymerase 1 µl
A. bidest 28 µl
94°C 55°C 72°C
1 1 2
25
72°C 7 1
Die Amplifikation der "-Aktin cDNA ermöglicht einen Abgleich der einzelnen PCR-Reaktionen und dient gleichzeitig, aufgrund der intronübrespannenden Startermoleküle, einer Überprüfung auf genomische DNA. Das amplifizierte cDNA-Fragment hat eine Größe von 243 bp, das Fragment aus genomischer DNA eine Größe von 330 bp.
3.4.2.3 Real-Time RT-PCR zum quantitativen Abgleich von Transkriptmengen
In Zusammenarbeit mit Dr. Oksana Shynlova und Prudence Tsui aus der Arbeitsgruppe von Prof. S. J. Lye (Toronto) wurden cDNA-Proben aus Uterusgewebe auf das Expressionsniveau verschiedener Kontraktions-abhängiger Proteingene untersucht. Alle hierzu verwendeten Startermoleküle wurden anhand von GenBank-Sequenzen (http://www2.ncbi.nlm.nih.gov/) abgeleitet und von ACGT (Toronto, Ontario, Kanada) synthetisiert. Die RT-PCR wurde in einer lichtdurchlässigen 96-Loch-Platte mit dem „ABI PRISM 7900 HT Sequence Detection System“
(Applied Biosystems) und dem SYBR Green Farbstoff durchgeführt. Das verwendete Protokoll war wie folgt: Denaturierung bei 95°C für 10 min, 40 Amplifikations-Zyklen bei 95°C für 15 sec und 60°C für 1 min. Dabei wurde der Schwellenwert der Reaktion (Ct) für jede Probe aufgenommen. Jede Probe wurde dreimal untersucht und der Mittelwert der drei Ct-Werte berechnet. Im Anschluss wurde die relative Bestimmung der Genexpression durchgeführt, um mögliche Expressionsunterschiede festzustellen. Die arithmetische Formel zur vergleichenden Ct-Wert-Bestimmung findet sich im „ABI User Bulletin #2“. Die mRNA-Menge jeder Probe wurde mit der Menge der ribosomalen 18S mRNA abgeglichen, um die relative Genexpression abschätzen zu können.
Methoden