Ausblick

6.1 Weitere Anwendungen der zelltypspezifischen Inaktivierung von Connexinen in viszeralen Glattmuskelzellen

Im Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass neben Cx43 nur Cx45 als weiteres Connexin der viszeralen Muskulatur des Maus-Darms exprimiert wird. Da Tamoxifen-behandelte Cx43^fl/fl ;SM-CreER^T2-Tiere eine Reduktion des gastrointestinalen Transports und eine veränderte Kontraktilität der intestinalen Muskulatur aufwiesen, jedoch keine schwerwiegende Einschränkung der gesamten gastrointestinalen Funktion auftrat, sollte überprüft werden, ob ein gleichzeitiges Ausschalten von Cx43 und Cx45 den bisherigen Phänotyp verändert. Die Glattmuskel-spezifische Deletion des Cx45-Gens führte, ähnlich wie der Verlust der Cx43-vermittelten Kopplung, zu einer Verlängerung der Darmpassage (S. Maxeiner, persönliche Mitteilung). In Tamoxifen-behandelten Cx43^fl/fl/Cx45^fl/fl: SM-CreER^T2-Tieren könnte mit Hilfe der etablierten und in dieser Arbeit vorgestellten Methoden sowie in Zusammenarbeit mit den Arbeitsgruppen von Prof. J. Kalff (Bonn) oder Prof. G. Pfitzer (Köln) die koordinierte Funktion von Connexinen in der Muskulatur des gastrointestinalen Systems untersucht werden. Dabei sollte ein additiver Phänotyp erwartet werden, der zu weiteren Einschränkungen der Darmmotilität führt. Ähnlich wie von Kito und Suzuki (2003) beschrieben, könnte mit Hilfe von Farbstoffinjektionen in Glattmuskelpräparate des Darms zusätzlich der Kopplungsverlust auf Zellebene untersucht werden. Dabei kann je nach Positionierung der von Mucosa und Submucosa befreiten Tunica muscularis zwischen dem Kopplungsverhalten der zirkulären sowie der longitudinalen Muskelschicht unterschieden werden. Der Darm der Maus bietet daher die Möglichkeit, eindeutig zwischen Connexin-vermitteltem Einfluss und anderen Faktoren hinsichtlich der intestinalen Muskelkontraktion zu differenzieren.

Im Uterus würde die Untersuchung der oben genannten Tiere wahrscheinlich zu keiner Veränderung des Geburtsverhaltens führen, da die Expression des Cx45-Gens vor der Geburt durch hormonelle Regulationsmechanismen erniedrigt wird. Für Cx40 wurde eine solche Regulation bisher nicht beschrieben. Daher wäre es interessant, zunächst das Expressionsprofil dieses Connexingens im Myometrium der Maus vor und während der Schwangerschaft sowie

während der Geburt zu untersuchen. Außerdem könnten Tiere des Genotyps Cx40^-/-/Cx43^fl/fl:SM-CreER^T2 erzeugt und nach Tamoxifen-Behandlung auf mögliche

Veränderungen des Geburtsverhaltens überprüft werden.

Ausblick

6.2 Weiterführende Untersuchungen zur neuronalen Expression von Cx43

In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass Cx43 Neuronen-spezifisch im Gehirn adulter Mäuse exprimiert werden kann. Die verwendeten Cx43^TetOeGFP:CaMKII"-tTA-Tiere zeigten neben verhaltensspezifischen Veränderungen und einer verstärkten Epilepsieneigung auch Änderungen der neuronalen Zytoarchitektur. Da eine Beeinflussung des zellulären Wanderungsverhaltens durch die Ausprägung des Cx43-Gens gezeigt wurde (Huang et al., 1998; Perez Velazquez et al., 1996; Fushiki et al., 2003), erscheint es möglich, dass die beschriebenen histologischen Änderungen des Hippocampus transgener Tiere durch die neuronale Expression des Cx43-Gens von der Neurogenese bis zum Adultstadium mit bedingt werden könnten.

Um diese Hypothese zu überprüfen, könnten die Gehirne prä- und postnataler Cx43^TetOeGFP:CaMKII"-tTA-Tiere präpariert und die Verteilung der eGFP-positiven Neurone mit dem bekannten Muster der neuronalen Migration verglichen werden (Marín und Rubenstein, 2003). Im postnatalen Tier kann die Wanderung neu gebildeter postmitotischer Neurone gut anhand des Rostalen Migratorischen Stroms von der Subventrikularzone zum Riechkolben untersucht werden. Dazu könnten Matrigel-Kulturen von Explantaten der Subventrikularzone junger Mäuse angelegt und das Migrationsverhalten der Zellen bestimmt werden (Wichterle et al., 1997; Hack et al., 2002).

Die Auswirkung der Cx43-Expression in adulten olfaktorischen Neuronen könnte durch verhaltensbiologische Untersuchungen in Zusammenarbeit mit Dr. Ekrem Dere (Düsseldorf) durchgeführt werden. Dabei wäre interessant, ob die Kopplung von olfaktorischen Körnerzellen, für die eine Expression von Cx36 beschrieben wurde (Kosaka et al., 2005; Degen et al., 2004), durch die Ausprägung von Cx43 beeinflusst und das Riechvermögen der Tiere verändert wird.

Anhand weiterer Phosphorylierungsstudien an Neuronen könnte überprüft werden, in wieweit Kinasen zur postulierten Kopplungsregulation transgener Neurone beitragen. Dazu könnten neuronale Zellkulturen aber auch frisch kultivierte hippocampale Dickschnitte verschiedenen Alters metabolisch mit ³²P-Orthophosphat markiert werden. So könnte überprüft werden, ob sich die Menge an phosphoryliertem Cx43-Protein altersabhängig ändert. Zur Untersuchung der verantwortlichen Kinase könnten die Zellen bzw. Schnitte mit aktivierenden (z.B. TPA für die Proteinkinase C oder cAMP für die Proteinkinase A) bzw. hemmenden Substanzen (Staurosporin als allgemeiner Hemmer der Kinaseaktivität oder spezifischere Chemikalien zur Hemmung einzelner Kinasen) eingesetzt werden. Dadurch könnte der für die postulierte Phosphorylierung verantwortliche Kinasetyp bestimmt werden. Ähnliche Ergebnisse könnten auch durch Immunoblot-Analysen erzielt werden, in denen Gehirnlysate von Tieren unterschiedlichen Alters auf die Expressionsstärke verschiedener Kinasen untersucht würden. Zusätzlich könnte durch

Ausblick Farbstoffinjektionen in Zellkulturen geprüft werden, ob die Aktivierung bestimmter Kinasen und die dadurch erfolgte Cx43-Phosphorylierung tatsächlich die interzelluläre Kopplung beeinflusst.

Für eine genauere Charakterisierung des epileptischen Phänotyps sollten elektrophysiologische Untersuchungen an hippocampalen Dickschnitten durchgeführt werden. Hierbei könnte überprüft werden, ob durch (axonale) Gap Junction-vermittelte Kopplung oszillatorische Veränderungen des Elektroenzephalogramms hervorgerufenen werden, die die Ausprägung epileptischer Anfälle begünstigen könnten. Mit ersten Untersuchungen dieser Art wurde bereits von der Arbeitsgruppe um Prof. A. Draguhn (Heidelberg) begonnen.

Da Cx43 im adulten Skelettmuskel, ähnlich wie in den meisten Neuronen nicht exprimiert wird (Araya et al., 2004), besteht eine weitere Anwendungsmöglichkeit der Cx43^TetOeGFP-Tiere in der Untersuchung der funktionellen Cx43-Regulation während der Skelettmuskeldiffernzierung und -regeneration. Dazu wurden Cx43^TetOeGFP-Mäuse mit Tieren verpaart, die das tTA-Protein unter der Kontrolle des Muskel-spezifischen Creatin-Kinase-Promotor exprimierten (MCK-tTA;

Ghersa et al., 1998). Diese Tiere werden momentan von Julia von Maltzahn (Bonn) untersucht.

6.3 Charakterisierung der Cx45KI36-Mauslinie

Für die weitere Charakterisierung der Cx45KI36-Linie bieten sich besonders Untersuchungen mit neuronalem Bezug an. Aufgrund der vorläufigen Ergebnisse zur retinalen Signalübertragung sollten weitere ERG-Messungen durchgeführt werden, um die physiologische Relevanz homotypischer Kanäle zwischen AII Amakrin- und ON-Zapfen Bipolarzellen zu überprüfen.

Da im Rahmen dieser Arbeit histologische Veränderungen enterischer Neurone von Cx45KI36^fl/fl:Nestin-Cre-Tieren gezeigt wurden, könnten genauere Untersuchungen Aufschluss darüber geben, warum Cx36 offenbar im Auerbach-Plexus embryonaler Mäuse vorhanden ist, im adulten Tier jedoch nicht mehr exprimiert wird (Degen, 2004). Weiter könnte geklärt werden, zu welchen Auswirkungen eine Ausprägung dieses Connexin-Proteins (anstelle von Cx45) in enterischen Neuronen führt. Zur Untersuchung möglicher Änderungen von Motilität und Kontaktion könnte auf die in dieser Arbeit etablierten Techniken zurückgegriffen werden.

Weitere zukünftige Charakterisierungen sollten sich zudem mit der Aufklärung der embryonalen Letalität homozygoter Cx45KI36^ki/ki-Mäuse befassen. Bisher wurde nicht untersucht, ob diesem Phänotyp ähnliche Ursachen zugrunde liegen wie für Cx45-defiziente Mäuse beschrieben (Kumai et al., 2000; Krüger et al., 2000). Daher wären histologische Untersuchungen des embryonalen Herzens nötig. Weiter könnte an lebensfähigen heterozygoten Cx45KI36^ki/+

Ausblick Mäusen sowie Tieren mit homozygotem Herz-spezifischem Austausch des Cx45- gegen das Cx36-Protein (Cx45KI36^fl/fl:MyHC-Cre) überprüft werden, ob elektrophysiologische Änderungen der Reizweiterleitung festzustellen sind (beispielsweise in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe um PD Dr. K. Tiemann, Bonn). Dies könnte möglicherweise auch Rückschlüsse auf den Grund der embryonalen Letalität erlauben.

Zusammenfassung