Die Expression des Cx43 TetOeGFP -Transgens ist induzierbar und Neuronen-spezifisch

Diskussion

5.3 Untersuchungen zur induzierbaren, Neuronen-spezifischen

Diskussion lacZ:CaMKII"-tTA erzielt, die unter der Kontrolle des CaMKII"-tTA-Transgens das LacZ-Reportergen Neuronen-spezifisch exprimierten (vgl. Abb. 4.2.5). Obwohl von Burgin et al.

(1990) eine starke Aktivität des CaMKII"-Promotors in „neuronalen Zellen“ des Vorderhirns nachgewiesen wurde, zeigten neuere Untersuchungen, dass die Kinase nur in exzitatorischen, nicht-GABAergen Neuronen (Ochiishi et al., 1998; Benson et al., 1991), jedoch nicht in inhibitorischen Neuronen oder Astrozyten (Vallano et al., 2000) exprimiert wird. Weiter scheint die Expression der CaMKII"-Kinase auf postmitotischen Neurone beschränkt zu sein (Bayer et al., 1999). Daher ist das unterbrochene Expressionsmuster des Cx43^TetOeGFP-Transgens im Cortex oder Striatum erwartungsgemäß. Im Hippocampus ist diese von der Schnitttiefe - und damit nur unter Umständen vom angeschnittenen Zelltyp - abhängige Ausprägung jedoch überraschend.

Möglicherweise hängt dies mit dem verwendeten Promotor-Fragment des CaMKII"-tTA-Transgens zusammen (Mayford et al., 1996), da gezeigt wurde, dass die zelltypspezifische Expression des Transgens von weiteren regulatorischen Elementen außerhalb des gewählten Promotor-Fragments abhängen kann (Li et al., 1996). Aufgrund dessen kann es zu einer heterogenen, episodischen Expression innerhalb eines Gewebes kommen (Regan et al., 2000;

Kühbandner et al., 2000). Dies gilt sowohl für das CaMKII"-tTA- als auch für das Cx43^TetOeGFP -Transgen.

Einen weiteren Erklärungsansatz liefert das bidirektionale Tet-Operator-Konstrukt, das für die Expression des Cx43- und eGFP-Gens eingesetzt wurde. Die CMV-Minimalpromotoren, die beidseitig der Tet-Operatorsequenz angeordnet sind, zeichnen sich durch unterschiedliche Sequenzen und Längen aus (Baron et al., 1995). Das längere CMV-Minimalpromotor-Fragment steuert im Fall des Cx43^TetOeGFP-Transgens die Expression von Cx43, das kürzere Fragment die Transkription des eGFP-Reportergens (Döring, 2000). Es wäre also möglich, dass nur die Expression des eGFP-Proteins in einigen Zellen zu schwach ist, um nachgewiesen zu werden, das Expressionsniveau des Cx43-Transgens jedoch höher liegt.

5.3.2 Die Expression des Cx43

-Transgens führt zu einer alters-abhängigen interzellulären Kopplung von Neuronen

In Kopplungsanalysen an kultivierten Neuronen und hippocampalen Dickschnitten wurde gezeigt, dass ein Farbstofftransfer, vermittelt durch transgene Cx43-Kanäle, stattfinden kann.

Dabei wurde in hippocampalen Dickschnitten beobachtet, dass diese Kopplung altersabhängig reguliert zu werden scheint: Nur in Neuronen 22-28 Tage alter Tiere, nicht aber 41-48 Tage nach der Geburt, wurde ein Farbstofftransfer beobachtet. Dieser fand in jungen Cx43^TetOeGFP:CaMKII"-tTA-Tieren in 67% der erfolgreich injizierten Neurone, in Kontrolltieren

Diskussion in 17% der injizierten Zellen statt (vgl. Abschnitt4.2.3.2). Mehrere Arbeitsgruppen zeigten in Kopplungsexperimenten am Rattencortex, dass Neurone während der ersten 7-14 Tagen der postnatalen Entwicklung eine starke Kopplung aufweisen (58-44%), die jedoch vom achtzehnten Tag nach der Geburt bis zum Adultstadium abnimmt (20-25%) (Connors et al., 1983; Peinado et al., 1993 a, b; Rörig et al., 1996; Bittmann et al., 2002). Dabei konnte in 50% der koppelnden Pyramidenneurone von P7-Tieren eine Cx43-Immunreaktivität nachgewiesen werden (Bittmann et al., 2002). Der in den Untersuchungen dieser Arbeit gezeigte Umfang der neuronalen Kopplung von P22-28 Wildtyp-Tieren stimmt somit mit den Ergebnissen anderer Analysen überein. Allerdings wurde in der Ratte kein vollständiger Verlust des interzellulären Farbstofftransfers beschrieben, so wie er in dieser Arbeit für Kontroll-Mäuse gezeigt wurde. Da auch für adulte Meerschweinchen ein anderer neuronaler Kopplungsgrad von 44% beschrieben wurde (Gutnick und Prince, 1981), könnte dies mit Spezies-spezifischen Unterschieden zusammenhängen. Warum allerdings in älteren transgenen Cx43^TetOeGFP:CaMKII"-tTA-Tieren die Kopplung zurückgeht, ist damit nicht zu begründen.

Eine mögliche Erklärung dafür könnte in der posttranslationalen Modifikation des transgenen Cx43-Proteins liegen. Durch Immunoblot-Analysen wurde gezeigt, dass nach der dritten postnatalen Woche eine verstärkte Phosphorylierung des hippocampalen Cx43-Proteins von Cx43^TetOeGFP:CaMKII"-tTA-Tieren, nicht aber von gleichaltrigen Kontroll-Geschwistertieren auftritt (vgl. Abb. 4.2.12). In früheren Untersuchungen wurde gefunden, dass die carboxyterminale Domäne des Cx43-Proteins zahlreiche Phosphorylierungsstellen für verschiedene Proteinkinasen aufweist (Musil et al., 1990). Neben dem Verschluss der Kanalpore (Kim et al., 1999; Lampe et al., 2000) wird über Phosphorylierungen auch die Halbwertszeit des Cx43-Proteins beeinflusst (Musil et al., 2000; Übersicht in: Moreno, 2005). Daher ist es möglich, dass die für das Neuron „anormale“, durch eine zelluläre Transkriptionskontrolle nicht zu regulierende Cx43-Transgen-vermittelte Kopplung, durch Phosphorylierungen beeinflusst wird.

Auf diese Weise könnte der gleiche, nämlich entkoppelte Zustand, ermöglicht werden, der im adulten Wildtyp-Tier vorliegt. Die Verzögerung im Phosphorylierungsbeginn könnte eventuell mit regulativen Faktoren zusammenhängen, die mit der Reifung der Zelle exprimiert werden und erst dann zur Aktivierung verschiedener Kinasen führen könnten.

Andererseits wurde gezeigt, dass Farbstofftransfer und elektrische Kopplung nicht unbedingt korrelieren müssen: Hammer und Sheridan (1978) wiesen an Acinar-Zellen der Speicheldrüse der Ratte nach, dass das gleichzeitige Vorhandensein elektrischer Kopplung und des interzellulären Transfers von Farbstoffmolekülen nicht auf alle Zellen zutraf, elektrische Kopplung allein jedoch in den meisten Zellen zu finden war. Daher könnten auch die Neurone

Diskussion von Cx43^TetOeGFP:CaMKII"-tTA-Tieren die interzelluläre Weiterleitung elektrischer Potentiale, nicht jedoch von Farbstoffen, erlauben.

Neben der oben diskutierten neuronalen Kopplung wurde auch die Möglichkeit des interzellulären Farbstofftransfers zwischen Astrozyten und Neuronen und vice versa überprüft.

Weder in der einen noch in der anderen Richtung konnte eine Kopplung in hippocampalen Dickschnitten gezeigt werden (vgl. Abb. 4.2.11). Da in Cx43^TetOeGFP:CaMKII"-tTA-Tieren das Cx43-Protein sowohl von Astrozyten als auch von Neuronen exprimiert wird, wäre ein Farbstofftransfer zwischen beiden Netzwerken möglich. Das Ausbleiben dieser Kopplung könnte neben der oben diskutierten Phosphorylierungskontrolle auch mit dem folgenden Mechanismus zusammenhängen: Die Integration neu gebildeter Connexone erfolgt bevorzugt abseits von Zellverbindungen. Erst anschließend diffundieren die Halbkanäle lateral in der Plasmamembran und fügen sich in die Außenränder bestehender Gap Junction Plaques ein (Lauf et al., 2002;

Gaietta et al., 2002). Die Ausbildung neuer Gap Junction Plaques ist vermutlich ein kooperativer Prozess, wobei der zeitbestimmende Schritt die Kopplung der ersten Connexone aus benachbarten, aber noch nicht angenäherten Membranen ist (Valiunas et al., 1997). Eine Erleichterung des Prozesses über Wechselwirkungen mit Proteinen der Zelladhäsionskontakte wie E- oder N-Cadherin (Fujimoto et al., 1997; Wei et al., 2005) wird diskutiert. Möglicherweise werden solche Zelladhäsionskontakte zwischen Astrozyten und Neuronen nicht ausgebildet und verhindern somit das Docken der Cx43-Halbkanäle der verschiedenen Zelltypen.

5.3.3 Veränderungen des Verhaltens und der neurochemischen Parameter von Cx43

:CaMKII " -tTA-Tieren

Zur Untersuchung der möglichen Auswirkungen der neuronalen Expression des Cx43^TetOeGFP -Transgens auf neurophysiologische und verhaltensspezifische Aspekte wurden verschiedene Analysen durchgeführt. Dabei wurde gezeigt, dass Cx43^TetOeGFP:CaMKII"-tTA-Tiere eine verstärkte Ängstlichkeit sowie verringerte motorische Lernfähigkeit aufweisen. Im Gegensatz dazu war das Verhalten dieser Tiere in Bezug auf Habituation und Exploration im Offenfeld sowie die Fähigkeit, neue Objekte zu erkennen, normal. Neurochemische Analysen zeigten Veränderungen der Acetylcholin- und Monoamin-Systeme des frontalen Cortex, ventralen Striatums und der Amygdala (vgl. Abschnitt 4.2.4).

Läsionen des medialen präfrontalen Cortex modulieren Angst-assoziiertes Verhalten in Ratten (Lacroix et al., 2000; Sah und Treit, 2003; Rangel et al., 2003). In Nagern wurden Modulationen der Acetylcholin- (Lampera et al., 2000), Noradrenalin- (Mason et al., 1998; Neophytou et al.,

Diskussion 2001), Dopamin- (Dazzi et al., 2001; Thiel und Schwartig, 2001) und Serotonin-Sekretion bzw.

-Gehalts im frontalen Cortex (Hashimoto et al., 1999; Nazar et al., 1999; Langen et al., 2002) in Zusammenhang mit emotionalem Verhalten gebracht. Auch die Amygdala wurde als ausschlaggebend für emotionsgebundene Verhaltensweisen beschrieben (Davies, 1998). Aus diesen Gründen könnten die Veränderungen der Neurotransmitter- und Metabolitenmengen im frontalen Cortex und der Amygdala von Cx43^TetOeGFP:CaMKII"-tTA-Tieren mit der beschriebenen verstärkten Ängstlichkeit zusammenhängen.

Dopaminerge einmündende Neurone der Basalganglien, inklusive des ventralen Striatums, wurden mit der Kontrolle von Bewegungsvorgängen (Groenewegen, 2003) und mit motorischem Lernen (Hikosakka et al., 2002) in Verbindung gebracht. Daher könnten die erhöhten Werte der Dopamin-Metaboliten des ventralen Striatums transgener Mäuse mit der reduzierten motorischen Lernfähigkeit dieser Tiere in Zusammenhang stehen.

Bisher wurde mehrfach ein Zusammenhang zwischen verschiedenen Neurotransmittern und der Regulation der Gap Junction-vermittelten Kopplung gezeigt: So inhibiert z.B. Serotonin den Kopplungsumfang in postnatalen somatosensorischen Neuronen der Ratte (Rörig und Sutor, 1996 a). Auch für Noradrenalin und Dopamin wurde eine Hemmung des Farbstofftransfers in Rattenneuronen gezeigt (Rörig et al., 1995 a, b). Diese Entkopplung wurde mit der Aktivierung verschiedener Proteinkinasen, die den Öffnungszustand von Gap Junction-Kanälen über Phosphoylierungen regulieren, in Zusammenhang gebracht (Übersicht in: Rörig und Feller, 2000). Möglicherweise handelt es sich bei den veränderten neurochemischen Parametern um einen sekundären Effekt der transgenen Cx43-Expression, der den Kopplungsrückgang und damit die Differenzierung des postnatalen Gehirns sicherstellen soll.

5.3.4 Die neuronale Expression des Cx43-Proteins führt zu einer erhöhten