Indirekte serologische Nachweisverfahren

Es gibt eine Vielzahl serologischer Diagnoseverfahren, die MAP-spezifische Antikörper im Serum von infizierten Tieren nachweisen (COLLINS, 1996). Die am meisten verwendeten Tests sind die Komplementbindungsreaktion (KBR), der Agargelimmunodiffusionstest (AGIDT) und der ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Diese drei Tests wurden primär für den Einsatz bei domestizierten Rindern, Schafen und Ziegen entwickelt (MANNING u. COLLINS, 2001). Die Antigenauswahl bei diesen immunbasierten Nachweisverfahren hat einen großen Einfluss auf das Ergebnis (NIELSEN, 2010). MAP hat viele Antigene mit anderen Mykobakterien gemeinsam, die ubiquitär in der Umwelt vorkommen, was zu falsch-positiven Ergebnissen führen kann (OLSEN et al., 2002). MAP-spezifische Antikörper bei serologischen Tests können mit vier Antigenen reagieren: zwei zytosolischen Hitzeschock-Proteinen, der Zellwandkomponente Lipoarabinomannan und Johnin (NIELSEN, 2010).

Die humorale Immunantwort, deren Antikörperbildung die Grundlage zum serologischen Nachweis einer Paratuberkulose-Infektion bildet, entwickelt sich frühstens 10-17 Monate post infectionem, weshalb diese Testverfahren nicht für Tiere, die jünger als 15 Monate alt sind, verwendet werden sollten (RIDEOUT et al., 2003). Die späte Bildung der Antikörper limitiert die Verwendungsmöglichkeiten dieser Diagnostika (COLLINS, 1996). Subklinisch infizierte Tiere haben keine oder nur geringe Spiegel an zirkulierenden Antikörpern (OLSEN et al., 2002). Die Produktion tritt jedoch kurz vor den ersten klinischen Symptomen auf (COLLINS, 1996).

2.6.4.1 KBR

Die Methodik der KBR beruht auf zwei Schritten. Als Erstes kommt es zur Bildung eines Immunkomplexes aus Antigenen und spezifischen Antikörpern, die mit einem Komplementsystem reagieren. Der Verbrauch an Komplementfaktoren wird mithilfe eines hämolytischen Systems sichtbar gemacht, welches den zweiten Testschritt bildet. Bei Anwesenheit der MAP-Antikörper kommt es zu einer

komplementvermittelten Hämolyse der in dem Indikatorsystem enthaltenen Erythrozyten (ROLLE u. MAYR, 2002).

Die KBR war eine der ersten serologischen Tests zum Nachweis von Paratuberkulose (RIDEOUT et al., 2003) und wird heutzutage weitestgehend wegen ihrer geringeren Sensitivitäts- und Spezifitätswerte vom ELISA verdrängt (HOMUTH, 2002). Die KBR kann Serum-Antikörper ein bis fünf Monate später als der ELISA nachweisen (SOHAL et al., 2007). Die Spezifität (99 %) ist geringer als bei den beiden anderen serologischen Nachweisverfahren AGIDT und ELISA (SOHAL et al., 2007). Die Sensitivität wird mit 38,4 % angegeben (RIDEOUT et al., 2003) und liegt damit zwischen dem AGIDT und dem ELISA. Jedoch verlangen trotzdem einige Länder dieses Verfahren bei der Importuntersuchung von Tieren für den internationalen Handel (OIE, 2014). Die KBR kann zur Bestätigung einer Diagnose bei einem infizierten Tier mit klinischen Symptomen eingesetzt werden (HIETALA, 1992). Die KBR wird in Deutschland nicht mehr zur Paratuberkulose-Diagnosik durchgeführt. Laut THÜRINGER VERWALTUNGSKOSTENORDNUNG (2006) kostet die Grundsatzmethodik der KBR 7 € pro Probe.

Dieses Verfahren ist nicht zur Verwendung bei kleinen Wiederkäuern geeignet, da diese Tiere vermehrt kreuzreagierenden Erregern wie Corynebakterien und verwandten Mykobakterien ausgesetzt sind (HIETALA, 1992).

2.6.4.2 AGIDT

Das Testprinzip des AGIDT ist eine einfache Prozedur, die auf Antigen-Antikörper-Präzipitation in halbfestem Agar beruht (STABEL, 1998). Positive Reaktionen werden nach 24-48 Stunden durch ein oder mehrere klar erkennbare Präzipitationslinien sichtbar (OIE, 2014).

Der AGIDT ist ein günstiges und leicht durchzuführendes Diagnoseverfahren zum Nachweis von Paratuberkulose bei Wiederkäuern. Kommerziell erhältliche Testkits für Veterinärpraxen und diagnostische Einrichtungen sind vorhanden (HIETALA, 1992). Serum-Antikörper können drei bis neun Monate nach dem Beginn der fäkalen Erregerausscheidung nachgewiesen werden (HIETALA, 1992). Positive Testresultate korrelieren stark mit dem Vorhandensein klinischer Anzeichen einer MAP-Infektion

und dieses Verfahren ist weniger geeignet für subklinisch infizierte Tiere (RIDEOUT et al., 2003). Die Spezifität beträgt nahezu 100 %, weshalb der AGIDT ein verlässliches Mittel zur Bestätigung einer Diagnose ist (HOMUTH, 2002; OIE, 2014).

Die Sensitivität ist im Vergleich zum ELISA und der KBR jedoch niedriger (RIDEOUT et al., 2003). Für Rinder wird die Sensitivität mit 25 % angegeben (HOMUTH, 2002), jedoch soll diese für kleine Wiederkäuer signifikant höher und sogar über der des ELISA liegen (OIE, 2014). Daher kommt der AGIDT besonders in Kontrollprogrammen für Schafherden in Australien und Südamerika zum Einsatz (HOMUTH, 2002; MANNING u. COLLINS, 2001). In Deutschland findet der AGIDT zum Paratuberkulose-Nachweis keinen Einsatz mehr. Für die Grundsatzmethodik veranschlagt die THÜRINGER VERWALTUNGSKOSTENORDNUNG (2006) 4,20 € pro Probe.

2.6.4.3 ELISA

Der ELISA-Test gilt als „state of the art“-Methode zum serologischen Nachweis von MAP (HOMUTH, 2002) und ist momentan die sensitivste Methode mit der höchsten Spezifität zur Untersuchung bovinen Serums auf MAP-Antikörper (OIE, 2014).

Bei der ELISA-Untersuchung wird das zu testende Serum in eine Mikrotiter-Platte gegeben, dessen Boden mit MAP-Antigen beschichtet ist (OIE, 2014). Sind im Serum MAP-Antikörper vorhanden, bilden diese mit den entsprechenden Antigenen der Testplatte einen Komplex und werden im anschließenden Waschvorgang nicht mit ungebundenem Material entfernt. Durch das Hinzufügen enzymmarkierter Sekundär-Antikörper gegen die im Komplex gebundenen MAP-Antikörper entsteht unter Zugabe eines Substrats eine Färbung, welche eine positive Reaktion anzeigt (ROLLE u. MAYR, 2002; OIE, 2014). Hierbei wird meist das Enzym Peroxidase eingesetzt. Mittlerweile gibt es viele Modifizierungen der ELISA-Technik, deren Hauptunterschiede die verwendeten spezifischen Antigene und das Probenhandling vor der eigentlichen Analyse zur Entfernung unspezifischer Antigene sind (HIETALA, 1992). Durch eine Präabsorption des Testserums mit M. phlei, einem apathogenen Umweltkontaminanten, werden potentiell kreuzreagierende Antikörper entfernt und die Spezifität des ELISA erhöht (STABEL, 1998; HARRIS u. BARLETTA, 2001).

Schätzungen zur Sensitivität und Spezifität variieren stark und die Vielzahl der verwendeten Antigene macht einen Vergleich unterschiedlicher Untersuchungen schwierig (STABEL, 1998). Die Spezifität bei Rindern beträgt 40-100 % (OIE, 2014), meist jedoch 98-99,9 % (HIETALA, 1992). Bei kleinen Wiederkäuern schwankt die Spezifität zwischen 79-100 % (OIE, 2014). Ähnlich wie bei der kulturellen Untersuchung hängt die Sensitivität des ELISA mit dem Stadium der Infektion, dem Grad der Erregerausscheidung mit dem Kot und dem Alter des zu untersuchenden Tieres zusammen (COLLINS, 1996; OIE, 2014). Sie ist bei Tieren mit klinischen Symptomen hoch und zu Beginn einer Paratuberkulose-Infektion sowie während der Anergie in der terminalen Phase niedrig (SOHAL et al., 2007). Bei Rindern rangiert die Sensitivität zwischen 7-94 % (OIE, 2014). Dabei werden in den meisten Studien Werte von 15 % bei subklinisch infizierten Tieren ermittelt. Die Sensitivität bei Tieren mit klinischen Symptomen wird mit 85-87 % angegeben (COLLINS, 1996; CAST, 2001; OLSEN et al., 2002; SOHAL et al., 2007). Die Sensitivität des ELISA bei kleinen Wiederkäuern liegt zwischen 16-100 % (OIE, 2014).

MAP kann mithilfe eines ELISA gleichermaßen aus Serum- wie aus Milchproben bei Rindern und kleinen Wiederkäuern nachgewiesen werden (HARRIS u. BARLETTA, 2001). Jedoch beeinflusst die Milchleistung, die Herdenprävalenz und die Parität eines Tieres signifikant die Konzentration der MAP-spezifischen Antikörper in der Milch und damit die ELISA-Ergebnisse (EISENBERG et al., 2015). Kühe mit einer Parität größer eins können besser mit einem Milch-ELISA identifiziert werden als Primipara. Eine hohe Milchleistung kann in der frühen Infektionsphase zu falsch-negativen Ergebnissen führen. Milchproben sollten mithilfe eines ELISA entweder in der frühen oder späten Laktation untersucht werden (EISENBERG et al., 2015).

Der ELISA für bovine und caprine Milch hat eine ähnliche Spezifität wie ein Serum-ELISA, jedoch ist er weniger sensitiv (OIE, 2014). Ein Milch-ELISA erfasst 12 % weniger infizierte Kühe als ein Serum-ELISA (TIWARI et al., 2006). Bei Rindern schwankt die Sensitivität des Milch-ELISA zwischen 21-61 % und die Spezifität kann 83-100 % betragen (OIE, 2014). Zur Einschätzung der Prävalenz einer Milchviehherde ist ein Einsatz anhand von Tankmilchproben möglich, wobei die Sensitivität 97 % und Spezifität 83 % beträgt (RIDEOUT et al., 2003). Jedoch ist die

Anzahl der infizierten Tiere, die für einen positiven Ausfall des Ergebnisses notwendig sind, nicht bekannt und es kann davon ausgegangen werden, dass eine Herde mit wenigen positiven Tieren nicht erkannt werden würde (RIDEOUT et al., 2003).

In Deutschland sind laut dem Friedrich-Loeffler-Institut (FLI, 2015) fünf ELISA-Testkits zugelassen. Für Serumproben von Rind, Schaf und Ziege sowie boviner Milchproben sind der IDEXX Paratuberculosis Screening Ab Test (Firma IDEXX Europe B.V.), der ID Screen Paratuberculosis indirect (Firma ID Vet), der PARACHEK2 (Firma Life Technologies Lyon) und der Cattletyp MAP Ab (Firma QIAGEN Leipzig) auf dem Markt. Zusätzlich ist der LSIVet Ruminant Paratuberculosis Advanced-Serum (Firma Life Technologies Lyon) für die Untersuchung von bovinen, caprinen und ovinen Serumproben erhältlich.

Bei der Verwendung von kommerziellen Testkits bei Wildspezies muss aufgrund von kreuzreagierenden Antikörpern der Cerviden für diese Tiere eine Rekalibrierung des ELISA erfolgen. Jedoch ist auch ein spezieller IgG1 Antikörper-ELISA für Wildtiere erhältlich (MACKINTOSH u. GRIFFIN, 2010).

Als Vorteile des ELISA sind die kurze Untersuchungszeit von wenigen Stunden bis zum Ergebnis, der geringe Aufwand für eine Probennahme (insbesondere von Milch) sowie die geringen Kosten zu nennen (HIETALA, 1992; TIWARI et al., 2006). Beim LUFA Nord-West ist mit einer Dauer bis zum Vorliegen des Ergebnisses von ein bis zwei Tagen zu rechnen und es werden Kosten von 7-8,50 € pro Probe veranschlagt (persönliche Mitteilung von Frau S. Amelung, Oldenburg am 01.02.2016).

ELISA-Ergebnisse sollten mit Vorsicht interpretiert werden. Bedingt durch die Verzögerung zwischen Infektion und Entwicklung einer humoralen Immunantwort ist die Sensitivität niedriger als bei Kotkulturen (TIWARI et al., 2006). Des Weiteren muss bei Kühen, die an Tuberkulose erkrankt sind, mit falsch-positiven Ergebnissen gerechnet werden (LILENBAUM et al., 2009).

2.7 Paratuberkulosekontrolle