Immunhistochemisches Färben der Bienengehirne

Die folgende Beschreibung gilt für geschnittene Präparate genauso wie für Ganzhirne.

Einzelne Abweichungen in der Anzahl der Behandlungsschritte, in deren Dauer sowie die jeweiligen Konzentrationen der Lösungen sind in den Färbeprotokollen (siehe 2.5.2) ex-plizit aufgeführt. Das Grundprinzip der Färbungen bleibt gleich.

Der immunhistochemische Färbeprozess beginnt im Anschluss an das Schneiden bzw.

bei Ganzhirnen im Anschluss an die Fixierung mit dem Auswaschen des Fixans. Durch Pufferwanne, gefüllt mit Phosphatpuffer

Probentisch Rasierklinge

Gelatine-Albumin-Blöckchen mit Bienengehirn

Abb. 2.4: Schneiden am Vibratom

mehrmaliges Spülen mit PB (0,1 M Phosphatpuffer) bei Raumtemperatur wird es gründ-lich ausgewaschen. Nachfolgendes analoges Behandeln mit PBT (PB mit Triton X) macht die Membranen der Neurone durchlässiger und damit das zu lokalisierende Antigen bzw.

Protein zugänglich für den Antikörper.

Für die Präinkubation werden entweder zwei bis drei Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C alle unspezifischen Proteine mit Blocking Solution abgeblockt, d. h.

unspezifische Bindungen der Antikörper verhindert. Dazu verwendet man ein Normal-serum aus der Spezies, aus der der sekundäre Antikörper stammt. Ist der Sekundär-antikörper beispielsweise aus der Ziege (engl. goat), dann erfolgt die Präinkubation mit Normal Goat Serum (NGS).

Nach dem Entfernen der Blocking Solution findet der erste Inkubationsschritt mit dem primären Antikörper statt. Die je nach Färbung verwendeten Antikörper sowie die unter-schiedlichen Antikörperkonzentrationen sind den Färbeprotokollen zu entnehmen (2.5.2).

Bei längeren Inkubationszeiten muss durch Zugabe von Natriumazid ein Wachstum von z. B. Bakterien verhindert werden. Die Reaktionszeit richtet sich nach der Dicke der Prä-parate. 60 bis 100 µm dicke Schnitte lässt man mindestens 48 Stunden, ganze Bienen-gehirne vier bis fünf Tage inkubieren. Die Antikörpermenge ist abhängig von der Größe der Probe; das Präparat sollte vollständig in der Reaktionsflüssigkeit eintauchen. Die Mar-kierung erfolgt bei 4°C. Bei dieser Temperatur bind et der Antikörper zwar langsam an sein Antigen, dafür sehr spezifisch. Besser jedoch wären höhere Temperaturen (in der Natur Körpertemperatur). Daher wurden beide Methoden kombiniert: zuerst bei 4°C für 48 Stun-den bzw. vier bis fünf Tage inkubieren, anschließend zwei bis drei StunStun-den bei Raum-temperatur (Helfrich-Förster, 2007b). Parafilm, um den Deckel der Mikrotiterplatte ge-wickelt, verhindert ein Austrocknen der Schnitte während langer Reaktionszeiten.

Vor dem Zufügen des Sekundärantikörpers wird der erste Antikörper mehrmals mit PBT bei Raumtemperatur gründlich ausgewaschen. Der primäre Antikörper kann aufgehoben und mehrmals verwendet werden. Die Spülzeiten richten sich nach der Präparatedicke.

Anschließend findet die zweite Inkubation mit dem Sekundärantikörper statt, der den pri-mären Antikörper erkennt. Stammt der Primärantikörper zum Beispiel aus dem Kaninchen (rabbit), muss der sekundäre Antikörper aus einem anderen Tier, z. B. der Ziege (goat) stammen und gegen primäre „Rabbit“-Antikörper gerichtet sein (er trägt dann die Bezeich-nung „Goat anti-Rabbit“). Die Dauer der Inkubation beträgt bei Schnitten 24 Stunden, bei Ganzhirnen vier bis fünf Tage. Die Inkubation erfolgt bei 4°C, zum Schluss für zwei bis drei Stunden bei Raumtemperatur. Die Proben müssen mit Antikörperlösung bedeckt, mit Natriumazid vor Bakterienwachstum bewahrt und gegen Austrocknung mit Parafilm

um-wickelt werden. Da es sich bei dem sekundären Antikörper um ein fluoreszierendes Rea-genz handelt, muss die Probe vor Licht, z. B. durch Einwickeln mit Aluminiumfolie, ge-schützt werden. Beim Färben von Ganzhirnen werden die „Wholemounts“ während sämt-licher Reaktionszeiten mithilfe eines Taumel Wipptischs hin und her bewegt, damit die Präparate von allen Seiten mit den Lösungen in Kontakt treten. Nach der Inkubation wird überschüssiger fluoreszierender Antikörper mehrmals mit PBT ausgewaschen.

Für die Rekonstruktion des PDF-Netzwerks im Ganzhirn (Exp. 6) muss zur genauen Ori-entierung zusätzlich der Hintergrund (die Neuropile) angefärbt werden. Dazu verwendet man z. B. Luzifer Yellow. Dieses wird für eine weitere Nacht bei 4°C auf dem Schüttler in-kubiert. Anschließend muss überschüssiger Farbstoff gründlich ausgewaschen werden.

Schnittpräparate werden jetzt auf Objektträgern entsprechend ihrer Reihenfolge ausge-richtet und mit Vectashield für die Fluoreszenzmikroskopie eingebettet. Bei längerer Auf-bewahrungszeit sollten die Ränder der Deckgläschen mit Nagellack oder Fixogum zum Schutz vor dem Austrocknen abgedichtet werden. Ganzhirne werden mit einer aufsteigen-den Ethanolreihe entwässert, anschließend mit Benzoesäuremethylester bei 4°C ü ber Nacht aufgeklart und in Permount eingebettet. Die Einbettung der „Wholemounts“ erfolgt zwischen zwei Deckgläsern (Standardstärke Nr. 1: 0,13 bis 0,16 mm dick); Abstandshalter (Heftklammern, die einen Tag vor der Einbettung mit DePeX auf einem der beiden Deck-gläschen festgeklebt wurden) verhindern ein Zusammendrücken des Präparats. Die fertig gefärbten Schnitte bzw. ganzen Bienengehirne werden zum Schutz vor dem Ausbleichen im Dunkeln bei 4°C aufbewahrt.

2.5.1.1 Färbungen zur Oszillation von PDF

Die Tab. 2.3 gibt eine Übersicht über die verwendeten Antikörper und die Versuchs-parameter. Für die Experimente 1 bis 4 kam immer der gleiche Antikörper zum Einsatz, lediglich die Schnittdicke sowie die Konzentration mussten angepasst werden.

Tab. 2.3: Färbeparameter für die Experimente 1 bis 4 zur Oszillation von PDF-Neuronen Schnitte Primärantikörper Sekundärantikörper

Exp. 1 60 µm Rabbit anti-PDH (1:1500) Alexa Fluor 488, Goat anti-Rabbit (1:200) Exp. 2 60 µm Rabbit anti-PDH (1:1500) Alexa Fluor 488, Goat anti-Rabbit (1:200) Exp. 3 100 µm Rabbit anti-PDH (1:3000) Alexa Fluor 488, Goat anti-Rabbit (1:200) Exp. 4 100 µm Rabbit anti-PDH (1:3000) Alexa Fluor 488, Goat anti-Rabbit (1:200) Abk.: PDH = Pigment-Dispersing Hormone

Leider fielen die Färbeintensitäten in den von mir selbst gefärbten Bienengehirnen im zweiten Experiment deutlich stärker aus (die Färbung war mit 255 Pixel gesättigt) als die

in dem früher, nicht von mir gefärbten ersten und halben zweiten Experiment. Dadurch musste erstens die Primärantikörper-Konzentration noch einmal ermittelt, zweitens die Auswertungsmethode in diesen intensiv gefärbten Bereichen angepasst werden (Methode mittels „squares“ in Kapitel 2.7.1.2). Eine erneute Optimierung der Versuchsparameter für die noch folgenden Experimente ergab, dass eine anti-PDH-Konzentration von 1:3000 und eine Schnittdicke von 100 µm ausreichen.

2.5.1.2 Färbungen zur Lokalisation von PER-, TIM- und CRY-Neuronen

Zur Lokalisation weiterer Neurone, die die Proteine PER, TIM und/oder CRY exprimieren, wurde Apis mellifera zu unterschiedlichen Zeitpunkten gewählt und mit aus Israel stam-menden primären Apis-Antikörpern immunhistochemisch gefärbt (Tab. 2.4). Zur zeitlichen Optimierung und zum besseren histologischen Vergleich wurden Mehrfachfärbungen be-vorzugt. Dabei müssen die primären Antikörper aus unterschiedlichen Spezies stammen und die sekundären Antikörper zudem unterschiedliche Absorptions- und Emissions-spektren besitzen.

Tab. 2.4: Färbeparameter zur Lokalisation von TIM-, PER- und CRY-Neuronen (5. Exp.) Färbung (F.) Primärer Antikörper Sekundärer Antikörper

Einfach-F. • Rabbit anti-ApisTIM2 (1:50) • Alexa Fluor 488, Goat anti-Rabbit (1:200) Doppel-F. • Human anti-ApisCRY (1:50)

Sheep anti-ApisPER (1:50)

• Cy^TM 3, Goat anti-Human (1:100)

DyLight^TM 488, Donkey anti-Sheep (1:100) Dreifach-F. • Human anti-ApisCRY (1:50)

Sheep anti-ApisPER (1:50) Rabbit anti-ApisTIM2 (1:50)

• Cy^TM 3, Goat anti-Human (1:100)

DyLight^TM 488, Donkey anti-Sheep (1:100) Alexa Fluor 647, Goat anti-Rabbit (1:200) Dreifach-F. • Human anti-ApisCRY (1:50)

Sheep anti-ApisPER (1:50) Rabbit anti-PDH (1:3000)

• Cy^TM 3, Goat anti-Human (1:100)

DyLight^TM 488, Donkey anti-Sheep (1:100) Alexa Fluor 647, Goat anti-Rabbit (1:200) Einfach- • Sheep anti-ApisPER (1:25) • DyLight^TM 488, Donkey anti-Sheep (1:100) Einfach-F.,

parallel dazu Doppel-F.

• Sheep anti-ApisPER (1:50)

• Sheep anti-ApisPER (1:50) Rabbit anti-PDH (1:3000)

• DyLight^TM 488, Donkey anti-Sheep (1:100)

• DyLight^TM 488, Donkey anti-Sheep (1:100) Alexa Fluor 555, Goat anti-Rabbit (1:200) Abk.: CRY = CRYPTOCHROM; PER = PERIOD; PDH = Pigment-Dispersing Hormone; TIM = TIMELESS.

Die Einfachfärbung mit anti-TIM und die Doppelfärbung mit anti-PER / anti-CRY wurden mit in Paraformaldehyd (4 %) fixierten Proben durchgeführt (Tab. 2.2, S. 28). Da sich bei allen keine gefärbten Neurone nachweisen ließen, wurde der gleiche Versuch – dieses Mal als Dreifachfärbung – mit in Zamboni’s Fixativ behandelten Proben wiederholt. Bei TIM konnte keinerlei Färbung festgestellt werden, so ersetzte man TIM gegen PDF, um zu untersuchen, ob die in dem Bereich der Zellen entdeckten PER-Neurone mit PDF-Neuronen identisch oder verschieden sind. Die Einfachfärbung mit anti-PER sollte zeigen,

ob sich die PER-Neurone auch allein anfärben lassen oder ob es sich um eine Kreuz-reaktion des zweiten Antikörpers handelt.

2.5.1.3 Ganzhirn-Färbungen für die dreidimensionale Rekonstruktion

Für die Rekonstruktion des PDF-Netzwerks in ganzen Bienengehirnen müssen neben den PDF-Neuronen zusätzlich der Hintergrund bzw. die diversen Neuropile gefärbt werden, um die räumliche Lage der Zellen und den Verlauf der Fasern zuordnen zu können. Zu diesem Zweck wurden Luzifer Yellow sowie anti-Synapsin ausprobiert. Ein Versuch, die synaptischen Neuropile wie bei der Schabe (Wei et al. 2010) mit anti-Synapsin zu färben, scheiterte. Möglicherweise war dieser Antikörper, der im Regensburger Labor noch aus früheren Versuchen existierte, zu alt. Letztendlich erfolgte die Färbung der Neuropile mit fluoreszierendem Luzifer Yellow (Stewart, 1978), dessen optimale Konzentration in mehreren Versuchen austariert wurde.

Tab. 2.5: Färbeparameter für die 3D-Rekonstruktion des PDF-Netzwerks im Ganzhirn Primärantikörper Sekundärantikörper / Hintergrund

Rabbit anti-PDH (1:3000) Alexa Fluor 555, Goat anti-Rabbit (1:200) Luzifer Yellow (1:28000)

Ganzhirn

Rabbit anti-PDH (1:3000)

Mouse anti-Synapsin nc82 (1:200)

Alexa Fluor 488, Goat anti-Rabbit (1:200) Alexa Fluor 555, Goat anti-Mouse (1:200) Abk.: PDH = Pigment-Dispersing Hormone

Bei ganzen Gehirnen ist ein Entwässern des Gewebes mit einer aufsteigenden Ethanol-reihe notwendig. Anschließendes Behandeln zuerst mit einer 50:50-Mischung aus Ethanol:Methylbenzoat, dann mit 100 % Methylbenzoat (entspricht

Benzoesäure-methylester) klart das Gewebe auf. Durch diese Prozedur kann später die Lichtquelle des Mikroskops tiefer in das Gehirn eindringen.

Mit dem wasserfreien Einbettmedium Permount wurden die Gehirne zwischen zwei

Standard-Deckgläsern mit aufgeklebten Heftklammern als Abstandshalter eingebettet. Die Deckgläser gewährleisten durch ihre geringe Dicke, dass der Laser beim Scannen durch das Bienengehirn von oben und von unten gleichermaßen durchdringt. Die Abstands-halter verhindern ein Zusammendrücken des Präparates.