Hitzeschockproteine bei Mykoplasmen

1990 wurden erstmals Hsp bei Mykoplasmen beschrieben. Nach Hitzeschockbehandlung von zwei Acholeplasma laidlawii-Stämmen und M. capricolum konnten nach gelelektrophoretischer Auftrennung mittels Autoradiographie abhängig von dem verwendeten Stamm und der Spezies zwischen fünf und elf Hsp nachgewiesen werden.

Eine besonders intensive Verstärkung ließ sich bei dem A. laidlawii Stamm JA1 für Hsp mit einer Molekularmasse von 68 und 75 kDa feststellen. Im Western-Blot unter Verwendung eines Antiserums gegen das Hsp70 (DnaK) von E. coli wurde bei A.

laidlawii nur eine konstitutive Expression und bei M. capricolum lediglich eine leicht verstärkte Synthese von Hsp70 nachgewiesen (DASCHER et al. 1990).

In Untersuchungen an M. pneumoniae, M. genitalium und M. fermentans zur Kreuzreaktivität eines monospezifischen Antiserums gegen das Hsp60 von Legionella micdadei konnte bei allen drei Mykoplasmenspezies eine Proteinbande bei 62 kDa, bei M.

genitalium zusätzlich eine Bande bei 40 kDa und M. fermentans zusätzlich eine Bande bei 30 kDa nachgewiesen werden (S∅NDERGARD-ANDERSEN et al. 1990). Später konnten VONSKY et al. (1992) bei M. fermentans, M. genitalium, M. gallisepticum, M.

pneumoniae und A. laidlawii nach Hitzeschock, Einwirkung von UV-Strahlung und Wasserstoffperoxid im Western-Blot mit polyklonalen Antikörpern gegen humanes Hsp70 und gegen das Hsp65 von Pseudomonas aeruginosa mit Ausnahme von M. fermentans eine konstitutive Synthese von Hsp der Hsp60- und Hsp70-Familien beobachten. Bei A.

laidlawii konnte eine verstärkte Expression nach Hitzeschock festgestellt werden.

In Untersuchungen der eigenen Arbeitsgruppe konnten nach Hitzeschock und radioaktiver Markierung auch bei M. arthritidis, M. bovis, M. hyopneumoniae und M. pulmonis verschiedene Hsp nachgewiesen werden. In Western-Blot-Analysen mit einem Antiserum gegen das Hsp60 von Synecchococcus sp. wurden bei M. arthritidis, M. bovis, M.

fermentans, M. hyopneumoniae und M. pulmonis Proteinbanden von 62 kDa, bei M.

pneumoniae eine Bande von 58 kDa identifiziert. Eine Verstärkung der Expression durch Hitzeschock oder Einwirkung von Wasserstoffperoxid war nicht erkennbar. In weiteren Western-Blot-Analysen mit einem spezifischen Antiserum gegen Hsp70 von M.

pneumoniae wurde bei M. pneumoniae und M. fermentans eine Proteinbande von 64 kDa, bei M. hyopneumoniae und M. pulmonis eine Bande von 68 kDa erkannt. M. arthritidis und M. bovis reagierten nicht mit diesem Antiserum (DEITERS et al. 1994, RUNGE et al.

1998).

Darüberhinaus konnte annähernd das gesamte hsp60-Gen und ein 600 bp großes Fragment des hsp70-Gens von M. arthritidis, M. bovis, M. agalactiae und M. hyopneumoniae mittels PCR amplifiziert und anschließend sequenziert werden. Die Nukleotidsequenz der hsp60-Gene ist innerhalb dieser Mykoplasmenspezies und zwischen den beiden Mykoplasmenspezies M. pneumoniae und M. capricolum zu annähernd 100 % konserviert. Zu der Mykoplasmenspezies mit dem kleinsten Genom, M. genitalium, ist abhängig von der Vergleichs-Spezies ein Konservierungsgrad von lediglich 76,5 bis 77,7

% ermittelt worden. Der Konservierungsgrad der hsp70-Genfragmente betrug fast 100 % zwischen M. arthritidis und M. bovis, und 47 bis 70 % innerhalb der anderen Mykoplasmenspezies. Zu anderen Bakterien bestehen zwischen den hsp60-Genen und den Fragmenten des hsp70-Gens, abhängig vom phylogenetischen Verwandtschaftsgrad, Homologien zwischen 50 bis 63 %.

Weiterhin konnten rekombinante Fusionsproteine mit Teilsequenzen der Hsp60- und Hsp70-Proteine sowie gegen diese gerichtete Antiseren hergestellt werden. Die gegen die rekombinanten Hsp60-Fusionsproteine gebildeten Antiseren reagierten mit dem Hsp60 der oben angeführten Mykoplasmenspezies und anderer Bakterien. Patientenseren von Rindern und Schweinen, die im ELISA eine starke Reaktion mit M. bovis- bzw. M.

hyopneumoniae-Ganzzellantigen zeigten, reagierten ebenfalls mit den rekombinanten Hsp60- und Hsp70-Fusionsproteinen. Weitere Untersuchungen erfolgten anhand eines in vitro-Modells unter Verwendung bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit (BALF) M.

hyopneumoniae-infizierter Schweine und entsprechender Kontrolltiere. Dabei konnte nach Einwirkung der BALF der infizierten Tiere auf M. hyopneumoniae eine im Unterschied zu einem vergleichsweise durchgeführten Hitzeschock weit intensivere Hsp60-Synthese nachgewiesen werden (NIEWINT 1998, SCHERM et al. 1998, SCHERM 1999). In einem

Tierversuch mit Ratten des Inzuchtstammes Lewis konnte durch Immunisierung mit rekombinanten Hsp60-Fusionsproteinen, im Vergleich zu den Kontrolltieren, nach Infektion mit M. arthritidis ein deutlich abgeschwächter Krankheitsverlauf diagnostiziert werden. Die Seren der mit rekombinanten Hsp60 immunisierten Ratten reagierten im ELISA mit nativem Hsp60 von M. arthritidis, welches durch Kationenaustausch- und Immunaffinitätschromatographie isoliert worden war und als Antigen verwendet wurde.

Entsprechenden Untersuchungen an Hsp60 anderer Bakterienspezies folgend konnte eine ATPase-Aktivität der nativen Hsp60 von M. arthritidis und M. bovis nachgewiesen werden (WEDDE 1999, WEDDE et al. 1999).

Angesichts der weltweit steigenden Bedeutung von M. bovis als Krankheitserreger und den damit verbundenen wirtschaftlichen Einbußen gewinnen die Verbesserung der Diagnostik und die Entwicklung einer effektiven Immunprophylaxe immer mehr an Relevanz. Als Voraussetzung hierzu besteht zunächst jedoch die Notwendigkeit der Identifikation geeigneter Antigene.

Bislang liegen nur wenige Erkenntnisse über diejenigen Antigene von M. bovis vor, die im Verlauf einer Infektion durch die wirtseigene Abwehr erkannt werden. In dem Bemühen solche Antigene zu charakterisieren, richtet sich das Hauptaugenmerk verschiedener Arbeitsgruppen v.a. auf variable Oberflächenantigene (variable surface proteins – Vsp) des Erregers, die z.T. immundominant sind (POUMARAT et al. 1994, ROSENGARTEN et al. 1994, YOGEW et al. 1994, BEHRENS et al. 1994, LYSNYANSKY et al 1996, SACHSE et al. 1996, FLITMAN-TENE et al. 1997, BEIER et al. 1998, POUMARAT et al. 1999, BRANK et al. 1999, SACHSE et al. 2000). Einerseits weisen einige dieser Vsp konservierte Epitope auf, deren Stabilität durch Untersuchungen mit Seren natürlich oder experimentell infizierter Rinder bestätigt werden konnte. Andererseits wurde nachgewiesen, daß M. bovis unter dem Druck einer Immunantwort solche Vsp vermindert exprimiert, verkürzt oder auch durch veränderte Vsp ersetzt, die von der wirtseigenen Abwehr spezifisch erkannt werden (LE GRAND et al. 1996). Diese Erkenntnisse lassen Vsp bislang weder als Antigene in diagnostischen Verfahren noch als Bestandteil von Vakzinen geeignet erscheinen.

Zur Zeit liegen noch keine Untersuchungen vor, in denen die Immunantwort M. bovis-infizierter Rinder gegen natives Ganzzell-Antigen gezeigt werden konnte. Lediglich die allgemeine humorale- und zelluläre Abwehr wurden näher beschrieben. Dabei lag das Hauptaugenmerk auf der Untersuchung beteiligter Immunzellen und Antikörperklassen, sowie deren zeitlichem Auftreten im Verlauf einer Infektion (HOWARD u. GOURLAY 1983, HOWARD u. TAYLOR 1983, HOWARD 1983, HOWARD 1984, HOWARD et al. 1986, HOWARD et al. 1987, SILVA u. JAIN 1988, THOMAS et al. 1990). Ziel der vorliegenden Arbeit sollte demnach die Identifikation von M. bovis-Antigenen sein, die durch Seren M. bovis-infizierter Rinder erkannt werden. Dabei sollte insbesondere die Immunantwort gegen das Hsp60 untersucht werden, da dieses Hsp im Gegensatz zu den Vsp einen höheren Grad der Konservierung aufweist und bei anderen bakteriellen Erregern als immundominantes Antigen nachgewiesen wurde; es könnte somit ein geeignetes Antigen für die Diagnosik und als Bestandteil von Impfstoffen darstellen.

3 Material und Methoden