3.2 Methoden
3.2.5 Gesamtzellpräparation von Mycoplasma bovis
Ziel dieser Untersuchung war die Auftrennung der Zellen in Zytosol und Membran zur Überprüfung der subzellulären Lage der Hsp in der Mykoplasmenzelle (löslich oder membranassoziiert). Sie wurde modifiziert nach RAZIN (1983b) durchgeführt.
Von einer sich in der exponentiellen Wachstumsphase (3.2.1) befindenden M. bovis-Kultur wurden 0,3 ml entnommen, 10 min. bei 14000 rpm und 4 °C zentrifugiert und in 2 ml steriles PBS aufgenommen. Dieser Waschschritt wurde zweimal wiederholt. Nun erfolgte die Lyse der erneut in 2,0 ml PBS suspendierten Mykoplasmen.
Dazu wurde vorab die Suspension im Eisbad für 3 min. mit dem Homogenisator behandelt. Anschließend erfolgte der Zellaufschluß mit Ultraschall in 2 bis 3 Schritten à 15 min. (200 W, mittlere Spitze). Zwischen den Ultraschallbehandlungen wurden die Proben bei –20 °C tiefgefroren und zu deren Beginn wieder aufgetaut.
Zur Überprüfung des Erfolgs der Zellyse wurden Wachstumskontrollen auf PH-Agar (3.1.5) angelegt, indem der Agar mit 50 µl des Lysats beimpft und dann für zwei bis drei Tage bei 37 °C in 5 %iger CO2-Atmosphäre bebrütet wurde. Bei noch nachweisbarem Wachstum auf dem Agar mußten sich noch lebende Zellen im Lysat befinden. Die Ultraschallbehandlung wurde in diesem Fall wiederholt.
Jetzt folgte die eigentliche Präparation. Dabei wurde zur Reinigung des Lysats von Zellresten dieses 15 min. bei 4 °C und 3000 x g zentrifugiert. Der Überstand enthielt die Membranen und das Zytoplasma und wurde bei 100.000 x g für 60 min. bei 4 °C zentrifugiert. Der neu vorhandene Überstand repräsentierte die Zytoplasma-Fraktion. Er
wurde dekantiert und bei –70 °C aufbewahrt. Das Pellet wurde nach Resuspendierung in 2 ml sterilem aqua dest. einem weiteren einstündigen Zentrifugationsschritt (4 °C, 100000 x g) unterzogen und der Überstand verworfen. Jetzt wurden 2 ml steriler NaCl-Phosphat-Puffer zugegeben und wie zuvor zentrifugiert. Die beiden letztgenannten Waschschritte wurden in gleicher Reihenfolge wiederholt. Ein abschließender Waschschritt mit 2 ml Aqua dest. unter den vorgenannten Bedingungen schloß sich an. Die so gereinigte Membranfraktion wurde in 1 ml steriles PBS aufgenommen und ebenfalls bei –70 °C aufbewahrt.
Vor der Auftrennung der erhaltenen Fraktionen in der Elektrophorese wurde der Proteingehalt der Proben mit der BRADFORD-Methode (3.2.4) bestimmt. Die Zytosol-und Membranprotein-Fraktionen wurden mit Probenpuffer versetzt, ihre Proteine in der Elektrophorese (3.2.7) aufgetrennt und im Western-Blot (3.2.8), sowie in der Silberfärbung (3.2.9) sichtbar gemacht.
NaCl-Phosphatpuffer (nach RAZIN, 1983b):
a) Herstellen einer 1 M Na2HPO4-Lösung (1), sowie einer 1 M NaH2PO4-Lösung (2).
b) Mischen von 82 ml (1) mit 18 ml (2) und Verdünnen des Gemischs 1:10 mit aqua dest. auf 0,1 M.
c) Zugeben von 0,05 M NaCl-Lösung zu der 0,1 M Phosphatpuffer-Lösung.
d) Einstellen des pH-Werts auf 7,5 und Sterilfiltrieren der Lösung.
3.2.6 (Radio-)immunpräzipitation (RIP)
Das Prinzip dieser Methode besteht in einem immunologischen Nachweis radioaktiv markierter Proteine in deren weitgehend nativer Form, und ihrer anschließenden Darstellung durch Autoradiographie nach Polyacrylamid-Gelelektrophorese. In einem Teil der Versuche wurden präzipitierte Antigene im Anschluß an die Elektrophorese im Western-Blot nachgewiesen. In diesem Fall wurde auf die radioaktive Markierung verzichtet.
3.2.6.1 Vorbereitung der Trägermatrix zur Antikörperkopplung
In diesen Untersuchungen wurden Protein A-Sepharosebeads (Pharmacia) verwendet.
Protein A besitzt eine hohe Affinität zu den Fc-Fragmenten von Antikörpern (siehe hierzu auch 3.1.5 und 3.2.6.2). Die Beads wurden nach Herstellerempfehlung zum Gebrauch wie folgt aufbereitet: 1,5 g der Beads wurden in einen Glastrichter mit eingearbeitetem Borosilikat-Filter gegeben und dieser über einen gelochten Gummistopfen an eine Saugflasche gekoppelt, an welche wiederum eine Vakuumpumpe angeschlossen war. Mit diesem System wurden die Beads mit etwa 200 ml sterilem aqua tridest. und anschließend mit etwa 100 ml Natrium-Phosphat-Kopplungspuffer gewaschen und dann in ein steriles Bluecap-Röhrchen überführt. Das Volumen der Beads-Kopplungspuffer-Lösung wurde auf 15 ml eingestellt. Um eine ausreichende Quellung der Beads zu gewährleisten, sollte das beschriebene Waschen der Beads nicht unter 30 min. dauern. Es wurde während des ganzen Vorgangs darauf geachtet, daß die Beads stets befeuchtet waren.
Direkt vor Gebrauch wurden die Beads durch intensives Schwenken gleichmäßig in der Lösung suspendiert, von welcher dann 100 µl-Aliquots auf eine pro Versuch benötigte Anzahl von sterilen 1,5 ml-Reaktionsgefäßen verteilt wurden.
Natrium-Phosphat-Kopplungspuffer, 20 mM:
a) Herstellen einer 20 mM Na2HPO4-Lösung (1) sowie einer 20 mM NaH2PO4-Lösung (2)
b) Mischen beider Lösungen im Verhältnis von 577 ml (1) zu 433 ml (2) c) Einstellung des pH-Werts auf 7 und Sterilfiltration der Lösung.
3.2.6.2 Antikörperkopplung
Patientenseren und Hyperimmunseren wurden unverdünnt à 50 µl zu den Bead-Aliquots gegeben. Jeder Ansatz wurde mit Kopplungspuffer auf 300 µl aufgefüllt.
Der spezifische anti-Hsp60-Antikörper wurde für diese Methode 1:250 mit PBS verdünnt und hiervon je 200 µl zu den Beads gegeben, so daß gleiche Endvolumina vorhanden waren. Als weitere Kontrolle wurden je Versuch zusätzlich Ganzzellysate von M. bovis eingesetzt. Zu deren Aufbereitung siehe unter 3.2.6.4.
Bei einer weiteren, stets mitlaufenden Kontrolle zur Sichtbarmachung unspezifischer Bindungen an die Beads (Beadkontrolle) wurden anstatt der Antiseren lediglich 300 µl PBS eingesetzt. Die Reaktionsgefäße wurden über Nacht bei 4 °C auf einem Schüttler inkubiert.
Alle Ansätze wurden für die spätere Vereinigung mit radioaktiv markierten, hitzegeschockten oder als Kontrolle dienenden, nicht hitzegeschockten mykoplasmalen Antigenen in doppelter Ausführung hergestellt.
3.2.6.3 Blockierung unspezifischer Bindungsstellen
In Anlehnung an JIANNENG u. INZANA (1992) wurde die folgende Methode zur Vermeidung unspezifischer Bindungen an die Beads durchgeführt.
Nach der Inkubation mit den Antiseren wurden die Ansätze zweimal mit PBS und dann zweimal mit 200 mM Ethanolaminhydrochlorid-Lösung (pH 8,0) gewaschen, in 0,5 ml der letztgenannten aufgenommen und für 4 Stunden bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubiert. Es folgte erneutes dreimaliges Waschen mit PBS und einmaliges Waschen mit dem Lysepuffer, mit dem auch die Mykoplasmen aufgetrennt wurden.
Abschließend wurden die mit Antikörpern beladenen und blockierten Beads in 0,5 ml dieses Lysepuffers aufgenommen und bis zur Verfügbarkeit der aufbereiteten Antigene bei 4 °C gelagert. Das Flüssigkeitsvolumen für die Waschvorgänge betrug je 0,5 ml.
Ethanolaminhydrochloridlösung, 200 mM:
Ethanolaminhydrochlorid 19,5 g
aqua dest. ad 1000,0 ml
Einstellung des pH-Werts der Lösung auf 7,4 mit 32 %iger Natronlauge und anschließendes Sterilfiltration.
Lysepuffer 1 (MORRISON-PLUMMER et al. 1987):
a) Herstellung einer 10 mM Tris-Lösung und Einstellung des pH auf 7,8 mit Natronlauge (32 %).
b) Bereitstellung von etwa 500 ml dieser Lösung und unter ständigem Magnetrühren Zugabe von:
Natriumdesoxycholat 2,0 g
SDS 1,0 g
Na2-EDTA 3,723 g
Triton X-100® 10,0 ml
PMSF-Ethanollösung 0,174 g PMSF ad 3 ml Ethanol (96 %)
c) Auffüllen der Lösung aus b) mit der Tris-Lösung auf ein Endvolumen von 1 l und Sterilfiltration.
Lysepuffer 2:
NaCl 2,25 g
Tris 0,30 g
MgCl2 0,51 g
Igepal® 1,25 ml
aqua tridest. ad 250,0 ml
pH-Wert mit 1 N Salzsäure auf 7,2 einstellen und vor Gebrauch pro 15 ml Lysepuffer Zugabe von:
PMSF-Ethanollösung 100,0 µl (siehe Lysepuffer 1), sowie Natriumazid (1 %ig) 100,0 µl
3.2.6.4 Aufbereitung und radioaktive Markierung der Antigene
Von einer sich in der exponentiellen Wachstumsphase befindlichen Kultur wurden je 1,5 ml auf sterile Reaktionsgefäße verteilt und diese dann über 10 min. bei 12000 rpm und 4
°C zentrifugiert. Nach Resuspendierung der Pellets in je 500 µl steriler PBS wurde der Inhalt von je zwei Reaktionsgefäßen vereinigt. Der Waschvorgang wurde zwei weitere Male wiederholt, die Pellets schließlich in je 250 µl Methionin-freies Dialysemedium aufgenommen und je 5 µl 35S-Methionin zugefügt.
Für die Ansätze standen je zwei gleich bestückte Reaktionsgefäße zur Verfügung, die nun zunächst für 20 min. bei 32 °C im Wasserbad vorinkubiert wurden (Kontrolltemperatur).
Danach wurde ein Reaktionsgefäß jedes Ansatzes in ein zweites, auf 45 °C eingestelltes Wasserbad umgesetzt (Hitzeschocktemperatur) und alle Gefäße für weitere 30 min.
inkubiert. Temperatur- und Zeiteinstellung für den Hitzeschock und die entsprechende Kontrolle beruhten auf den Untersuchungen zur Thermotoleranz von Mykoplasmen durch DEITERS (1994).
Im Anschluß an die Inkubation wurden die nun radioaktiv markierten Mykoplasmen für 10 min. bei 4 °C und 12000 rpm zentrifugiert, die Überstände mit einer Saugpumpe abgesaugt, je 500 µl sterile PBS zugegeben und erneut zentrifugiert. Dieser Vorgang wurde noch zweimal wiederholt. Die verbliebenen Pellets wurden in je 250 µl Lysepuffer (siehe 3.2.6.3) aufgenommen und auf einem Rotationsschüttler für 4 Stunden bei Raumtemperatur intensiv bewegt.
Als Kontrolle (Ganzzellysate) zu verwendende, radioaktiv markierte Mykoplasmen wurden direkt nach dem letzten Waschvorgang in 50 µl Mercaptoethanol-Probenpuffer
(siehe unter 3.2.7) aufgenommen und für 5 bis 8 min. bei 100 °C gekocht. Sie konnten bis zum weiteren Gebrauch bei –20 °C tiefgefroren werden (3.2.6.2).
Die übrigen, nun als Lysate vorliegenden Mykoplasmen wurden mit den vorbereiteten Bead-Ansätzen, bei denen zuvor der Lysepuffer-Überstand entfernt worden war, vereinigt.
Da diese Bead-Ansätze in doppelter Ausführung vorlagen, wurde je einer mit dem hitzegeschockten und der jeweils zweite mit dem nicht hitzegeschockten Antigen beschickt.
Es folgte eine weitere Inkubation auf einem Wipptisch für 4 Stunden bei Raumtemperatur und danach viermaliges Waschen mit je 500 µl Lysepuffer. Zwischen den Waschschritten wurde jeweils 2 min. bei 4 °C und 1000 rpm zentrifugiert.
Zu allen Ansätzen wurden 50 µl Probenpuffer (3.2.7) gegeben und diese dann für 5 min.
bei 100 °C gekocht. Nach einer abschließenden Zentrifugation bei 4 °C und 3000 rpm über 2 min. wurden die Überstände mittels Pipette in neue, sterile Reaktionsgefäße überführt. Diese konnten entweder sofort in der SDS-Gelelektrophorese eingesetzt oder für einige Tage bei –20 °C tiefgefroren werden.
Dialysemedium, Methionin-frei (modifiziert nach DEITERS 1994):
a) Das zu dialysierende PH-Medium wurde in sterile, auf 20 cm Länge zugeschnittene Dialyseschläuche gefüllt, welche mit ebenfalls sterilen Klammern verschlossen wurden.
b) Jeder Schlauch wurde in ein 100 ml-Glasschraubgefäß gelegt, darin mit ca. 60 ml RPMI 1640-Medium ohne Methionin überschichtet und dann für mehrere Stunden bei 4 °C auf einem Wipptisch inkubiert.
c) Das Außenmedium wurde mindestens dreimal nach jeweils mehreren Stunden ausgetauscht.
d) Bevor das fertig dialysierte Medium zur Aufbewahrung in sterile 10 ml-Polystyrolröhrchen abgefüllt und bei –80 °C tiefgefroren wurde, wurden aus jedem Schlauch Sterilkontrollen auf Blut- und HT-Agar angelegt.