Da die Immunpräzipitation mit anschließendem immunologischen Nachweis von Hsp keine Hsp60-spezifischen Antikörper in Rekonvaleszentenseren erkennen ließ, wurde als empfindlichste zur Verfügung stehende Methode die Radioimmunpräzipitation eingesetzt.
Die Vorgehensweise zur Erstellung und Beladung der verwendeten Gele entsprach der unter 4.3 geschilderten. Im Anschluß an die Elektrophorese wurden die Gele in einem Geltrockner getrocknet und anschließend auf einen Autoradiographiefilm aufgelegt (siehe 3.2.10).
Es wurde das Reaktionsverhalten von Rekonvaleszentenseren (ELISA-Titer 1:80 bis 1:640) und von Nullseren (ELISA-Titer <1:10) vergleichend mit hyperthermisch vorbehandelten und bei Kontrolltemperatur gewachsenen Mykoplasmen untersucht. Das Hyperimmunserum gegen M. bovis sowie das spezifische Antiserum gegen Hsp 60 dienten als Kontrollseren. Zur Absicherung der Ergebnisse wurde auch hier eine Negativkontrolle (Beadkontrolle) mitgeführt, bei der die als Präzipitationsmatrix eingesetzten Sepharosebeads anstelle von Serum nur mit PBS versetzt wurden. Als weitere Kontrolle dienten wiederum Ganzzellysate von M. bovis, die ohne weitere Zusätze zur Verwendung kamen. Alle erhaltenen Autoradiographien wiesen, abgesehen von wenigen Abweichungen, durchweg ähnliche Reaktionsmuster auf.
Bei der Auswertung der Versuche zeigten sich bei den Ganzzellysatkontrollen diverse, nach Temperaturerhöhung, im Vergleich zu den bei 32 °C belassenen Kontrollen, intensiver geschwärzte Banden. In erster Linie galt es zu prüfen, ob und hinsichtlich welcher Proteine dieser Effekt auch mittels der Präzipitation durch die beschriebenen Seren gezeigt werden konnte. In diesem Zusammenhang erkannten alle Seren ein Protein von etwa 62 kDa nach Hitzeschock-Induktion deutlich stärker als in den Kontrollen..
Einige Seren interagierten gleichartig mit einem benachbart gelegenen Protein von ca. 55 kDa.
Weitere, nach Hitzeschock verstärkte Proteine wurden im Unterschied dazu in allen angefertigten Autoradiographien nicht durch sämtliche eingesetzten Seren detektiert,
sondern nur durch einen Teil derselben erkannt. Diese Proteine wiesen Molekularmassen von ca. 47, 36 und 27 kDa auf. Eine dritte Kategorie nach Hitzeschock verstärkter Proteine war nur in einem Teil der Autoradiographien mit einzelnen Seren darstellbar. Die diesen Proteinen zugeordneten molekularen Massen betrugen ungefähr 97, 70 , 55, 45, 42, 39, 33, 30, 26 und 24 kDa (beispielhaft enthalten in den Abb. 6a, 6b), sowie 28 kDa (exemplarisch dargestellt in den Abb. 5a, 5b). Von allen nur diskontinuierlich erkannten, hitzeverstärkten Proteinen erfolgte der Nachweis des 47 kDa-Proteins am häufigsten. In der Ganzzellysatkontrolle hatte diese 47 kDa-Bande außer der 62 kDa-Bande nach Hitzeschock stets die markanteste Verstärkung im Vergleich zur Kontrollspur gezeigt.
Zum Teil manifestierte sich bei diesen Proteinen die Verstärkung in Form einer Bandenverdoppelung an der entsprechenden Stelle.
Einige der Proteine, die in den Ganzzellysaten hitzeverstärkt wurden, waren von den Seren in den Kontrollspuren dominanter präsentiert worden, als in den entsprechenden Hitzeschockspuren. Der Effekt trat für diese Proteine aber nicht kontinuierlich auf. In erster Linie konnte er für ein Protein, dessen Molekularmasse versuchsabhängig zwischen 68,1 und 69,7 kDa bestimmt wurde und seltener für ein 43,2 kDa-Protein (Abb. 5a, 5b) gezeigt werden.
Für diverse in den Ganzzellysatkontrollen nachweisbare Hitzeschock-Banden konnte mittels der Immunpräzipitation weder eine gleich- noch eine gegenläufige Reaktion nachgewiesen werden. Einerseits wurden entsprechende Proteine von den Seren nicht erkannt. Das galt für Proteine mit etwa 110, 33 und 30 kDa (exemplarisch gezeigt in den Abb. 5a, 5b), 34 kDa, sowie alle zwischen 56 und 50 kDa angeordneten Proteine. Zum anderen beruhte die weder gleich- noch gegenläufige Reaktion auf der Ausprägung zweier gleichstarker Banden im Hitzeschock- und im Kontroll-Ansatz eines Serums, was aber für die jeweiligen Proteine nie durchgehend zu beobachten war. Einige Proteine konnten hinsichtlich ihrer Detektierbarkeit durch Rekonvaleszentenseren keiner eindeutigen Tendenz zugeordnet werden. Solche Proteine wurden in Abhängigkeit vom präzipitierenden Serum entweder nach Hitzeschock oder in der Kontrolle verstärkt oder z.T. gar nicht erkannt. Die Häufigkeitsverteilung, mit der sich die genannten Phänomene für ein bestimmtes Protein zeigten, folgte keiner Regel. Proteine, die mit den Seren
deutlich uneinheitlich reagierten, hatten folgende molekulare Massen: 41,2 und 27,8 kDa (beispielhaft sichtbar in den Abb. 5a, 5b).
Darüberhinaus sind drei Banden zu erwähnen, die sich im Molekulargewichtsbereich zwischen etwa 36 und 40 kDa befinden und unabhängig vom jeweiligen Ansatz immer gleich ausgeprägt waren. In den Negativkontrollen waren erwartungsgemäß keine Proteinbanden sichtbar.
Es waren insgesamt 56 Patientenseren untersucht worden. Die Höhe der Titer der Seren im ELISA hatte keinerlei erkennbaren Einfluß auf deren Reaktionsverhalten unter den genannten Bedingungen. Die in diesem Abschnitt besprochenen Ergebnisse werden repräsentativ anhand 16 ausgewählter Patientenseren sowie beigeordneter Kontrollen in den Abbildungen 5a,5b, 6a und 6b dargestellt. Zur Erhöhung der Übersichtlichkeit wurde jeder Abbildung eine Tabelle nachgestellt, die die Resultate schematisch zusammenfaßt.
Selbst mit der empfindlichsten zur Verfügung stehenden Methode konnte keine spezifische Reaktion der Rekonvaleszentenseren mit Hsp60 dargestellt werden.
Abb. 1: Verteilung der Proteine von M. bovis nach Hitzeschock auf die Zytosol- und Membranfraktion. Darstellung in der Silberfärbung.
I: Membranfraktion
II: Zytosolfraktion
Abb. 2: Verteilung der Proteine von M. bovis nach Hitzeschock auf die Zytosol- und Membranfraktion. Darstellung im mit Hyperimmunserum gegen den M. bovis-Referenzstamm PG 45 entwickelten Western-Blot.
I: Membranfraktion
II: Zytosolfraktion
Abb. 3: Reaktion von bovinen Rekonvaleszentenseren mit hitzegeschockten und nicht-hitzegeschockten Ganzzellysaten von M. bovis im Western-Blot.
K: Ganzzellysate von M. bovis wurden bei der Kontrolltemperatur von 32°C angezüchtet HS: Ganzzellysate von M. bovis wurden einem Hitzeschock bei 45°C unterzogen
I: Rekonvaleszentenserum D 8600; ELISA-Titer gegen M. bovis 1:320 II: Rekonvaleszentenserum D 9678; ELISA-Titer gegen M. bovis 1:640 III: Rekonvaleszentenserum D 7367; ELISA-Titer gegen M. bovis 1:80 IV: Rekonvaleszentenserum D 9989; ELISA-Titer gegen M. bovis 1:320 V: Kontrollserum D 109/98; ELISA-Titer gegen M. bovis <1:10
Abb. 4a: Reaktion des Kaninchen-Antikörpers gegen Hsp 60 von Synechococcus spec.
mit hitzegeschockten und nicht-hitzegeschockten Ganzzellysaten von M. bovis nach Immunpräzipitation im Western-Blot.
K: Ganzzellysate von M. bovis wurden bei der Kontrolltemperatur von 32°C angezüchtet HS: Ganzzellysate von M. bovis wurden einem Hitzeschock bei 45°C unterzogen
I: Rekonvaleszentenserum D 10663; ELISA-Titer gegen M. bovis 1:160 II: Rekonvaleszentenserum D 9678; ELISA-Titer gegen M. bovis 1:640 III: Rekonvaleszentenserum D 9989; ELISA-Titer gegen M. bovis 1:320 IV: Rekonvaleszentenserum D 7367; ELISA-Titer gegen M. bovis 1:80 V: Rekonvaleszentenserum D 8600; ELISA-Titer gegen M. bovis 1:320 VI: Kontrollserum D 9380; ELISA-Titer gegen M. bovis <1:10
VII: Ganzzellysate von M. bovis (Positivkontrolle)
Abb. 4b: Reaktion des Kaninchen-Antikörpers gegen Hsp 60 von Synechococcus spec.
mit hitzegeschockten und nicht-hitzegeschockten Ganzzellysaten von M. bovis nach Immunpräzipitation im Western-Blot.
K: Ganzzellysate von M. bovis wurden bei der Kontrolltemperatur von 32°C angezüchtet HS: Ganzzellysate von M. bovis wurden einem Hitzeschock bei 45°C unterzogen
VIII: Protein A-Sepharosebeads unter Zusatz von PBS (Negativkontrolle) IX: Kontrollserum D 9381; ELISA-Titer gegen M. bovis <1:10
X: Kontrollserum D 2122; ELISA-Titer gegen M. bovis <1:10 XI: Hyperimmunserum gegen den M. bovis-Stamm PG 45 XII: Kaninchen-Antiserum gegen Hsp 60 von Synechococcus spec.
XIII: Ganzzellysate von M. bovis (Positivkontrolle)
Abb. 5a: Reaktion von Rekonvaleszentenseren mit hitzegeschockten und nicht-hitzegeschockten Ganzzellysaten von M. bovis nach Radioimmunpräzipitation in der Autoradiographie.
K: Ganzzellysate von M. bovis wurden bei der Kontrolltemperatur von 32°C angezüchtet HS: Ganzzellysate von M. bovis wurden einem Hitzeschock bei 45°C unterzogen
I: Kontrollserum IO 1; ELISA-Titer gegen M. bovis <1:10 II: Kontrollserum IO 2; ELISA-Titer gegen M. bovis <1:10
III: Rekonvaleszentenserum D 2512; ELISA-Titer gegen M. bovis 1:640 IV: Rekonvaleszentenserum D 2511; ELISA-Titer gegen M. bovis 1:640 V: Kontrollserum D 109/98; ELISA-Titer gegen M. bovis <1:10 VI: Kontrollserum D 178/98; ELISA-Titer gegen M. bovis <1:10 VII: Ganzzellysate von M. bovis (Positivkontrolle)
Tabelle 3: Reaktion von Rekonvaleszenten- und Kontrollseren mit M. bovis-Antigenen (Ergänzung zu Abb.
5a)
Erkennung der links aufgeführten Proteine durch die verschiedenen Seren:
+: Proteine wie in der Ganzzellysatkontrolle nach Hitzeschock verstärkt -: Proteine in der Kontrolle verstärkt
=: Proteine nach Hitzeschock und in der Kontrolle gleich stark
0: Proteinbanden weder nach Hitzeschock noch in der Kontrolle nachweisbar D: Verstärkung in Form einer Doppelbande ausgeprägt
s: Schwache Bandenausprägung
Abb. 5b: Reaktion von Rekonvaleszentenseren mit hitzegeschockten und nicht-hitzegeschockten Ganzzellysaten von M. bovis nach Radioimmunpräzipitation in der Autoradiographie.
K: Ganzzellysate von M. bovis wurden bei der Kontrolltemperatur von 32°C angezüchtet HS: Ganzzellysate von M. bovis wurden einem Hitzeschock bei 45°C unterzogen
VIII: Protein A-Sepharosebeads unter Zusatz von PBS (Negativkontrolle) IX: Rekonvaleszentenserum D 2134; ELISA-Titer gegen M. bovis 1:640 X: Rekonvaleszentenserum D 2122; ELISA-Titer gegen M. bovis 1:320 XI: Hyperimmunserum gegen den M. bovis-Stamm PG 45
XII: Kaninchen-Antiserum gegen Hsp 60 von Synechococcus spec.
XIII: Ganzzellysate von M. bovis (Positivkontrolle)
Tabelle 4: Reaktion von Rekonvaleszenten- und Kontrollseren mit M. bovis-Antigenen (Ergänzung zu Abb. 5b)
Erkennung der links aufgeführten Proteine durch die verschiedenen Seren:
+: Proteine wie in der Ganzzellysatkontrolle nach Hitzeschock verstärkt -: Proteine in der Kontrolle verstärkt
=: Proteine nach Hitzeschock und in der Kontrolle gleich stark
0: Proteinbanden weder nach Hitzeschock noch in der Kontrolle nachweisbar D: Verstärkung in Form einer Doppelbande ausgeprägt
s: Schwache Bandenausprägung Zu Abb. 5b
D 2134 D2122 Hyperimmunserum anti Hsp 60-Serum
110,0 0 0 0 0
Abb. 6a: Reaktion von Rekonvaleszentenseren mit hitzegeschockten und nicht-hitzegeschockten Ganzzellysaten von M. bovis nach Radioimmunpräzipitation in der Autoradiographie.
K: Ganzzellysate von M. bovis wurden bei der Kontrolltemperatur von 32°C angezüchtet HS: Ganzzellysate von M. bovis wurden einem Hitzeschock bei 45°C unterzogen
I: Rekonvaleszentenserum D 10663; ELISA-Titer gegen M. bovis 1:160 II: Rekonvaleszentenserum D 9678; ELISA-Titer gegen M. bovis 1:640 III: Rekonvaleszentenserum D 9989; ELISA-Titer gegen M. bovis 1:320 IV: Rekonvaleszentenserum D 7367; ELISA-Titer gegen M. bovis 1:80 V: Rekonvaleszentenserum D 8600; ELISA-Titer gegen M. bovis 1:320 VI: Kontrollserum D 9380; ELISA-Titer gegen M. bovis <1:10
VII: Ganzzellysate von M. bovis (Positivkontrolle)
Tabelle 6: Reaktion von Rekonvaleszenten- und Kontrollseren mit M. bovis-Antigenen (Ergänzung zu Abb.
6a)
Erkennung der links aufgeführten Proteine durch die verschiedenen Seren:
+: Proteine wie in der Ganzzellysatkontrolle nach Hitzeschock verstärkt -: Proteine in der Kontrolle verstärkt
=: Proteine nach Hitzeschock und in der Kontrolle gleich stark
0: Proteinbanden weder nach Hitzeschock noch in der Kontrolle nachweisbar D: Verstärkung in Form einer Doppelbande ausgeprägt
s: Schwache Bandenausprägung
Abb. 6b: Reaktion von Rekonvaleszentenseren mit hitzegeschockten und nicht-hitzegeschockten Ganzzellysaten von M. bovis nach Radioimmunpräzipitation in der Autoradiographie.
K: Ganzzellysate von M. bovis wurden bei der Kontrolltemperatur von 32°C angezüchtet HS: Ganzzellysate von M. bovis wurden einem Hitzeschock bei 45°C unterzogen
IX: Kontrollserum D 9381; ELISA-Titer gegen M. bovis <1:10 X: Kontrollserum D 2122; ELISA-Titer gegen M. bovis <1:10 XI: Hyperimmunserum gegen den M. bovis-Stamm PG 45 XII: Kaninchen-Antiserum gegen Hsp 60 von Synechococcus spec.
XIII: Ganzzellysate von M. bovis (Positivkontrolle)
Tabelle 7: Reaktion von Rekonvaleszenten- und Kontrollseren mit M. bovis-Antigenen (Ergänzung zu Abb.
6b)
Erkennung der links aufgeführten Proteine durch die verschiedenen Seren:
+: Proteine wie in der Ganzzellysatkontrolle nach Hitzeschock verstärkt -: Proteine in der Kontrolle verstärkt
=: Proteine nach Hitzeschock und in der Kontrolle gleich stark
0: Proteinbanden weder nach Hitzeschock noch in der Kontrolle nachweisbar D: Verstärkung in Form einer Doppelbande ausgeprägt
s: Schwache Bandenausprägung Zu Abb. 6b
D 9381 D 2122 Hyperimmunserum anti Hsp 60-Serum
97,2 + (s) + (s) + 0
5 Diskussion
Die Immunantwort von Rindern nach einer M. bovis-Infektion ist bisher nur unzulänglich untersucht worden. Insbesondere die Antigene des Erregers, die im Verlauf einer natürlichen Infektion immundominant werden und damit die Antikörperantwort erkrankter Rinder vorrangig stimulieren, wurden bislang wenig charakterisiert. In der vorliegenden Arbeit sollten daher diejenigen Antigene von M. bovis ermittelt werden, die von der humoralen Abwehr des Wirtes im Infektionsverlauf in spezifischer Weise erkannt werden.
Besondere Beachtung sollte das Hsp60 finden, da dieses Protein bei verschiedenen anderen bakteriellen Infektionen zuvor bereits als immundominantes Antigen beschrieben worden war (u. a. YOUNG u. ELLIOT 1989, SHINNICK 1991, FRACELLA u.
RENSING 1994, KITTELBERGER et al. 1995, AULT et al. 1998). Für die Untersuchungen wurden Rekonvaleszentenseren eingesetzt, die zur Diagnostik an das Institut für Mikrobiolgie und Tierseuchen der Tierärztlichen Hochschule Hannover eingesandt worden waren. Diese Seren wiesen in einem spezifischen ELISA auf der Basis von Ganzzellantigenen unterschiedlich hohe Titer gegen M. bovis auf.
In Vorversuchen hatten sich zwei Aspekte ergeben, auf die einleitend kurz eingegangen werden soll. Zum einen hatte sich gezeigt, daß M. bovis sich mit einem zunächst verwendeten Lysepuffer (im Methodenteil als „Lysepuffer 2“ bezeichnet) nicht in ausreichendem Maß aufspalten ließ. Dieser Puffer war bei anderen Bakterien zuvor erfolgreich zur Lyse eingesetzt worden. Diese Tatsache unterstreicht die hohe Tenazität des Erregers und war aufgrund der fehlenden Zellwand zunächst nicht erwartet worden.
Auch andere Autoren haben auf diese Eigenschaft von M. bovis hingewiesen (u.a.
JASPER et al. 1976, PFÜTZNER et al. 1983b, PFÜTZNER 1984b, PFÜTZNER 1990).
Erst die Verwendung eines potentiell stärker lysierenden Puffers („Lysepuffer 1“) erbrachte eine ausreichende Aufspaltung von M. bovis. Zum zweiten konnten Hintergrundreaktionen in immunologischen Nachweisen dadurch verringert werden, daß anstelle des sonst zum Kulturmedium zugesetzten Pferde-Vollserums ein Pferdeserum ohne Immunglobuline verwendet wurde. Diese Verminderung unspezifischer Reaktionen
könnte darauf beruhen, daß Mykoplasmen Proteine bilden können, die mit Serumbestandteilen aus dem Kulturmedium kreuzreagieren. Ein solches Phänomen war von TANGEN u. KIRCHHOFF (1995) für M. arthritidis nachgewiesen worden.
In den Hauptuntersuchungen sollte zunächst die intrazelluläre Lokalisation des Hsp60 in der M. bovis-Zelle aufgezeigt werden. Andere Autoren hatten die intrazelluläre Lage von Hsp bei vielen Bakterienspezies dokumentiert (u.a. CRAIG et al. 1993, TAGUCHI et al.
1996, JYOT et al. 1999). Eigene Untersuchungen in diese Richtung erschienen jedoch sinnvoll, da gerade in jüngster Zeit für einige intra- und auch extrazellulär vorkommende Bakterienspezies ebenfalls das oberflächenassoziierte Vorkommen von Hsp60 und anderen Hsp beschrieben wurde (AMINI et al. 1996, FRISK et al. 1998, HOFFMANN u.
GARDUNO 1999). Für den angestrebten Nachweis war zunächst eine Gesamtzellpräparation mit nachfolgender Fraktionierung durchgeführt worden (3.2.5). Als Nachweisverfahren dienten dann die Silberfärbung und der Western-Blot, in dem ein Hyperimmunserum gegen M. bovis eingesetzt worden war. Im Western-Blot war die Nachweisreaktion deutlich schwächer ausgeprägt (Abb. 1,2).
In einem anschließend durchgeführten Versuch wurden Ganzzellysate von M. bovis in der SDS-PAGE aufgetrennt. Ein Teil der M. bovis-Kultur, aus der diese Lysate hergestellt wurden, war vorher einem Hitzeschock unterworfen worden, der andere Teil wurde als Kontrolle bei 32 °C belassen. So konnte im folgenden Immuno-Blot jedes eingesetzte Rekonvaleszenten- bzw. Nullserum vergleichend mit einem Hitzeschock- und einem Kontrollysat zur Reaktion gebracht werden. Im Ergebnis konnten in diesem Vergleich keine Unterschiede in den Reaktionsmustern ermittelt werden. Es gelang mit keinem der Seren, die Verstärkung der Expression von Proteinen in Folge eines Hitzeschocks zu zeigen. Lediglich in der allgemeinen Reaktionsstärke konnte zwischen den Seren insofern differenziert werden, als Seren mit höherem ELISA-Titer gegen M. bovis deutlichere Bandenprofile erkennen ließen, als Seren mit niedrigen Titern oder ohne Reaktivität im ELISA. Die jeweils erkannten Antigene zeigten sich innerhalb eines Molekularmassenbereichs von ca. 26 bis 127 kDa. Alle Seren detektierten in deutlicher Weise ein etwa 73 kDa schweres Protein (Abb. 3). Obwohl dieses Protein bei
hitzegeschockten und nicht-hitzegeschockten M. bovis-Zellen gleich stark nachgewiesen wurde, könnte es sich dabei aufgrund der molekularen Masse um das Hsp70 handeln. In früheren Untersuchungen anderer Autoren und der eigenen Arbeitsgruppe war in diesem Zusammenhang wiederholt auf die konstitutive Expression eines Hsp70 hingewiesen worden (CRAIG et al. 1993, DEITERS 1994, SCHRIDDE 1995, RUNGE et al. 1998).
Von diesen Autoren hatte DEITERS (1994), unter Verwendung der gleichen Technik mit einem Teil der von ihr untersuchten Seren, die nach Hitzeschock verstärkte Expression eines 68 kDa-Proteins zeigen können. Daß dieses Ergebnis in den vorliegenden Untersuchungen nicht reproduziert wurde, könnte darauf beruhen, daß das 68 kDa-Protein kein Haupt-Immunogen ist oder nicht zu jedem Zeitpunkt einer M. bovis-Infektion als solches erkannt wird. Letztlich schien jedoch weder das vorliegende, noch das zum Vergleich herangezogene Ergebnis eine umfassende Charakterisierung der zu untersuchenden Immunantwort zu ermöglichen. Die mangelnde Spezifität und Sensitivität der eingesetzten Methode konnte hierfür eine gemeinsame Ursache sein. Die genannten Nachteile des Verfahrens basierten wahrscheinlich auf der Denaturierung der gesuchten Proteine vor dem immunologischen Nachweis.
Es wurde deshalb in den folgenden Untersuchungen eine Erhöhung der Empfindlichkeit und Spezifität angestrebt. Dazu wurden die Antigene von M. bovis durch Immunpräzipitation mit Rekonvaleszenten- und Kontrollseren von nicht-reaktiven Molekülen des Erregers getrennt und die gebundenen Antigene daraufhin in einer SDS-PAGE aufgetrennt. Diese Vorgehensweise sollte zeigen, ob und welche Antigene in ihrer nativen, nicht-denaturierten Form von den Seren erkannt werden. Der Versuch wurde weitergeführt, indem die im Gel enthaltenen, präzipitierten Proteine auf eine Nitrozellulosemembran übertragen wurden. Um nachzuweisen, ob v.a. das Hsp60 durch die Seren erkannt worden war, wurde der Blot mit einem polyklonalen Kaninchen-Antiserum gegen das Hsp60 von Synecchococcus sp. überschichtet. Daraufhin wurde mit einem Konjugat die Bindung des Antiserums überprüft. Es zeigte sich, daß mit Ausnahme der Ganzzellysatkontrolle, im Molekularmassenbereich um 60 kDa keine Bindung des Antiserums an das Zielprotein nachweisbar war. Dort, wo zuvor präzipitierende Seren zum Einsatz gekommen waren, war ein Reaktionsprofil entstanden, das unabhängig vom
jeweiligen Versuchsansatz eine relative Uniformität aufwies. Es zeigten sich dabei in jeder dieser Spuren des Blots zwei Banden mit molekularen Massen von etwa 46 und 26 kDa und eine Anzahl weiterer, zwischen diesen lokalisierter, undeutlicher Banden. Die genannten Molekularmassen stimmen mit jenen überein, die für die schweren und leichten Ketten von Immunglobulinen bekannt sind (HUBER 1980). Diese Fakten legten den Schluß nahe, daß der gegen Hsp60 gerichtete Antikörper nicht gebunden wurde. Das Reaktionsmuster dürfte dementsprechend auf die Interaktion der als Konjugat verwendeten Ziege-anti-Kaninchen-IgG mit den präzipitierenden Rinderantikörpern zurückzuführen sein. Die ausbleibende Bindung des ersten Antikörpers in dem oben beschriebenen Versuch weist darauf hin, daß nur geringe Mengen des Hsp60 durch die Rekonvaleszentenseren immunpräzipitiert wurden. Diese Annahme wird durch die nachweisbare spezifische Bindung des gegen Hsp60 gerichteten Antikörpers in der Ganzzellysatkontrolle unterstützt. Es ließ sich für die spezifische 64 kDa-Bande jeweils eine geringfügige Hitzeschockverstärkung nachweisen. Diese Feststellung stand im Einklang mit früheren Untersuchungen, in denen der gleiche Antikörper in M. bovis-Ganzzellysaten ebenfalls ein ca. 60 kDa schweres Protein und dessen Verstärkung nach Thermoinduktion detektiert hatte (DEITERS 1994, SCHRIDDE 1995). In dieser Arbeit war die Reaktion des anti-Hsp60 Antikörpers mit dem Ganzzellysat z.T. noch durch weitere Banden mit Molekularmassen von 40, 38, 33, und 31 kDa gekennzeichnet. Das Auftreten dieser Banden korrelierte in vielen Fällen mit der Benutzung bestimmter Chargen des Antikörpers. Da es sich um ein polyklonales Antiserum handelt, welches in Kaninchen hergestellt wird, sind Schwankungen in der Spezifität sowie unspezifische Bindungen nicht ausgeschlossen. In dieser Weise ließen sich die besprochenen vier Banden erklären. SCHERM (1999) legte abweichend dazu nahe, daß es sich bei diesen, teilweise auch von ihr nachgewiesenen, Banden um Degradationsprodukte des Hsp60 handelte, die somit als Teil der spezifischen Reaktion gegen das Hsp60 verstanden werden müßten.
Eine weitere Erhöhung der Empfindlichkeit der Nachweismethode wurde mit der Durchführung einer Radioimmunpräzipitation und anschließender Autoradiographie erreicht. Mit diesem Verfahren sollten die o.g. Nachteile der zuvor diskutierten Methode
weitgehend minimiert werden. In den dementsprechend ausgeführten Versuchen konnten schon hinsichtlich der Ganzzellysatkontrollen zur Darstellung der nach einem Hitzeschock verstärkten Proteine von M. bovis deutliche Abweichungen zu den Ergebnissen anderer Autoren festgestellt werden. SCHRIDDE (1995) ermittelte nach radioaktiver Markierung von M. bovis die verstärkte Expression von vier Proteinen (70-, 56-, 35- und 33 kDa).
Weitere Autoren konnten bei anderen Mykoplasmenspezies, die nach Hitzeschock verstärkte Synthese von maximal elf Proteinen nachweisen (DASCHER et al. 1990, SØNDERGARD-ANDERSEN et al. 1990). In den eigenen Untersuchungen konnte die Verstärkung und z.T. die Neusynthese von bis zu 20 Proteinen unterschiedlicher molekularer Massen bei M. bovis nach Temperaturerhöhung, und damit eine unerwartet vielfältige Hitzeschock-Antwort, gezeigt werden. Auch in der Erkennung dieser Hsp durch die eingesetzten Rekonvaleszenten- und Kontrollseren ergaben sich augenfällige Unterschiede zu bisherigen Untersuchungen, in denen Rekonvaleszentenseren maximal ein Hitzeschockprotein von M. bovis detektierten. In der vorliegenden Arbeit konnte die Expression von Hsp60 und bis zu 14 weiteren Proteinen durch Präzipitation mit Rekonvaleszentenseren aufgezeigt werden. Allerdings ließ sich mit den vergleichend eingesetzten Kontrollseren die Reaktion mit Hitzeschockproteinen in gleicher Intensität nachweisen (Abb. 5a, 5b, 6a, 6b). Aufgrund dieser Reaktion der Kontrollseren, welche im ELISA nicht oder nur schwach mit M. bovis reagiert hatten, kann nicht davon ausgegangen werden, daß das Hsp60 im Verlauf einer Infektion mit M. bovis eine charakteristische Immunantwort induziert. Demzufolge scheint das Hsp60 für eine Nutzung in der Diagnostik von M. bovis-Infektionen nicht geeignet zu sein.
Für die Interpretation der hier beschriebenen Ergebnisse wurden zwei Fragen als essentiell erachtet:
1) Warum erkennen auch die Kontrollseren mykoplasmale Hsp?
1) Warum erkennen auch die Kontrollseren mykoplasmale Hsp?