4 Material und Methoden
4.1 Verwendete Materialien
4.1.7 Herstellung von Stammlösungen und Puffern
Amidoschwarz-Elutionslösung 125 µL EDTA-Na pH 8,0
0,5 g Natriumhydroxid ad 500 mL 50 % (V/V) Ethanol
Amidoschwarz-Entfärbelösung 10 mL Eisessig
450 mL Methanol ad 500 mL Aqua dem.
Amidoschwarz-Färbelösung 50 mL Eisessig 225 mL Methanol
1,25 g Amidoschwarz 10B ad 500 mL Aqua dem.
Bromphenolblau-Lösung
10 µL 96 %iger (V/V) Ethanol
~1 mg Bromphenolblau gesättigt ad 10 mL Aqua dem.
Die Bromphenolblau-Lösung wird in einem 15 mL PP-Röhrchen als gesättigte Lösung hergestellt. Ungelöster Farbstoff wird durch Zentrifugation pelletiert und der Überstand zur Herstellung des Probenauftragspuffers verwendet. Die Lagerung erfolgt bei -20°C.
Coomassieblau-Färbelösung 250 mL Methanol
50 mL Eisessig
1,25 g Coomassie Brilliant Blau R250 ad 500 mL Aqua dem.
Die Coomassieblau-Färbelösung wird in einer lichtgeschützten Duranglasflasche bei RT gelagert.
Einfriermedium zur Kryokonservierung 2 mL DMSO
ad 20 mL FKSi nicht i.a.
Das Einfriermedium wird kurz zuvor in der jeweiligen Menge, die benötigt wird um je eine Mio. Zellen/mL Einfriermedium pro Kryo-Röhrchen zu konservieren, frisch hergestellt.
i Fötales Kälberserum, nicht Hitze-inaktiviert
Elektrophoresepuffer-Stammlösung 10-fach 144 g Glycin
30 g Tris 10 g SDS
ad 1000 mL Aqua dem.
Die Elektrophoresepuffer-Stammlösung wurde bis zur weiteren Verwendung in einer 1000 mL Duranglasflasche bei 4-8°C gelagert. Zur Elektrophorese wird diese Stammlösung 1:10 in Aqua dem. verdünnt.
Entwicklungslösung für Silberfärbung 3 g Natriumcarbonat
150 µL Formaldehyd-Lösung 37%
ad 150 mL Aqua dem.
Diese Lösung wird unmittelbar vor Verwendung hergestellt.
Fixierlösung für Silberfärbung 200 mL Ethanol absolut
40 mL Eisessig 200 mL Aqua dem.
Die so hergestellte Lösung kann in einer Duranglasflasche für mehrere Monate aufbewahrt werden.
LB-Flüssigmedium (nach Luria/Miller) pH 7,0
25 g LB-Medium ad 1 L Aqua dem.
Das Medium wird umgehend nach Herstellung auf zwei Schott-Flaschen aufge-teilt, im Autoklaven sterilisiert und anschließend vor Licht geschützt aufbewahrt.
Unmittelbar vor Verwendung des Mediums wird Ampicillin in einer Konzentration von 100 µg/mL als Selektionsmarker zugesetzt.
Mn2+-Lösung 0,1 M
1,62 g MnCl2 x 2H2O ad 100 mL Aqua dem.
Phosphatgepufferte-Salzlösung (PBSi)-20fach-Konzentrat 4 g Natriumchlorid
0,1 g Kaliumchlorid
0,9 g Dinatriumhydrogenphosphat-Dihydrat
i PBS = engl.: phosphate buffered saline
Phosphatgepufferte-Salzlösung (PBS)-20fach-Konzentrat 0,12 g Kaliumdihydrogenphosphat
ad 500 mL Aqua dem.
Das Pufferkonzentrat wird bei 4-8°C gelagert.
Phosphatgepufferte-Salzlösung (PBS)-gebrauchsfertige-Lösung 25,0 mL PBS-20fach-Konzentrat
ad 500 mL Aqua dem.
Dieser Puffer wird als Laufpuffer in SAW-Experimenten zuvor durch Anlegen eines Vakuums für 30 min entgast. Die Lagerung erfolgt bei 4-8°C.
Phosphatpuffer nach Sörensen pH 7,4
Lösung A:
9,078 g Kaliumdihydrogenphosphat ad 1000 mL Aqua dem.
Lösung B:
11,876 g Dinatriumhydrogenphosphat x 2H2O ad 1000 mL Aqua dem.
Zur Herstellung des Phosphatpuffers mit dem entsprechenden pH werden die Lösungen A und B gemäß einer Vorgabe miteinander gemischt. Für den hier verwendeten pH von 7,4 werden 81,8 mL der Lösung B mit Lösung A ad 100 mL aufgefüllt. Der resultierende pH von 7,4 wird anschließend am pH-Meter kontrol-liert.
Primärantikörperlösung für Western-Blot 10 mg Natriumazid
500 mg BSA
10 µg Primärantikörper (hier bspw. antiCyr61) 10 mL TBS-Ti
Das enthaltene Natriumazid schützt vor mikrobiologischer Kontamination, die fertige Lösung kann somit für mehrere Monate bei 4°C aufbewahrt und verwendet werden. Die verwendeten Primärantikörper werden nach Herstellerangaben in konkreter Konzentration oder Verdünnung zugesetzt.
Probenauftragspuffer (PAP) 1,75 mL Tris-HCl pH 6,8
1,5 mL Glycerol
5 mL 10 % SDS-Lösung
1,25 mL Bromphenolblau-Lösung i engl.: Tris buffered saline with Tween20
Der Probenauftragpuffer wird in einem 15 mL PP-Röhrchenhergestellt, aliquotiert und in 1,5 mL PP-Reaktionsgefäßen bei -20°C gelagert.
TBSi-StammLösung pH 7,3 bei RT
40 g Natriumchlorid 6,06 g Tris
ad 500 mL Aqua dem.
Die pH-Wert Einstellung erfolgt mit HCl 1M. Die fertige Lösung wird in einer Duranglasflasche bei 4-8°C gelagert.
TBST-Lösung
80 mL TBS-StammLösung 1,6 mL Tween20
720 mL Aqua dem.
TBST-Blocking-Lösung
5 g Magermilchpulver ad 100 mL TBST-Lösung
Die TBST-Blockierungs-Lösung wird am Versuchstag frisch hergestellt. Bis zum vollständigen Lösen des Milchpulvers in ungefähr 70 mL Lösung muss ca. 20 min intensiv gerührt werden, erst dann wird ad 100 mL aufgefüllt.
Transferpuffer pH 8,2-8,4 bei RT
28,80 g Glycin 6,06 g Tris
ad 2000 mL Aqua dem.
Der Transferpuffer wird am Versuchstag vor der Durchführung des Western-Blots hergestellt. Nach dem Lösen der Substanzen sollte der pH im Bereich von 8,2-8,4 liegen. Die Lösung wird dann bis zur Verwendung bei 4-8°C gelagert.
Trichloressigsäure (TCA)-Lösung 100 % (m/V) in Wasser 100 g TCA
ad 100 mL Aqua dem.
Die Lagerung erfolgt in 100 mL Medizinalgläsern bei 4-8°C.
Tris-HCl-Lösung pH 7,5 10 mM
121 mg Tris
ad 100 mL Aqua dem.
Die pH-Wert Einstellung erfolgt mit HCl 1M. Die fertige Lösung wird in einer Duranglasflasche bei 4-8°C gelagert.
i engl.: Tris buffered saline
Tris-HCl 10 mM mit NaCl 1,5 M Lösung pH 7,5 121 mg Tris
8,76 g Natriumchlorid ad 100mL Aqua dem.
Die pH-Wert Einstellung erfolgt mit HCl 1M. Die fertige Lösung wird in einer Duranglasflasche bei 4-8°C gelagert.
Tris-SDS-Lösung pH 7,5 bei RT
12,1 g Tris
2 g Natriumdodecylsulfat (SDS) ad 100 mL Aqua dem.
Die Lagerung der Tris-SDS-Lösung erfolgt bei RT in einem 100 mL Medizinalglas.
Waschpuffer für die Durchflusszytometrie 0,5 %ig
500 mg BSA
ad 100 mL PBS - gebrauchsfertige Lösung
Der Waschpuffer wird vor Verwendung sterilfiltriert um etwaige Schwebeteilchen zu entfernen, die ein Verstopfen der feinen Kapillare des FACS verursachen könnten.
Zellextraktions-Puffer (Lysepuffer) von Invitrogen™
10 mM Tris pH 7,4
100 mM Natriumchlorid 1 mM EDTA
1 mM EGTA
1 mM Natriumfluorid
20 mM Tetranatriumdiphosphat 2 mM Natriumorthovanadat
1 % Triton X-100 10 % Glycerol 0,1 % SDS
0,5 % Deoxycholat
Der Zellextraktions-Puffer wird unmittelbar vor Verwendung noch durch Zusatz eines Proteaseinhibitor-Cocktails und PMSF fertig gestellt.
4.1.8 Software
Zur Durchführung der Versuche wurden folgende Programme verwendet:
• CellQuest™ Pro Version 5.2.1 (BD Biosciences, Heidelberg, Deutsch-land)
• BD™ Plate Manager Version 1.0.1 (BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland)
• Biosens K12 (SAW Instruments GmbH, Bonn, Deutschland)
• Sequence Master 6 (SAW Instruments GmbH, Bonn, Deutschland) Zur Auswertung und graphischen Darstellung der Versuchsergebnisse kamen folgende Programme zum Einsatz:
• Microsoft Excel 2010 für Windows (Microsoft Corporation, Redmount, WA, USA)
• GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA)
• WinMDI 2.8 (The Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA)
• NIS-Elements (Nikon Instruments Inc., Kawasaki (Kanagawa), Japan)
• Imagoquant MultiTrack-AVI-2 (Mediquant GmbH, Lützen, Deutsch-land)
• Origin™ 7.5 (Additive, Friedrichsdorf, Deutschland)
• FitMaster (SAW Instruments GmbH, Bonn, Deutschland)
Schematische Zeichnungen und Abbildungen wurden mit den folgenden Programmen erstellt:
• Microsoft Powerpoint 2010 für Windows (Microsoft Corporation, Redmount, WA, USA)
• Microsoft Visio 2010 für Windows (Microsoft Corporation, Redmount, WA, USA)
• Adobe® Photoshop® (Adobe Sytems GmbH, München, Deutschland) Chemische Formeln wurden mit ChemDraw® Pro 12 (PerkinElmer Infor-matics Inc., Waltham, MA, USA) gezeichnet und erstellt.
Die Dissertationsschrift wurde mit StarOffice Writer 9 (Sun Microsystems, Santa Clara, CA, USA) verfasst.