Arbeiten mit adhärent wachsenden Zellen

Die verwendete Zelllinie mit der Bezeichnung „MV3“ wurde dankenswerter Weise von Herrn Dr. Reiner Zeisig, MDC (Max-Delbrück-Centrum für mole-kulare Medizin), Berlin zur Verfügung gestellt. Es handelt sich um eine humane Melanomzelllinie, welche auf ihrer Zelloberfläche das Protein VLA-4 in hohem Maße konstitutiv exprimiert⁹².

Ausgehend von einem malignen Melanom eines 76jährigen Krebspatienten wurden Zellfragmente einer frischen Melanommetastase Nacktmäusen subcutan (s.c.) injiziert. Nach drei Passagen war die MV3-Zelllinie etabliert.

Innerhalb der Mäuse zeigt sie hohes metastatisches Potential. Nach i.v.-Injektion von 2 · 10⁶ MV3-Zellen entwickelten sich bei 95 % der Nacktmäuse (n=20) innerhalb von 6 Wochen Lungenkolonien. Nach s.c.-Injektion von 2 · 10⁶ MV3-Zellen konnte innerhalb von 7 Wochen bei 95 % der Nacktmäuse (n=20) ein Tumorwachstum festgestellt werden. Desweiteren entwickelten sich bei 90 % der erkrankten Tiere spontane Lungenmetastasen. Histologi-sche und immunohistologiHistologi-sche Befunde zwiHistologi-schen diesen, dem Original-Tumor des Krebspatienten und der Zelllinie in vitro zeigen Übereinstimmun-gen²³⁶.

Bei Zellen der Bezeichnung „PC-3“ handelt es sich um humane epitheliale Prostatakarzinomzellen (ATCC^® CRL-1435™). Diese Zellllinie wurde aus der Knochenmetastase eines Grad IV Prostataadenokarzinoms entwickelt, welches bei einem 62 Jahre alten Kaukasier diagnostiziert worden war²³⁷. Diese Zelllinie wurde uns dankenswerter Weise von Herrn Prof. Dr. Roman Blaheta (Forschungslabor, Urologie und Kinderurologie, Klinikum Johann Wolfgang Goethe-Universität, Frankfurt) zur Verfügung gestellt. Im Gegen-satz zur Melanomzelllinie MV3 zeichnet sich diese Zelllinie durch eine geringe Expression der Integrinuntereinheit 4 aus.

In den durchgeführten Experimenten wurden diese beiden Zelllinien verwendet und miteinander verglichen. Weiterhin wurden aus diesen Zellen durch Transfektion mit shRNA-Plasmiden ebenfalls Klone geschaffen. Diese unterscheiden sich vom jeweiligen Wildtyp durch eine verminderte Cyr61 Expression oder eine reduzierte Expression des membranständigen Proteo-glykans Syndekan-4.

4.2.1 Kulturbedingungen und Nährmedien

Alle Arbeiten mit lebenden Zellen finden zur Vermeidung von Kontamina-tionen mit Hefen, Bakterien und weiteren Fremdkeimen unter aseptischen Bedingungen statt. Die Arbeiten mit offenen Zellkulturflaschen wurden daher unter einer Werkbank mit laminarem Luftstrom und HEPA-Filtern durchgeführt. Alle benötigten Materialien wurden vor Gebrauch 20 Minuten bei 121°C autoklaviert. Die nicht autoklavierbaren Materialien wurden vor Einschleusen in die Werkbank mit Desinfektionsmittel behandelt, ebenso wurde die Arbeitsfläche zuvor mit Bacillol^® AF desinfiziert.

Die Nährmedien werden bei 2-8°C gelagert und vor Verwendung auf Raumtemperatur erwärmt.

Die MV3-Zellen werden in RPMI 1640 Medium mit 10%igem fötalem Kälberserum-Zusatz im Inkubator bei 37°C und einem CO2-Anteil von 5 % (V/V) und einer relativen Luftfeuchte von 96 % kultiviert.

Entsprechend werden die PC-3 Zellen kultiviert, allerdings findet ein zusammengesetztes Nährmedium aus RPMI 1640 Medium mit 10%igem fötalem Kälberserum-, 2%igem HEPES-Puffer 1M-, 1%igem GlutaMax™- und 1%igem Penicillin/Streptomycin-Zusatz Verwendung.

Die durch stabile Transfektion erhaltenen Zelllinien MV3 aCyr61shRNA und MV3 aSDC4shRNA sowie PC-3 aCyr61shRNA werden wie ihre jeweiligen Wildtyp-Zelllinien kultiviert. Zur Selektion der Plasmid-tragenden Zellen wird das jeweilige Nährmedium mit Puromycin (2,5 µg/µL) versetzt.

4.2.2 Inkulturnahme von Zellen

Dauerhaft gelagert werden die Zellen als Suspension in flüssigem Stick-stoff. Die Inkulturnahme der Zellen erfolgt durch zügiges Erwärmen des Inhaltes eines Kryoröhrchen in der Hand. Durch Zugabe von Nährmedium wird die erhaltene Zellsuspension aufgenommen und das Kryoröhrchen nachgespült. Das gesamte Medium wird, um die Zellen von dem zytotoxisch wirkenden DMSO des Kryomediums zu befreien, bei 4°C und 312 x g für 4 Minuten zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wird in Nährmedium resuspen-diert und vollständig in eine T25-Zellkulturflasche mit bereits vorgelegtem Nährmedium gegeben. Anschließend erfolgt die Kultivierung unter oben genannten Bedingungen.

4.2.3 Kultivierung

Alle ein bis zwei Tage werden die Zellkulturflaschen kontrolliert und mikroskopisch betrachtet. Das Nährmedium wird gewechselt, alsbald der Farbindikator Phenolrot eine Sättigung des Nährmediums mit sauren Stoff-wechselprodukten anzeigt und ein Konfluenzgrad von 90 % nicht über-schritten wurde. Liegt ein Konfluenzgrad von 90 % oder höher vor, so wird die Population subkultiviert („gesplittet“). Dazu werden frisches Nährmedium und eine 0,05 % Trypsin/0,02 % EDTA-Lösung im Wasserbad auf 37°C temperiert.

Das Nährmedium wird aus der Zellkulturflasche abgesaugt und der Zell-rasen mit sterilem PBS gespült und ebenfalls abgesaugt. Somit soll eine Inaktivierung von anhaftendem FKS bzw. ein Ablösen von sehr lose und evtl.

schadhaften Zellen gewährleistet sein. Anschließend werden die anhaftenden Zellen mit 0,05 % Trypsin/0,02 % EDTA-Lösung benetzt und die Flasche so lange im Inkubator aufbewahrt, bis das Ablösen der Zellen beobachtet werden kann. Durch Zugabe von Nährmedium wird das Trypsin inaktiviert und nur noch lose anhaftende Zellen werden durch Spülen mit Nährmedium

komplett vom Boden abgelöst. Die resultierende Zellsuspension wird in ein PP-Röhrchen überführt und bei 4°C und 312 x g für vier Minuten zentrifu-giert. Nach Verwerfen des Überstandes wird das Pellet in Medium resuspen-diert. Jeweils ¹/5 bis ¹/20 der Zellen können dann in eine neue Zellkulturfla-sche mit friZellkulturfla-schem Nährmedium ausgesät und bis zur erneuten Konfluenz unter o.g. Bedingungen weiterkultiviert werden.

4.2.4 Kryokonservierung von Zellen

Zur dauerhaften Lagerung der Zellen werden diese in Einfriermedium überführt und anschließend in flüssigem Stickstoff gelagert. Es werden 1 · 10⁶ vitale Zellen nach dem waschen und Ablösen vom Boden der Zellkul-turflasche mit 1 mL des Einfriermediums in ein steriles Kryoröhrchen gegeben. Dieses wird unter Verwendung des Cryo 1°C Freezing Containers über Nacht im -80°C Kühlschrank gelagert. Dieses Behältnis erlaubt die kontrollierte Abkühlung des Mediums um 1°C pro Minute. Am nächsten Tag werden die Kryoröhrchen zur endgültigen Lagerung in den Stickstofftank überführt.

4.2.5 Bestimmung der Zellzahl mittels CASY^® 1 Modell TT

Die Bestimmung der Zellzahl erfolgt nach Zentrifugation und Resuspen-sion des Zellpellets im entsprechenden Nährmedium. Dazu wird die zu vermessende Zellsuspension im Verhältnis 1:500 in sterilfiltrierter CASY^®ton Lösung suspendiert.

Das CASY^® 1 Modell TT ist als Coulter Counter aufgebaut. An einer Kapil-lare mit bekannten Ausmaßen liegt eine Spannung an. Für den Fall, dass diese Kapillare mit Elektrolytlösung gefüllt ist und somit einen elektrischen Leiter mit definiertem Widerstand darstellt, resultiert ein konstanter Strom-fluss. Für die Messung wird die Zellsuspension durch die eingebaute Kapil-lare mit bekanntem Durchmesser gesaugt. Passiert eine Zelle die Öffnung, so

registriert das Gerät einen kurzfristigen Anstieg des elektrischen Wider-standes gegenüber dem reinen Elektrolyten. Intakte Zellen werden als Isola-toren betrachtet. Verringert sich beim Durchtritt von Zellen durch die Kapil-lare der Länge l deren Querschnittsfläche A, so steigt der elektrische Wider-stand R der Lösung an.

R= l A

ρ = spezifischer

Wider-stand Gl. 1

Die Höhe der Widerstandsänderung ist ein Maß für das Zellvolumen. Das CASY^® 1 Modell TT integriert das Messsignal und gibt eine volumenlineare Originalverteilung und eine durchmesserlineare Größenverteilung aus. Es lassen sich somit Aussagen sowohl zur Zellzahl als auch zur Zellgröße und damit Zellviabilität treffen. Als weiteres Ergebnis erhält man die Konzentra-tion der eingesetzten Zellsuspension in Zellen/mL.

Die vorgenommenen Messeinstellungen sind: Kapillare Ø 150 µm, 2 Mess-zyklen à 400 µL Einzelhubvolumen, Partikelgröße 12,5-32,5 µm.