HPLC/MS/MS

Die 4-MAA Analyse wurde mit einer HPLC API 2000, gekoppelt an einen Agilent Series 1100 Liquid Chromatographen, durchgeführt. Folgende Geräteeinstellungen wurden benutzt:

HPLC:

• Säule: Merck Li Chro CART^® 55x4 Purospher^® Star, 3 µm

• Eluenten: A = 5 mmol/l Ammoniumacetat in H20, 0,1% Eisessig B = Acetonitril

• Gradienten: 5 % B 50 % B in 5 Minuten, 50% B 100 % B in 6.

Minute, 1 Minute 100 % B zur Reinigung der Säule, Reequilibrierung mit 5% B für 2 Minuten

• Flussrate: 1 ml/Minute

• Injektionsvolumen: 10 µl

Massenspektrometer (APCI 2000 Triple-Quadrupol Massenspektometer, Perkin-Elmer Sciex Instruments):

• Ionenquelle: APCI bei 400 °C

• Ionisationseinstellung: positiv

• Aquisitionseinstellung: Multiple Reaction Monitoring, MRM

• Kollisionsgas: Stickstoff (N2), 2,0 x 10E-5 torr

• Kollisionsenergie: optimiert für jedes Ionenprodukt 3.2.5.3. Eichlösungen

Zur Durchführung einer quantitativen Bestimmung wurden Lösungen der zu untersuchenden Substanz Metamizol bzw. 4-MAA, und dem internen Standard Dimethylaminophenazon, DMAP, hergestellt. Die 4-MAA-Stammlösung wurde durch Einwaage von 10 mg Reinsubstanz in einen 10 ml fassenden Erlenmeyerkolben und Auffüllung mit 1 %iger Mercaptoethanollösung in 0,06 N HCl hergestellt. Diese Lösung hatte eine Konzentration von 1mg/ml. Von dieser Stammlösung wurde 1 ml abgenommen, in den zuvor mehrfach mit Methanol gespülten und getrockneten Erlenmeyerkolben gegeben und wieder auf 10 ml mit 1

%iger Mercaptoethanollösung in 0,06 N HCl aufgefüllt, so dass eine Arbeitslösung der Konzentration 100 µg/ml entstand. In weiteren Verdünnungsschritten von 1:10 entstanden

Arbeitslösungen mit Konzentrationen von 10 µg/ml und 1 µg/ml. Zur Herstellung der 10 mg/ml Stammlösung wurden 10 mg der 4-MAA-Reinsubstanz direkt in ein spitzes Zentrifugenschliffglas eingewogen, in einem Milliliter der 1 %igen Mercaptoethanollösung angelöst und auf dem Schüttler (Vortex^®) bis zur vollständigen Auflösung der Reinsubstanz geschüttelt.

Analog zur Herstellung der 4-MAA-Stammlösung (1 µg/ml) wurde eine DMAP-Stammlösung in gleicher Konzentration erstellt. Aus dieser DMAP-DMAP-Stammlösung wurden durch 1:10- Verdünnung mit 1 %iger Mercaptoethanollösung in 0,06 N HCl Arbeitslösungen der Konzentrationen 100 µg/ml, 10 µg/ml und 1 µg/ml erstellt. Zusätzlich wurde eine Arbeitslösung der Konzentration 20 µg/ml hergestellt. Hierfür wurden 200 µl der 1 mg/ml in einen Erlenmeyerkolben gegeben und mit der oben genannten Mercaptoethanollösung auf 10 ml aufgefüllt.

Anfänglich wurde als Lösungsmittel Methanol verwendet. Die Standardlösungen waren allerdings in dem wässrigen Milieu nur über wenige Tage stabil, so dass ein Oxidationsschutz verwendet werden musste. Als Oxidationsschutz eignete sich 1%ige Mercaptoethanollösung in 0,06 N HCl.

3.2.5.4. Entwicklung analytischer Methoden

Mit den erstellten Stamm- und Arbeitslösungen wurden wie unter 3.2.5.5 beschrieben Proben erstellt, die zunächst mit einer HPLC mit UV-Detektion (Hewlett Packard HP 1090 Liquid Chromatograph) gemessen wurden. Anfänglich galt es, eine geeignete Säule zur chromatographischen Darstellung des 4-MAA und DMAP zu finden. Weiterhin musste für jede der beiden Substanzen ein Wellenlängenbereich gefunden werden, bei dem eine deutliche Peakformen entstanden und von deren Flächen ein sauberes Integral gebildet werden konnte. Zudem mussten geeignete Eluenten und Gradienten gefunden werden.

3.2.5.5. Proben mit 4-MAA und DMAP

Den Stamm- und Arbeitslösungen wurden Mengen von 10, 25, 50, und 100 µl entnommen, diese in je ein spitzes Zentrifugenschliffglas gegeben und am Rotationsverdampfer unter Vakuum über einem auf 50 °C erhitzten Wasserbad eingedampft. Die eingeengte Substanz

wurde in 100 µl Milli-Q-Wasser angelöst, mit einer Glasspritze in gläserne Probeneinsätze der Autosamplervials überführt und mittels HPLC/UV gemessen.

3.2.5.6. Chromatographie

Bei der HPLC/UV-Messung wurden unter Bezug auf Literaturangaben (ASMARDI und JAMALI 1983, ZYLBER-KATZ et al. 1984, DAMM 1989, AGUNDEZ et al. 1994, AGUNDEZ u. BENITEZ 1996) anfangs verschiedene Säulen eingesetzt: LC-Säule CC 125/3 Nucleosil 120-3 C18 (Machery und Nagel), 5 µm LiChrCART^® 250-4 RP-18 encapped Säule (Merck^®), Supercosil TM LC-18-DB Säule 7,5 x 4,6 x 3.

Als Lösungsmittel wurden zu Beginn der Methodenentwicklung zunächst Acetonitril und Milli-Q-Wasser benutzt. Die Gradienteneinstellung war wie folgt: 30% Acetonitril und 70%

Milli-Q-Wasser bis zur 15. Minute, dann für 3 Minuten 100% Acetonitril, Wiederherstellung der Ausgangsgradienten innerhalb von 2 Minuten und Equilibrierung über 4 Minuten. Das Injektionsvolumen der Probenlösung betrug 25 µl. Für 4-MAA wurden bei der Wellenlänge von 245 nm und für DMAP bei 255 nm die besten Messergebnisse an der eingesetzten HPLC-UV erzielt.

Die Messergebnisse waren hinsichtlich der Reproduzierbarkeit und somit der eindeutigen Identifizierung beider Substanzen nicht zufriedenstellend. Statt eines scharfen vom Untergrund gut abgesetzten Peaks wurden die Substanzen zwar nach einer ihnen zuzuordnenden Retentionszeit detektiert, jedoch als nicht auswertbarer Peak. Deutliche, aber noch nicht zufriedenstellende Verbesserung zeigte der Wechsel der Eluenten: das Milli-Q-Wasser wurde gegen einen Ammoniumacetat-Puffer getauscht. Zusätzlich wurde die Gradienteneinstellung verändert: innerhalb von fünf Minuten wurde von 95 % Ammoniumacetat-Puffer (Eluent A) und 5 % Acetonitril (Eluent B) auf 10 % Ammoniumacetat-Puffer und 90 % Acetonitril gewechselt und der Anfangsgradient von 95 % A und 5 % B nach sieben Minuten wieder erreicht und bis zur achten Minute gehalten. Die Flussrate der Lösungsmittel betrug 1 ml/Minute. Auswertbare Messergebnisse, dass heißt reproduzierbare Messungen mit scharf von dem Untergrund und gegeneinander abgesetzten Peaks beider Substanzen erbrachte der Wechsel der HPLC-Säule. Verwendung fand schließlich eine LiChroCART^® HPLC-Cartridge Purosper^® STAR RP-18 endcapped (3 µm) (Merck, Darmstadt), die laut Herstellerangaben zur Messung amphoterer Moleküle besonders geeignet ist.

3.2.5.7. Extraktion von 4-MAA und DMAP aus Probenmaterial

Nachdem sowohl das 4-MAA als auch der interne Standard der Stamm- und Arbeitslösungen durch oben beschriebene Analysenmethode qualitativ und quantitativ nachzuweisen war, musste eine geeignete Methode zur Extraktion des 4-MAA aus Wasser sowie aus Plasma und Urin erarbeitet werden. Mit dem Ziel, eine möglichst große Extraktionsausbeute zu erhalten, wurden Ergebnisse der Festphasen-Extraktion und der Flüssig-Flüssig-Extraktion bei unterschiedlichen pH-Werten verglichen.

Bei der Festphasen-Extraktion wurden Wasserproben mit verschiedenen Konzentrationen der 4-MAA- und DMAP- Lösungen versehen (gespikt) und jeweils auf eine Säule (Chromabond^® C18, Macherey und Nagel) aufgetragen. Die Substanzen wurden mit Methanol von den Säulen gewaschen und am Rotationsverdampfer über einem 50 °C warmen Wasserbad eingeengt. Die eingeengten Substanzen wurden in je 100 µl des Ammoniumacetat-Puffers angelöst, in HPLC-Messröhrchen (Vials) überführt und mittels HPLC/UV-Detektion gemessen. Im Vergleich zu vorherigen Messungen war die Extraktionsausbeute jedoch zu gering.

Für die Flüssig-Flüssig-Extraktion wurden vier Reagensgläser mit je 5 ml bidestilliertem Wasser und gleicher Menge des internen Standards angesetzt. Zu drei dieser Ansätze wurde 4-MAA in unterschiedlichen Konzentrationen zugegeben. Um ein pH-Optimum herauszufinden, bei dem die Extraktionsausbeute der Substanzen am größten ist, wurde die eben beschriebene Versuchsreihe drei Mal angesetzt: bei pH 7, 9,6 und 14. Der pH-Wert 7 wurde durch Zugabe von 250 µl einer 0,8 molaren Natrium-Phosphatpuffer-Stammlösung, pH 9,6 durch Zusatz von 5 g geglühtem Natriumsulfat als Festpuffer und pH 14 durch Hinzufügen von 10 bis 12 Tropfen einer 1 molaren Kaliumhydroxidlösung bzw. alternativ durch 4 Tropfen einer 5 molaren Kaliumhydroxidlösung eingestellt. Durch Universalindikatorpapier wurde die Einstellung des pH-Wertes jeder einzelnen Probe überprüft. Anschließend wurden zu jeder Probe 5 ml tertiär-Butylmethylether (TBME) gegeben. Die mit Glasstopfen verschlossenen Reagensgläser wurden in horizontaler Ebene 20 Minuten auf einen Schüttler verbracht, dass die zu untersuchenden Substanzen durch den Ether aus der wässrigen Phase extrahiert wurden. Die geschüttelten Proben wurden bei 1000 g 5 Minuten zentrifugiert, die die Testsubstanzen enthaltende Etherphase mit Pasteurpipetten in spitze Zentrifugenschliffgläser überführt und am Rotationsverdampfer eingeengt. Die eingedampften Substanzen wurden in 100 µl Ammoniumacetatpuffer angelöst und zur

Messung an der HPLC-UV in Autosamplervials überführt. Gute Extraktionsausbeuten wurden bei pH 9,6 und 14 erzielt.

Zur Ermittlung des Extraktionsverhaltens von 4-MAA und DMAP aus biologischer Matrix wurden nach oben beschriebenem Aufarbeitungsschema anstelle der Wasserproben Urin und Plasma bei den drei verschiedenen pH-Werten aufgearbeitet und gemessen. Auch hier wurden bei 9,6 und 14 gute Ausbeuten der Extraktion erhalten. Die bei pH 9,6 extrahierten Proben zeigten deutliches Untergrundrauschen in ihren Chromatogrammen. Diese entsteht dadurch, dass im sauren und neutralen Milieu Störfaktoren der biologischen Matrix in die Etherphase übergehen und in den Chromatogrammen die genaue Identifizierung der zu untersuchenden Substanz stören, indem sie deren Peakformen basal durch An- und Überlagerung verändern.

Bei pH 14 stellen sich diese Störfaktoren nicht dar, dass die Aufarbeitung der im Folgenden zu messenden Proben bei pH 14 durchgeführt wurde.

3.2.5.8. Aufarbeitung des Urins mit Hydrolyseschritt

Zur Prüfung, ob 4-MAA in konjugierter (glucuronidierter oder sulfatierter) Form mit dem Urin ausgeschieden wird, wurden Hydrolyseschritte in die Flüssig-Flüssig-Aufarbeitung einbezogen.

Hierzu wurden jeweils 5 ml einer 4-MAA enthaltenden Urinprobe aus dem Vorversuch mit dem internen Standard versetzt und einer Hydrolyse mit ß-Glucuronidase von Escherichia coli, Glucuronidase/Arylsulfatase von Helix pomatia und Cystein bei derem jeweiligen pH- Optimum unterzogen. Nach den enzymspezifischen Inkubationszeiten und –bedingungen wurden die Urinproben auf pH 14 eingestellt und wie oben beschrieben mittels Flüssig-Flüssig-Extraktion weiter aufgearbeitet. Zum Vergleich wurden 5 ml der ersten Urinprobe des Vorversuchs ohne Hydrolyse entsprechend aufgearbeitet und alle Proben mittels HPLC-UV gemessen. Aufgrund des Ergebnisses, dass eine Aufarbeitung mit Hydrolyse keine größeren Extraktionsausbeuten ergab, war davon auszugehen, dass 4-MAA in freier Form mit dem Urin ausgeschieden wird. Somit wurden alle weiteren Aufarbeitungen ohne Hydrolyseschritt durchgeführt.

3.2.5.9. Aufarbeitung des Probenmaterials einschließlich der Proben für die Validierung

Die Aufarbeitung der Proben erfolgte für Plasmaproben nach dem Schema der Abbildung 5 und für Urinproben nach dem Schema der Abbildung 6 ohne Hydrolyse. Für Urinproben im Konzentrationsbereich von Null bis 100 µg/ml 4-MAA wurde die Aufarbeitung modifiziert:

es wurden 5 ml Urin mit 2 µg DMAP (20 µl der 100 µg/ml Arbeitslösung) versetzt, die gesamte Etherphase eingeengt und in 200 µl Anfangspuffer aufgenommen. Nach der Aufarbeitung waren einige Plasmaproben stark getrübt. Vermutlich führten ausgefallene Proteine und Lipide zu dieser Trübung. Um einer im Vorversuch mehrfach beobachteten Verstopfung der zur Säule des Chromatographen zuführenden Kapillare vorzubeugen, wurden diese aufgearbeiteten Plasmaproben nochmals bei 3000 g für 15 Minuten zentrifugiert. Der Überstand konnte vorsichtig, ohne den Bodensatz aufzuwirbeln, mit einer Glasspritze in Autosamplervials überführt werden. Die Messung aller Proben des Hauptversuches einschließlich derer für die Validierung, wurde mit HPLC/MS/MS wie unter 3.2.5.2 und 3.2.5.6 beschrieben durchgeführt.

Nach Aufarbeitung aller Plasma- und Urinproben des Vorversuches wurde die Dauer der Probenentnahme für den Hauptversuch festgelegt. Im Vorversuch zeigte sich, dass Metamizol bzw. 4-MAA im Plasma nach 24 Stunden und im Urin nach 96 Stunden nicht mehr nachgewiesen werden konnte. Unter Berücksichtigung einer Sicherheitszeitspanne wurden die Entnahmezeiten für Plasma bis zu 96 Stunden und für Urin bis zu 168 Stunden nach der Arzneimittelinjektion festgelegt. Im Vorversuch wurde Metamizol in einer Dosierung von 40 mg/kg Körpergewicht verabreicht. Sowohl die erste Plasma- als auch die erste Urinprobe war bei einer aufgearbeiteten Probenmenge von 5 ml nicht messbar. Es schien, als wäre die Chromatographiesäule bei der hohen 4-MAA-Konzentration überladen. Folglich ergaben sich undeutliche Chromatogramme. Somit wurde die Dosierung des Metamizol für den Hauptversuch auf 30 mg/kg Körpergewicht und das aufzuarbeitende Probenaliquot auf einen Milliliter reduziert.

Bei dem ersten Versuch der Validierung der Methode konnten keine annehmbaren Kalibrationsreihen mit methanolischen 4-MAA- und DMAP-Standard- und Arbeitslösungen erzielt werden. Das 4-MAA erschien instabil zu sein. Die Standard- und Arbeitslösungen verfärbten sich mit zunehmender Lagerzeit gelblich. Laut MERCK-INDEX (1989) soll das 4-MAA unter Lichteinfluss und im wässrigen Milieu oxidieren. Um dem entgegenzukommen

wurden die Standard- und Arbeitslösungen mit 1%-iger Mercaptoethanol- Lösung in 0,06 N Salzsäure als Oxidationsschutz hergestellt und dadurch akzeptable Eichkurven erhalten.

Die Abbildungen (5) und (6) stellen das Schema der Aufarbeitung von Plasma- bzw. von Urin proben dar, nach denen auch die Proben des Hauptversuchs bearbeitet wurden.

Probenvorbereitung:

1 ml Plasma im Zentrifugenschliffglas

+ 1,0µg Dimethylaminophenazon als interner Standard (50µl einer 1%igen Mercaptoethanol-Lösung (in 0,06N HCL),

die 20µg/ml Dimethylaminophenazon enthält) + 50µl 5 M KOH, schütteln (Vortex),

mit pH-Papier überprüfen,

gegebenenfalls mit KOH (5M ) einstellen auf pH 14 + 5 ml tert.-Butylmethylether,

mit Stopfen versehen

Etherphase mit Pasteurpipette in Spitzglas überführen, am Rotationsverdampfer einengen

Etherphase trocknen,

in 200µl Ammoniumacetatpuffer anlösen (Vortex), evtl. bei 3000rpm für 15 Minuten zentrifugieren, mit Pasteurpipette aufnehmen (Vorsicht Bodensatz) und in Autosamplervials überführen und

10µl pro Messung in das LC/MS injizieren Abb. 5: Nachweis von Metamizol im Pferdeplasma mittels LC/MS

20 Minuten schütteln und

anschließend 5 Minuten bei 1800 rpm zentrifugieren

Probenvorbereitung (Konzentrationsbereich 100-8000µg/ml):

1 ml Urin im Zentrifugenschliffglas

+ 50µg Dimethylaminophenazon als interner Standard (50µl einer 0,1%igen Mercaptoethanol-Lösung (in 0,06 N

HCL), die

1 mg/ml Dimethylaminophenazom enthält) + 75µl 5 M KOH, schütteln (Vortex),

mit pH-Papier überprüfen,

gegebenenfalls mit KOH (5M ) einstellen auf pH 14 + 5 ml tert.-Butylmethylether,

mit Stopfen versehen

20 Minuten schütteln und

anschließend 5 Minuten bei 1800 rpm zentrifugieren

1ml der Etherphase mit Eppendorfpipette in Spitzglas überführen,

am Rotationsverdampfer einengen

in 1ml Ammoniumacetatpuffer anlösen (Vortex), mit Pasteurpipette in Autosamplervials überführen,

10µl pro Messung in das LC/MS injizieren

Abb. 6: Nachweis von Metamizol im Pferdeurin mittels LC/MS

3.3. Validierung der Methode

3.3.1. Grundlagen der Validierung

Unter Validierung versteht man den Nachweis und die Dokumentation der Zuverlässigkeit einer analytischen Methode zur Erzeugung reproduzierbarer Daten. Als ein Instrument der Qualitätssicherung ist sie Voraussetzung für die quantitative Bestimmung unterschiedlicher Substanzen. Sie umfasst alle Teilschritte der Bestimmungsmethode, d. h. sie zeigt, dass die Methode der Probenaufarbeitung und Messung für den beabsichtigten Zweck, der Erzeugung ergebnissicherer pharmakokinetischer Daten für den Wirkstoff Metamizol, geeignet ist. In dieser Studie sind folgende Elemente in die Validierung einbezogen:

• Selektivität, Spezifität

• Linearität

• Richtigkeit

• Präzision

• Nachweis- und Quantifizierungsgrenze

• Stabilität

• Wiederfindungsrate

3.3.1.1. Selektivität, Spezifität

Die Selektivität bzw. Spezifität gibt an, inwieweit ein Verfahren hier die HPLC/MS/MS- Methode für eine bestimmte Substanz in Gegenwart anderer Substanzen präzise Ergebnisse liefert, d. h. inwieweit es zwei Substanzen unterscheiden und trennen kann. Jede Substanz muss zu einer für sie charakteristischen Retentionszeit von der Säule getragen werden und im Chromatogramm einen deutlichen von Störpeaks zu trennenden Peak darstellen.

Wie in Kapitel 3.2.5.7 beschrieben, wurden Leerplasma und –urinproben mit Proben, denen 4-MAA zugesetzt wurde, verglichen. Es konnte festgestellt werden, dass die Analyten (4-MAA und DMAP) ohne Verfälschung durch Serum- bzw. Urininhaltsstoffe (Spezifität) und ohne gegenseitige Störung bei ausreichender Trennung (Selektivität) darzustellen sind.

3.3.1.2. Linearität

Die Linearität beschreibt die Proportionalität zwischen den Messergebnissen und den theoretischen Konzentrationen. Sie gilt nur für einen bestimmten Konzentrationsbereich.

Nach DIN 38402 A51 (1986) erfolgt die Überprüfung der Linearität der Methode an mindestens 5 Leerproben, denen unterschiedliche Konzentrationen der zu untersuchenden Substanz zugesetzt werden. Diese fünf Konzentrationen müssen äquidistant fortlaufend den gesamten Kalibrationsbereich abdecken. Jede Konzentrationsstufe wurde doppelt aufgearbeitet und gemessen. Laut DIN 32645 (1994) werden Blankproben und Konzentrationen unterhalb der Nachweisgrenze hierfür nicht berücksichtigt. Die Messreihe muss mindestens drei Mal an unterschiedlichen und voneinander unabhängigen Tagen aufgearbeitet und gemessen werden. Da sich der Kalibierbereich sowohl im Plasma als auch im Urin über zwei bzw. drei Zehnerpotenzen erstreckte, wurde für beide Matrices die Linearität im niedrigen und hohen Konzentrationsbereich überprüft. Die gewählten Konzentrationen sind in den Tabellen 2 und 3 aufgeführt.

Tabelle 2: Konzentrationen 4-MAA im Leerplasma zur Bestimmung der Kalibrationskurve

Konzentrationsbereich Konzentration in µg/ml

Niedrig 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10

Hoch 10, 50, 100, 150, 200, 250

Tabelle 3: Konzentrationen 4-MAA im Leerurin zur Bestimmung der Kalibrationskurve

Konzentrationsbereich Konzentration in µg/ml

Niedrig 0,5, 1, 2,5, 5, 10, 25, 50, 75, 100

Hoch 100, 500, 1000, 2000, 4000, 6000, 8000

Aus dem Integral der erhaltenen Peakflächen des Analyten (4-MAA) und des internen Standards (DMAP) wurde der Quotient errechnet und gegen die Konzentration der Kalibratoren aufgetragen. Die entstehende Kalibriergerade wurde visuell auf Ausreißer und Linearität untersucht. Unter Einbezug der Steigung dieser Geraden wurde auf die

„ gemessene“ Konzentration zurückgerechnet (back calculation, BC). Die BC durfte dabei um maximal 15% und die Konzentration an der unteren Bestimmungsgrenze (lower limit of quantification, LLQC) um maximal 20% von der theoretischen Konzentration abweichen (EHSLC 2002).

3.3.1.3. Richtigkeit

Die Richtigkeit gibt die Abweichung des Mittelwertes von einem erwarteten Referenzwert (wahren Wert) an. Sie hängt von der Größe systematischer Fehler, wie z.B. unkorrektes Einwiegen des Analyten zur Herstellung einer Stammlösung oder Pipettierfehlern bei der Erstellung der Kalibierreihe, ab.

Um die Richtigkeit zu überprüfen, wurden an drei unterschiedlichen Tagen jeweils fünf Blankproben beider Matrices innerhalb des Messbereiches mit einer niedrigen (low quality control standard, LQC), einer mittleren (midrange quality control standard, MQC) und einer hohen (high quality control standard, HQC) Konzentration der nachzuweisenden Substanz gespikt, aufgearbeitet und quantifiziert (EHSLC 2002). Im niedrigen Konzentrationsbereich sind Abweichungen von den erwarteten Ergebnissen von bis zu 20% und im mittleren und hohen Konzentrationsbereich von bis zu 15% zulässig. Zur Ermittlung der relativen Abweichung (relativer Fehler, RE) des gemessenen Wertes von dem theoretisch zu erwartenden Wert wird der Mittelwert aller fünf Konzentrationen eines Konzentrationsbereiches (A) und die theoretische Konzentration (B) zueinander in Beziehung gesetzt und wie folgt berechnet (EHSLC 2002):

RE (%) =  (A-B)/B x 100 [16]

3.3.1.4. Präzision

Die Präzision ist das Maß für die Streuung eines Analysenergebnisses bei wiederholter Durchführung der Messung gleicher Proben . Die Standardabweichung (S) bzw. die relative Standardabweichung (Variationskoeffizient) wiederspiegeln die Präzision des Verfahrens

zahlenmäßig. Bei der Präzision unterscheidet man Wiederholpräzision sw (intraday repeatability oder Tagespräzision) und Zwischenpräzision sb (interday repeatability).

Zur praktischen Ermittlung der Präzision werden jeweils fünf LQC-, MQC- und HQC- Proben des Kalibrationsbereiches beider Matrices an drei unterschiedlichen Tagen aufgearbeit und mittels HPLC/MS/MS quantifiziert. In Relation zum gemessenen Mittelwert dürfen die Präzisionen im niedrigen Kalibrationsbereich nicht mehr als 20% bzw. im mittleren und hohen Kalibrationsbereich nicht mehr als 15% abweichen (EHSLC 2002). Die Präzisionen können wie folgt berechnet werden (EHSLC 2002):

Sw =

(

^⋅

)

In den Gleichungen entspricht „ f“ der Anzahl der Messungen –1 (bzw. den Freiheitsgraden),

„ X“ dem Mittelwert gleicher Konzentrationen und „ s“ der Standardabweichung.

3.3.1.5. Nachweis- und Quantifizierungsgrenze

Unter Nachweisgrenze (Detektionsgrenze, limit of detection, LOD) versteht man die niedrigste Konzentration, bei der sich eine Substanz unter den angegebenen Messbedingungen noch qualitativ bestimmen lässt, indem ein vom Untergrundrauschen der Blankproben deutlich zu unterscheidendes Instrumentensignal detektiert wird.

Für diese Studie wurde die Nachweisgrenze durch Ermittlung des Signal-Rausch-Verhältnisses empirisch bestimmt. Hierzu wurde zunächst 4-MAA in drei verschiedenen Konzentrationen des unteren Konzentrationsbereiches in Plasma- und Urin-Leerproben gegeben. Für Plasma wurden die 4-MAA Konzentrationen 25, 100 und 250 ng/ml und für Urin 100, 250 und 500 ng/ml gewählt. Jede Probe wurde dreifach aufgearbeitet und

gemessen. An zwei Ionenübergängen (218/97 und 187/57) wurde von den Peakhöhen der niedrigsten, sich vom Untergrundrauschen abhebenden Konzentrationsstufe der Mittelwert und die Standardabweichung gebildet. Dann wurde die Peakhöhe des Untergrundrauschens von 10 Blankproben in Plasma und Urin ermittelt und daraus jeweils ein Mittelwert gebildet.

Nach Addition des 4-MAA-Signal-Mittelwertes zu dem dreifachen der Standardabweichung muss sich ein Verhältnis zum Mittelwert der Peakhöhen des Untergrundrauschens von mindestens 3:1 ergeben.

Die Bestimmungsgrenze (Quantifizierungsgrenze, limit of quantification, LOQ) legt die niedrigste mit akzeptabler Präzision und Richtigkeit quantitativ bestimmbare Konzentration einer zu analysierenden Substanz fest.

Zur Bestimmung der Quantifizierungsgrenze sind mindestens fünf Proben im gewählten Konzentrationsbereich aufzuarbeiten und mittels HPLC/MS/MS zu quantifizieren. Die Abweichung zwischen einem mittleren Messergebnis und dem erwarteten Referenzwert darf nicht mehr als 20% betragen. Die Bestimmungsgrenze (BG) kann annähernd errechnet werden: BG 3 · NG [19]

3.3.1.6. Stabilität

Es ist für die gesamte Dauer des Ausscheidungsversuches, von der Probenentnahme bis zum Abschluss der Analytik, zu gewährleisten, dass die zu quantifizierende Substanz bei der Lagerung stabil ist. Zur Ermittlung der Stabilität im Plasma wurden 24 Blankplasmaproben mit 4-MAA versetzt, so dass jeweils 12 Ansätze mit Konzentrationen 10 µg/ml bzw. 100 µg/ml erstellt wurden. Zur Ermittlung der Lagerstabilität von 4-MAA im Urin wurden ebenfalls 24 Blankurinproben mit 4-MAA versetzt (12 Proben einer 100 µg/ml und 12 Proben einer 1000 µg/ml Konzentration). Proben gleicher Konzentrationen wurden gepoolt und auf 12 Reagensgläser zu gleichen Mengen verteilt. Sechs Proben jeder Konzentration wurden sofort mit internem Standard versetzt, aufgearbeitet und zusammen mit einer Kalibrationsreihe mittels HPLC/MS/MS quantifiziert. Die restlichen Proben wurden unter gleichen Bedingungen wie die Proben des Ausscheidungsversuches der Pferde über acht Wochen bei minus 20 ºC tiefgefroren. Nach diesem Zeitraum, der der maximalen Lagerungsdauer der Versuchsproben entspricht, werden diese Proben mit einer frisch erstellten Kalibrationsreihe gemessen.

Für Plasma und Urin getrennt werden die Mittelwerte der zwei Messreihen mit dem T-Test bei einseitiger Fragestellung verglichen. Von den Messreihen werden die Mittelwerte (X1 und X2), die Standardabweichungen (s1 und s2), die Anzahl der Messungen (n1 und n2) sowie die Freiheitsgerade (f1 und f2) bestimmt. Die Prüfgröße PGT wird wie folgt berechnet:

PGT =

Der kritische Wert KWt kann aus statistischen Tabellen entnommen oder wie folgt berechnet werden:

KWt = TINV ( · 2/f1+f2) [21]

Ist die Prüfgröße PGT kleiner als der kritische Wert KWt liegen zwischen den Mittelwerten der Messreihen mit einer Fehlerwahrscheinlichkeit von 0,01 keine Unterschiede vor.

Ist die Prüfgröße PGT kleiner als der kritische Wert KWt liegen zwischen den Mittelwerten der Messreihen mit einer Fehlerwahrscheinlichkeit von 0,01 keine Unterschiede vor.

Im Dokument Untersuchung zur Pharmakokinetik des Arzneistoffes Metamizol hinsichtlich der Dopingrelevanz beim Pferd (Seite 67-0)