Analytik

Analysenmethoden, die in der modernen Dopinganalytik zum Einsatz kommen, sind neben immunologischen Methoden (wie z.B. Radioimmunassay (RIA), Enzyme-linked Immunosorbant Assay (ELISA)) in erster Linie chromatographische Trennverfahren. Unter dem Begriff der Chromatographie sind verschiedene physikalische Trennmethoden zusammengefasst, die alle nach einem einheitlichen Prinzip funktionieren. Es beruht darauf, dass das zu trennende Stoffgemischgemisch mit einer beweglichen (mobilen) Phase über eine ruhende (stationäre) Phase transportiert wird, wobei eine Wechsel der Komponenten zwischen den beiden Phasen stattfindet, der zu einer Trennung des Gemisches aufgrund unterschiedlicher Polarität führt. Die mobile Phase kann flüssig oder gasförmig sein, die

stationäre Phase fest oder flüssig (SCHWEDT 1986). Nach dem Trennprinzip bzw. der Ausführungstechnik werden folgende chromatographische Trennmethoden unterschieden:

• Papierchromatographie (PC)

• Dünnschichtchromatographie (DC, engl.: TLC – thin layer chromatography)

• Gas-Chromatographie (GC)

• Säulen- oder auch Flüssigchromatographie (LC)

Da in dieser Studie ein Verfahren der Flüssigchromatographie angewendet wurde, soll nachfolgend nur diese chromatographische Methode beschrieben werden.

Die LC wird zum Auftrennen verschiedener in Lösung befindlicher Substanzen genutzt.

Vorteile gegenüber einer GC-Methode liegen u.a. darin, dass auch Substanzen mit hohem Siedepunkt als auch sehr polarer Substanzen nachgewiesen werden können (SCHOENE 1996). In der LC ist die stationäre Phase in einem langgestreckten Trennbett in einem Rohr als Säule angeordnet. Das zu trennende Gemisch wird auf das eine Ende der Säule gegeben, die mobile Phase fließt mit Hilfe einer Pumpe unter Überdruck durch die Säule. Je nach Säulendurchmesser und mittlerem Durchmesser der Teilchen der stationären Phase unterscheidet man zwei apparativ unterschiedlich ausgestattete Techniken (SCHWEDT 1986):

• Klassische Säulenchromatographie: innerer Säulendurchmesser ca. 1 cm und größer, Teilchendurchmesser zwischen 100 und 200 µm, Durchfluss der mobilen Phase unter Atmosphärendruck oder maximal bis 5 bar

• Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC- High Pressure Liquid Chromatography): Teilchendurchmesser kleiner als 50 µm, Säulendurchmesser ca. 2 – 6 mm, Gefäßmaterial meist Stahl

Nach UNGER et al. (1995) eignet sich die HPLC-Methode zur Analyse von schwerflüchtigen, stark polaren und ionische (z.B. Säuren, Basen), thermisch instabilen und leicht zersetzlichen Substanzen, als auch von solchen mit hoher Molmasse innerhalb kurzer Zeit (Dauer der Analyse zwischen einer Minute bis zu ca. einer Stunde). Ein Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatograph besteht aus 4 Haupt-Elementen (SCHWEDT 1986):

1. Pumpe: dient der konstanten pulsationsfreien Strömung des Lösungsmittels;

befördert das Lösungsmittel aus einem Vorratsgefäß in die Säule; hält einen bestimmten Druck aufrecht

2. Einspritzsystem: gibt die Probe (1 bis 2000 µl) in den Strom der mobilen Phase

3. Trennsäule mit Füllung 4. Detektor

Die Ummantelung der Säulen besteht zumeist aus Edelstahl aber auch aus Tantal oder Kupfer.

Das Innere der Trennsäule, welches die stationäre Phase darstellt, besteht aus einem stabilen dichten Verband kleiner poröser Teilchen (Durchmesser kleiner als 20 µm), wodurch ein hohes Verhältnis von Oberfläche zu Volumen hergestellt und hohe Druckstabilität gewährleistet wird (UNGER et al. 1995). Als stationäre Phase werden Substanzen, ausgerichtet nach physikalischen Eigenschaften (Polarität, Löslichkeit) der zu extrahierenden Substanz, wie Kieselgel, Aluminium, Nitrite, Oktadecylsilane und Sulfonate verwendet. Als mobile Phase stehen verschiedene Lösungsmittel, auch in Konzentrationen und Kombinationen, wie z.B. Petrolether, Hexan, Diethylether, Chloroform, Acetonitril, Ethanol, Methanol und Wasser zur Auswahl (SCHOENE 1996). Die HPLC bietet die Möglichkeit der einfachen Adsorbtionschromatographie, geeignet für Moleküle mit geringer Polarität, als auch die der Ionenaustauscher-Chromatographie für positiv oder negativ geladene Teilchen (SCHOENE 1996).

Die mobile Phase wird nach Verlassen der Trennsäule durch einen Detektor geführt, der die Aufgabe besitzt, ein chromatographisches Konzentrationsprofil sichtbar zu machen. Aus den Chromatogrammen soll die Retentionszeit, das Retentionsvolumen und die Konzentration der zu analysierenden Substanz zu entnehmen sein. Ultraviolett- (UV-), Fluoreszenz- oder Ionenstrom-Detektoren finden zumeist Anwendung. Eine sensiblere und spezifischer Identifizierung einer Substanz ist jedoch über die Detektion eines Massenspektrometers gegeben. Anforderungen an einen Detektor sind ein geringer Rauschpegel, um Substanzen auch im niedrigen Konzentrationsbereich noch sicher darzustellen und hohe Empfindlichkeit für nachzuweisende Substanzen. Zudem muss er geringe Drift aufzeigen, was bedeutet, dass die Nulllinie über längere Zeit stabil zu halten ist, damit Änderungen des Messwertes in einem Zeitintervall möglichst gering sind (SCHWEDT 1986).

In dieser Studie wird ein MS/MS-Tandem-System verwendet. Dieses erzeugt aus einer Substanzprobe einen gasförmigen Ionenstrahl, trennt die Ionen nach Masse und Ladungen und erzeugt so ein Massenspektrum. Dabei werden die pro Zeiteinheit gebildeten Ionenmengen als Ionenströme bezeichnet, die in der Summe den Gesamt- oder

Totalionenstrom ergeben (BUDZIKIEWICZ 1998). Es werden verschieden Methoden der Ionisation, die unter atmosphärischem Druck ablaufen unterschieden:

- Chemische Ionisation unter atmosphärischem Druck (Atomsperic Pressure Chemical Ionisation, APCI)

- Photoionisation unter atmosphärischem Druck (Atomspheric Pressure Photoionisation, APPI)

- Elektrospray-Ionisation (ESI)

Bei diesen Methoden werden Substanzmoleküle im Lösungsmittel zunächst unter atmosphärischem Druck in substanzspezifische Ionen (Fragment-Ionen) zerlegt und anschließend von den Molekülen des Lösungsmittels getrennt. In dieser Studie wird die Methode der APCI verwendet. Der aus der LC-Säule austretende Eluent wird unter atmosphärischem Druck über eine geheizte Kapillare geleitet und in eine geheizte evakuierte Kammer versprüht. Eine in der Verdampfungskammer befindliche Glühkathode ionisiert die in der Gasphase befindlichen Moleküle, dass entstehende geladene Teilchen über eine kleine Öffnung der Gaskammer in das Massenspektrum geleitet werden. Dem Massenspektrum sind ein System zur Trennung der geladenen Teilchen und ein Detektor angeschlossen (LEHMANN 1996).

In dem verwendeten Tandem-Massenspektrometer werden durch vier hintereinander geschaltete Quadrupole die Ionen zunächst getrennt, dann zum Zerfall gebracht und letztlich die entstehenden Tochterionen erneut getrennt. Der erste Quadrupol, der zu einer Aufreinigung und Selektion der Ionen des Analyten führt, besteht aus vier parallel im Quadrat angeordneten Metallstäben, von denen kreuzweise jeweils zwei miteinander leitend verbunden sind. Es wird an zwei einander gegenüberliegenden Stäben eine Wechselspannung angebracht, dass abwechselnd positive und negative Felder relativ zur Mittelachse erzeugt werden, die eine Ionentrennung bewirken. Die angelegte Spannung kann so eingestellt werden, dass nur die Ionen der zu analysierenden Substanz gerade durch das elektrische Feld geleitet werden und andere Ionen aus dem Feld in die Umgebung abgeleitet und neutralisiert werden. Im zweiten, auch als Stoßkammer bezeichneten Quadrupol, kommt es zur Fragmentierung der Ionen des Analyten durch Kollisionsaktivierung mittels Stickstoffmolekülen. Entstandene Tochterionen gelangen in ein weiteres Stabquadrat, dem ebenfalls eine bestimmte Spannung angelegt ist, um bestimmte Ionen zu selektieren und andere zu neutralisieren und zu eliminieren. Die selektierten Tochterionen werden in den

Detektor weitergeleitet. In diesem Fall wird der Detektor als Reaktionsdetektor bezeichnet, da die in der Trennsäule eluierten Substanzen in chemischen Reaktionen verändert und danach erst detektiert werden. Für die bei diesen chemischen Reaktionen entstanden Ionen besitzt der Detektor im Vergleich zum ursprünglichen Molekül eine bessere Selektivität und Empfindlichkeit (BUDZIKIEWICZ 1998).