Eignung der erarbeiteten Analysenmethode (HPLC/MS/MS) für den

Metamizol beziehungsweise 4-MAA wurde im Institut für Biochemie der Deutschen Sporthochschule Köln in Plasma und Urin bislang gaschromatographisch mit nachfolgender Massenspektrometrie qualitativ analysiert (SCHÄNZER, persönliche Mitteilung). Die dafür zuvor verwendete Aufarbeitungsmethode, einschließlich einer basischen Extraktion der Substanz, wurde für das HPLC/MS/MS-Verfahren modifiziert. Die aufzuarbeitende Plasma- und Urin-Menge wurde verringert; die Aufnahme der eingeengten Etherphase erfolgte anstatt in Methanol in einem Ammonium-Acetat-Puffergemisch, welches dem HPLC-Anfangsfließmittel entspricht. Die bisher verwendete Analysenmethode erwies sich als unzureichend empfindlich und lieferte zudem unbefriedigende Peakformen im Chromatogramm, die eine ungenaue Integration bedingten. Entsprechend erfolgte keine Quantifizierung des 4-MAA. Die Einführung einer HPLC-Methode zur Analyse von 4-MAA war darin begründet, die Empfindlichkeit des Analyseverfahrens zu verbessern. Zudem sollte eine schärfere Darstellung der Peakform und eine bessere Detektion die Quantifizierung

ermöglichen. In dem bestehenden Routineverfahren des Institutes für Biochemie der Sporthochschule Köln wurde Ether als organisches Extraktionsmittel für 4-MAA aus Pferdeplasma und –urin verwendet. Ether eignet sich besonders gut zur Extraktion basischer Verbindungen, wie sie das Metamizol bzw. 4-MAA darstellt. Mit dem Ether werden aber auch Substanzen aus den biologischen Matrices gelöst, die die Analytik stören. Um dem entgegenzuwirken, wird der pH-Wert vor der Extraktion stark basisch (pH 14) eingestellt, dass saure und neutrale Verbindungen in der entsprechenden Matrix zurückbleiben und nicht in die Etherphase übergehen.

Im Vorversuch wurde zusätzlich überprüft, ob 4-MAA im Pferdeurin in konjugierter (glucuronidierter, sulfatierter) Form vorliegt. Dazu wurden auf Routineverfahren des Institutes für Biochemie der Sporthochschule Köln basierende Methoden zur Hydrolyse verwendet. Die Hydrolyse von 4-MAA enthaltenden Pferdeurin mit ß-Glucuronidase von Escherichia coli, ß-Glucuronidase/Arylsulfatase und Cystein vor der eigentlichen Aufarbeitung erbrachte keine Verbesserung der Extraktionsausbeute im Vergleich zur Aufarbeitung der Urinproben ohne Hydrolyse. Auch sind der Literatur (POPOT et al. 2000) bezüglich der Ausscheidungsform des 4-MAA mit dem Pferdeurin keinerlei Angaben zu entnehmen. Es ist somit anzunehmen, dass 4-MAA beim Pferd in freier Form mit dem Urin ausgeschieden wird.

In Anlehnung an die Vorgaben der EHSLC (2002) wurde die Analysenmethode durch Validierung auf Eignung zum Nachweis von 4-MAA in Plasma und Urin des Pferdes geprüft.

Dabei wird durch die Spezifität der Methode sichergestellt, dass sowohl das 4-MAA als auch der interne Standard (DMAP) ohne Verfälschung von Serum- bzw. Urininhaltsstoffen (Störpeaks) darzustellen sind. Die Selektivität bestätigt, dass bei der Methode eine ausreichende Trennung ohne gegenseitige Störung beider Substanzen auch aufgrund unterschiedlicher Retentionszeiten gewährleistet ist. Die Proportionalität zwischen den Messergebnissen und den theoretisch zu erwartenden Konzentrationen wurde im Plasma im Bereich von 0,25 bis 10 µg/ml und von 10 bis 250 µg/ml bzw. im Urin im Bereich von 0,5 bis 100 µg/ml und 100 bis 8000 µg/ml geprüft und bestätigt. Dabei folgen die Kalibrationsgleichungen aller Messungen einer quadratischen Gleichung. Das Bestimmtheitsmaß (R²) der quadratischen Regression erreicht bei allen Messungen im Plasma einen Wert von R² > 0,994, bzw. im Urin einen Wert von R² > 0,995, so dass die Methode als geeignet einzustufen ist. Die Richtigkeit (relativer Fehler) der Methode, repräsentiert durch die relative Abweichung [RE (%)] der Mittelwerte der gemessenen Konzentrationen eines Tages von den theoretisch zu erwartenden, wurde an drei Messtagen überprüft und bewiesen.

Die Kriterien für die Präzision (intraday repeatability und interday repeatability) wurden ebenfalls erfüllt. Bei allen bisher genannten Validierungsparametern blieben die höchstzulässigen Abweichungen bei beiden Matrices innerhalb von 15% im oberen und 20%

im mittleren und unteren Kalibrationsbereich. Die Nachweisgrenze für 4-MAA im Plasma beträgt 0,25 µg/ml und ist vergleichend zu anderen Studien, die allerdings auf andere Analyseverfahren beruhen, relativ hoch. Dennoch ist die erarbeitete Methode empfindlich genug, den 4-MAA-Nachweis in dopingrelevanten Proben zu gewährleisten. Bei gaschromatischem Nachweis und Detektion durch ein Massenspektrometer erreichte SCHLINGLOFF (1997) eine Nachweisgrenze von 3,9 ng/ml Pferdeplasma. DAMM (1989) erzielte mittels HPLC-Trennung und UV-Detektion bei 265 nm eine Nachweisgrenze von 0,1 µg/ml Humanplasma und 2 µg/ml Humanurin. In dieser Studie konnte im Pferdeurin eine Nachweisgrenze von 0,5 µg/ml ermittelt werden. Weitere Vergleiche zu Studien aus dem humanmedizinischen Bereich (AGUNDEZ et al. 1994, ASMARDI und JAMALI 1983, ZYLBER-KATZ et al. 1984) sind nicht möglich, da diese auf andere Nachweisverfahren (HPLC-UV) basieren und zudem keine Nachweisgrenzen genannt werden. POPOT et al.

(2000) weisen Metaboliten des Metamizols (FAA, AA, AAA, Dehydronoraminophenazon) im Pferdeurin mittels GS/MS nach, geben jedoch keine Nachweis- und Quantifizierungsgrenzen an.

4-MAA stellt den Hauptmetaboliten des Metamizols dar. Weitere bekannte bedeutende Metaboliten wie z.B. Formylaminoantipyrin (FAA), Aminoantipyrin (AA) und 4-Acetylaminoantipyrin (AAA) und deren Nachweis aus Plasma, Urin und anderen Körperflüssigkeiten sind in der Literatur besonders im Humanbereich mehrfach beschrieben (DAMM 1989, VLAHOV 1990, LEVY et al. 1995, ZYLBER-KATZ et al., 1992, NEDDERMANN und ROHDEWALD 1988, POPOT et al. 2000), bleiben aber in Untersuchungen dieser Studie unberücksichtigt. Die Metaboliten FAA, AA und AAA besitzen teilweise noch pharmakologische Wirksamkeit. Allgemein wird aber 4-MAA als Leitsubstanz in der Doping-Analytik verwendet, so dass in die Berechnungen des PK/PD-Modell von TOUTAIN und LASSOURD (2002) weitere Metaboliten nicht einbezogen werden und zudem für dieses Modell nur pharmakokinetische Daten der hauptsächlich wirksamen Substanz, dem 4-MAA, benötigt werden (siehe 5.4). Da die Proben des Ausscheidungsversuchs nach der Gewinnung z.T. bis zu 8 Wochen bei –20 °C eingefroren waren, bevor sie aufgearbeitet und gemessen wurden, erfolgte eine Überprüfung der Lagerstabilität von 4-MAA im Plasma und Urin unter gleichen Bedingungen. 4-MAA ist in beiden Matrices bei –20 °C über acht Wochen stabil. Trotz der geringen Wiederfindungsrate

weisen Richtigkeit und Präzision aus, dass die Methode geeignet ist, dopingpositive Fälle zu erkennen. Die in dieser Studie für die Analytik von 4-MAA in Plasma und Urin von Pferden entwickelte Methode beinhaltet ein einfaches und schnelles Aufarbeitungs- und Extraktionsverfahren. Da aufwendige Prozeduren für eine Übersichtsanalyse, wie in der Routine der Dopinguntersuchung, unvorteilhaft sind, stellt die hier entwickelte Methode einen Ansatz zur Entwicklung eines Routineverfahrens dar. Es bleibt jedoch zu berücksichtigen, dass in dieser Studie ein sehr großer Konzentrationsbereich (im Urin: von Null bis 8000 µg/ml) erfasst und validiert werden musste, wodurch vergleichend zu GC/MS- und HPLC-UV-Verfahren einerseits nicht die Empfindlichkeit mit dieser Methode erreicht wurde, andererseits aber die Messgeräte auch bei sehr hohen Konzentrationen noch auswertbare Chromatogramme lieferten. In dieser Studie konnten die höchsten Extraktionsausbeuten (siehe 3.2.5.7, Abbildungen 5 und 6) mittels basischer Extraktion bei pH 14 und Verwendung von tertiärem Butylmethylether in einer Flüssig-Flüssig-Extraktion erzielt werden.

Demgegenüber erscheinen andere in der Literatur beschriebene Aufarbeitungen eher aufwendig. SCHLINGLOFF (1997) extrahierte ebenfalls im Basischen, führte die Plasmaproben jedoch über eine Festphasen-Extraktionssäule und musste zur Messung an einem Gaschromatographen derivatisieren. POPOT et al. (2000) extrahierten Pferdeurinproben bei pH 9,5 und nutzten ebenfalls eine Festphasen-Extraktion. DAMM (1989) führte zur Analyse von 4-MAA in Humanplasma und –urin eine Flüssig-Flüssig-Extraktion im basischen pH-Bereich vor Messung mittels HPLC-UV-Verfahren durch.

Vergleichend stellt Aufarbeitungsprozedur der erarbeiteten Methode ein einfaches, schnelles und praktikables Verfahren dar.

Besondere Schwierigkeiten lagen in dieser Studie während der Validierung der Methode in der starken Oxidationsneigung des 4-MAA unter Lichteinfluss und bei Verbringung in wässriges Milieu begründet. Dieses wurde nach Messungen von Kalibrierreihen deutlich, die mit 4-MAA-Stamm- und Arbeitslösungen erstellt wurden, in denen das 4-MAA in Methanol oder in 0,06 N Salzsäure gelöst war. Waren die methanolischen oder salzsäurehaltigen wässrigen Stamm- und Arbeitslösungen älter als 24 Stunden, verfärbten sie sich zunehmend gelblich. Zudem zeigte sich in Abhängigkeit von der Lagerzeit eine erhebliche Streuung der Ergebnisse der Messreihen mehrerer Tage. Akzeptable Kalibrierreihen wurden erst erhalten, nachdem die 4-MAA-Stamm- und Arbeitslösungen mit 1%-iger Mercaptoethanollösung (in 0,06 N Salzsäure) erstellt wurden. 4-MAA erschien darin für ca. 4 Wochen stabil. Unter Berücksichtigung der erheblichen Oxidationsneigung von 4-MAA war es von Interesse, wie lange 4-MAA nach der Aufarbeitung, gelöst in dem Ammoniumacetat-HPLC-Anfangspuffer

und in HPLC-Autosamplervials verbracht, reproduzierbare Messergebnisse liefert. Dazu wurden Proben der Kalibrierreihen der Validierung nach 24, 48 und 72 Stunden Lagerung bei Zimmertemperatur wiederholt gemessen und die gemessenen Konzentrationen mit denen von Messreihen verglichen, die sofort nach der Aufarbeitung gemessen wurden. Dabei wurde festgestellt, dass bis zu 24 Stunden reproduzierbare Messergebnisse gewährleistet sind.

Wurde die Proben wie oben beschrieben zwischenzeitlich nicht bei Zimmertemperatur, sondern bei +4° C aufbewahrt, ist bis zu 48 Stunden die Reproduzierbarkeit der Messergebnisse gewährleistet.

Abschließend ist zu erwähnen, dass die Wiederfindungsraten, die mit dieser Methode erzielt wurden, durch Veränderung der Aufarbeitungsprozedur verbesserbar erscheinen. Die Methode zeichnet sich durch das einfache Aufarbeitungsverfahren, valider Präzision und Reproduzierbarkeit aus. Zudem kann die entwickelte Methode über einen großen Konzentrationsbereich gleichermaßen für Plasma und Urin angewendet werden.