Für den Versuchsabschnitt wurden die Ejakulate von zwei klinisch gesunden, institutseigenen Ebern verwendet. Für die Versuche wurde ausschließlich die spermienreiche Fraktion des Ejakulates eingesetzt.
Am örtlichen Schlachthof wurden am Tag des Versuches zwei Eileiter von verschiedenen Altsauen gewonnen, die in 4 °C gekühlter PBS-Lösung transportiert wurden. Die Eileiter von postpuberalen Sauen wurden ausgewählt, da sie ausgeprägtere Epithelfalten aufweisen und sich dadurch zur Explantgewinnung besser eignen als solche von Jungsauen. Der Zyklusstand der Tiere konnte für diesen Versuchsansatz vernachlässigt werden (GEHLHAAR et al. 2000).
3.5.1 Gewinnung der Explante
Die Eileiter wurden im Labor in eine mit frischer, gekühlter PBS-Pufferlösung vorbereitete Petrischale (Greiner GmbH, Frickenhausen) überführt. Mit Hilfe einer anatomischen Pinzette (TBH GmbH, Langenhagen) und einer Schere mit zwei spitzen Schenkeln (Aesculap, TBH GmbH, Langenhagen) wurde das Eileitergekröse (Mesosalpinx) vom Eileiter (Abb. 4/1) entfernt. Zur weiteren Präparation wurden eine Mikropinzette (Dumont forceps 45°, Fine Science Tools GmbH, Heidelberg) und eine Mikroschere mit zwei spitzen Schenkeln und einer Schnittfläche von drei Millimetern (Mini-Vannas, Fine Science Tools GmbH, Heidelberg) verwendet. Nachdem das Gekröse nahezu vollständig abpräpariert war, konnte der Eileiter mit der Schere longitudinal eröffnet werden. In einer mit Parafin gefüllten Petrischale wurde der Eileiter unter leichtem Zug mit zwei grauen Kanülen (0,7 x 30mm, Luer Lock, Heiland, Hamburg) fixiert und das Epithel mit PBS-Lösung feuchtgehalten. Aus den Epithellängsfalten (Abb. 4/2) des kaudalen Isthmus des Oviduktes wurden nun die Explante (0,5-1mm, Abb. 4/3) unter einem Stereomikroskop (Zeiss 475003, Jena) mit Hilfe der Mikroinstrumente gewonnen. Für den Versuch wurden nur die Explante
Material und Methoden
verwendet, die sich bei der anschließenden Prüfung mit Hilfe des Inversmikroskopes (IM 35, Zeiss, Jena) durch ihre Größe, einen vorhandenen Epithelsaum sowie gute Zilienbewegung als tauglich erwiesen. Die ausgewählten Explante wurden in kleinen mit TALP-Medium gefüllten Petrischalen (35 x 10 mm, Greiner GmbH, Frickenhausen) bis zum Versuchsbeginn im Kühlschrank gelagert.
Abb. 4: Schematische Darstellung der Explantgewinnung:
1 = Querschnitt durch den Eileiter 2 = Längsschnitt durch den Eileiter
3 = Explant (im Verhältnis etwas vergrößert)
1 2 3
3.5.2 Koinkubation der Explante mit den Spermatozoen
In einer kleinen Petrischale wurden zwei Explante in 60 µl TALP-Medium im Brutschrank (Nuaire US Autoflow, Zapf, Langenhagen) für fünf Minuten bei 39 °C und fünf Prozent CO2 Begasung äquilibriert. Gleichzeitig wurden auch die in einem Eppendorfgefäß vorverdünnten Spermatozoen und eine Gewebekulturschale mit vier Nocken (35 x10 mm, Greiner GmbH, Frickenhausen) in den Brutschrank verbracht.
Zu diesen Explanten wurde nach Ablauf der fünf Minuten die 10 µl Spermiensuspension (105 Spermien/ml TALP-Medium) hinzugegeben und unter denselben Bedingungen für weitere fünfzehn Minuten koinkubiert. Die Explante wurden nun in einer Gewebekulturschale mit Nocken je 2 x in 60 µl TALP-Medium gewaschen. Ein mit Silikonrahmen (Silicone Stopcock Grease, Dow-Corning, Serva Feinbiochemica, Heidelberg) versehener Objektträger (IDL, Interessengemeinschaft der Laborffachhändler, GmbH + Co KG) wurde mit frischem, vorgewärmten TALP-Medium (60 µl) beschickt und die Explante mit Hilfe der Mikropinzette auf den gewärmten Objektträger aufgegeben und mit einem Deckglas abgedeckt.
3.5.3 Videomikrographie der gebundenen Spermien am Explant
Mit Hilfe des Inversmikroskopes, welches mit einer Videokamera (Kappa, CF 8/1), einem Monitor (WV-BM 1400, Panasonic) und einem Videorecorder (SLV-E 720,VHS, Sony) gekoppelt war, wurde der Versuch dokumentiert. Der Objektträger wurde auf dem Deckglas liegend auf den Mikroskoptisch verbracht und die Explante in ihrer Gesamtheit bei einer 50,4 fachen (6,3 x 8) Vergrößerung gefilmt. Zusätzlich wurden von jedem Explant drei Fragmente (Teilstücke) in der 256 fachen (32 x 8) Vergrößerung aufgenommen. Durch das Drehen der Mikrometerschraube des Inversmikroskopes konnten die gebundenen Spermatozoen in allen Ebenen erfaßt und gezählt werden. Nachdem alle Versuche durchgeführt und aufgezeichnet waren, erfolgte die Auswertung in der 256 fachen Vergrößerung mit Hilfe einer am Monitor befestigten Folie, auf der jedes Spermium mit einem Folienstift markiert wurde.
Material und Methoden
Um die Größe der gefilmten Explante und Fragmente bestimmen zu können, wurde an jedem Versuchstag eine Skalierung (OT, 0,01mm2, Olympus) in den beschriebenen Vergrößerungen auf der Videokassette festgehalten. Die Flächenausmessung wurde mit Hilfe des computergestützten Flächenmeßprogrammes „ AIDA “ (mika medical GmbH, Bildanalyse Ver. 2.0, Copyright 1992, Rosenheim) durchgeführt. Zu diesem Zweck wurde der Computer (Dell 450/M, Germany) mit einem Monitor (Trinitron, Germany) und dem Videorekorder gekoppelt. Die während des Versuches aufgenommene Skalierung wurde vor Beginn der Berechnungen gespeichert. Durch Umfahren des Explantes bzw. des Fragmentes (im Standbild) mit der Maus des Computers konnte die Fläche der Explante und Fragmente errechnet werden.
3.5.4 Berechnung des Bindungsindexes
Durch die gezählten Spermien und die mit dem Flächenmessprogramm gemessene Größe des Explantes konnte der Bindungsindex mit einem SAS-Computerprogramm ermittelt werden. Definiert ist der Bindungsindex als die mittlere Anzahl der gezählten und am Explant gebundenen Spermien pro 0,01 mm2 Explantfläche (PETRUNKINA et al. 2001)
BIE = (SG1 + SG2 + SG3 ) / (FF1 + FF2 + FF3)
BIE = Bindungsindex der an das Explant gebundenen Spermien
SG1,2,3 = Anzahl der gebundenen Spermien an das Fragment des jeweiligen Explantes FF1,2,3 = Gemessene Fläche des Fragmentes eines Explantes
BI= (BIE1+ BIE2) / 2
BIE1 + BIE2 sind die Bindungsindices des ersten und zweiten Explantes, die gleichzeitig im Versuch verwendet wurden.
3.5.5 Kompetitive Hemmungsversuche
Bei diesen Versuchen sollte eine mögliche Beteiligung verschiedener Spermadhäsine bei der Interaktion der Spermatozoen mit den Oviduktepithelzellen untersucht werden.
Dazu wurden zu den vorinkubierten Explanten und Spermien Spermadhäsine gegeben, so dass Spermien und Spermadhäsine miteinander um die Strukturen der Oviduktepithelzellen konkurrieren konnten. Die Versuchsbedingungen entsprechen denen in 3.5-3.5.4 beschriebenen. Eine signifikant herabgesetzte Anzahl (p < 0,05) der gebundenen Spermien war ein Hinweis auf die Beteiligung des kompetitiv eingesetzten Spermadhäsins bei der Spermatozoen-Oviduktepithelzellbindung. Als Spermadhäsine wurden vergleichsweise AQN-1 und AWN-2 in verschiedenen Konzentrationen (1,25 µM – 20 µM) eingesetzt.
In einem weiteren Versuch wurden verschiedene Kohlenhydrate eingesetzt und ihre Rolle als Inhibitionssubstanzen untersucht. Bei einer Konzentration von 3 µM wurden 2-Fukosyl-Laktose, 3-Fukosyl-Laktose, Mannopentaose, N-Acetyl-Neuraminyl-Laktose und β-Laktose (Sigma, Aldrich) zu den vorinkubierten Explanten gegeben und in ihrer Fähigkeit, die Spermatozoenbindung an das Eileiterepithel zu beeinflussen, verglichen.
Ergebnisse
4 Ergebnisse
Durch die Spermadhäsine wird eine Gruppe von Proteinen repräsentiert, die oberflächenassoziiert den Spermatozoen aufliegen. Hinsichtlich ihrer physiologischen Funktion wird den Spermadhäsinen sowohl eine Rolle bei der initialen Bindung der Spermatozoen an die Zona pellucida der Eizelle als auch bei der Etablierung des Spermienreservoirs zugedacht. Verschiedene Spermadhäsine aus dem porcinen Seminalplasma sind proteinbiochemisch charakterisiert, allerdings stehen Untersuchungen im Spermienreservoir des weiblichen Genitaltraktes zur Identifizierung des Rezeptorsystems beim Schwein noch aus. Zu diesem Zweck wurden im Rahmen dieser Arbeit Untersuchungen auf proteinbiochemischer Ebene, durchflusszytometrische und fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen, sowie kompetitive Hemmversuche im Explant-Assay durchgeführt.