Ohne eine genaue Kenntnis der Bindungspartner, die für die Etablierung des Spermienreservoirs eine Rolle spielen, kann der Mechanismus der Steuerung der Modulation der Spermienfunktion nicht bestimmt werden. Um die Spermien-Ovidukt-Interaktion des Schweines näher zu charakterisieren, wurde diese Arbeit angefertigt.
Aus den vorliegenden Daten ist es möglich, ein Bindungsmodell (Abb. 17) beim Schwein zu entwickeln.
Im Verlauf der Spermienreifung assoziiert AWN mit der Membran der Spermatozoen.
Zusätzlich bilden weitere Spermadhäsine wie AQN-1 eine Schutzschicht, indem sie den direkt mit der Membran verbundenen Spermadhäsinen (AWN) aufgelagert werden. Die akrosomintakten, nicht kapazitierten Spermien binden über AQN-1 an das Epithel des Eileiters. Um den Ovulationszeitpunkt herum wird durch noch unbekannte Signale die Kapazitation induziert und AQN-1 Bindungsstellen gehen verloren.
Dadurch wird AWN „demaskiert“ und steht für die Interaktion mit der Zona pellucida zur Verfügung.
Abb. 17: Modell der Assoziation von AQN-1 auf der Spermienoberfläche (siehe 5.5,Abschlussbetrachtung); nach der Loslösung werden Bindungsstellen für Galaktose exprimiert (AWN).
Diskussion
Da die Rolle von AQN-1 bei der Spermien-Ovidukt-Interaktion nur zu einem kleinen Teil beleuchtet werden konnte, ist es notwendig, die Funktion der Spermadhäsine weiter zu untersuchen, um das Rezeptorsystem vollständig zu identifizieren. Einige Forschergruppen (BALL et al. 1997, IGNOTZ et al. 2001, GREEN et al. 2001) konnten bei verschiedenen Spezies unterschiedliche Kohlenhydrate beschreiben, die an der Interaktion von Spermatozoen und Epithelzellen des weiblichen Genitaltraktes beteiligt sind. Durch die Ergebnisse von HESS (1998) und SIMON (2002) sind tierartübergreifende Bindungen von Spermatozoen an Oviduktzellkulturen des Schweins erzielt worden. Die Ergebnisse sprechen dafür, dass sich der Bindungsmechanismus zwischen den einzelnen Spezies in den Grundlagen ähnelt.
Um die Beteiligung von AQN-1 im Kapazitationsprozess näher zu charakterisieren, sollten in weiteren Untersuchungen Spermienextrakte vor und nach der Kapazitation in vitro mittels HPLC und anschließender Massenspektrometrie analysiert werden. Sollte sich die oben beschriebene Hypothese durch diese Untersuchungen bestätigen, könnte die Funktion von AQN-1 im Explant-Assay unter Kapazitationsbedingungen mit Hilfe monoklonaler Antikörper (Anti-AQN-1) detailliert charakterisiert werden. Die vom Ovidukt exprimierten Spermienrezeptoren können mit Hilfe moderner Proteom-analytik weiter charakterisiert werden, damit beide Seiten des Rezeptorsystems identifiziert werden können.
6 Zusammenfassung
Katrin Gohr: Interaktion von Spermatozoen und Oviduktepithelzellen in vitro zur Identifizierung des Rezeptorsystems am porcinen Modell.
Bei den höheren Säugetieren müssen die Spermatozoen für eine erfolgreiche Befruchtung umfassende Zell-Zell-Interaktionen im weiblichen Genitaltrakt eingehen.
Die beteiligten molekularen Zielstrukturen, die in diesem komplexen Geschehen als Ligand bzw. Rezeptor fungieren, sind bisher noch nicht identifiziert und charakterisiert.
Aus physiologischer Sicht ist bekannt, dass die Spermatozoen an das Oviduktepithel des kaudalen Isthmus des Eileiters binden und dort das Spermienreservoir bilden, um bis zum Zeitpunkt der Ovulation ihre Vitalität aufrechtzuerhalten. Gleichzeitig kommt es durch die Bindung zu einer Selektion intakter, befruchtungsfähiger Spermien und zu einer Begrenzung der Spermienzahl am Befruchtungsort durch gezielte Loslösung sowie zu einer Regulation der Hyperaktivierung und Kapazitation.
Unterschiedliche molekulare Strukturen sind an diesen zellulären Wechselwirkungen beteiligt. So exprimiert das Epithel des weiblichen Genitaltraktes auf der Zelloberfläche Oligosaccharidstrukturen, während auf der Spermienmembran kohlenhydratbindende Proteine assoziiert vorliegen.
Am Aufbau der Oligosaccharidstrukturen ist Mannose beteiligt, hinsichtlich des Rezeptorsystems der Spermatozoen gibt es bisher wenige Hinweise. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte im porcinen Tiermodell daher die physiologische und funktionelle Bedeutung von Ligand und Rezeptor näher untersucht werden.
Zu diesem Zweck wurden zunächst Seminalplasmaproteine aus porcinen Ejakulaten isoliert. Nach der SDS-Poylacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) und anschließendem Western-Ligand-Blot erfolgte die Identifizierung kohlenhydratbindender Proteine. Um zu klären, ob die identifizierten Proteine nach der Dichtegradrientenzentrifugation mit Percoll weiterhin auf der Spermienmembran
Zusammenfassung
assoziiert vorliegen, wurden Spermienextrakte angefertigt. Anschließend erfolgte die Untersuchung der Spermienextrakte über SDS-PAGE und Western-Ligand-Blot auf ihre Kohlenhydratbindungsfähigkeit. Zur Identifizierung der kohlenhydratbindenden Proteine wurden die Spermienextrakte über reverse phase HPLC entwickelt und die resultierenden Fraktionen der massenspektrosmetrischen Analyse zugeführt. Mit dem Verfahren der Durchflusszytometrie wurden die kohlenhydratbindenden Eigenschaften von Spermien-assoziierten Proteinen unter Kapazitationsbedingungen untersucht. Sie wurden durch fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen ergänzt. Mit dem Ziel die in vivo Bedingungen zu imitieren, wurden kompetitive Hemmversuche mit den Spermadhäsinen AQN-1 und AWN-2 in Explant-Assays durchgeführt.
Folgende Ergebnisse wurden erzielt.
1. Die Seminalplasmaproteine des Ebers konnten isoliert und mittels massenspektrometrischer Analyse als Spermadhäsine identifiziert werden.
2. Die Untersuchung des Spermienextraktes resultierte im Nachweis einer Proteinbande mit 12 kDa. Über Massenspektrometrie wurde das Spermadhäsin AQN-1 identifiziert.
3. Durchflusszytometrische Messungen unter Kapazitationsbedingungen zeigten in einem Zeitraum von 30 Minuten einen massiven Verlust der Mannosebindungsstellen auf den Spermatozoen sowie eine Zunahme der α- und β-galaktosebindenden Strukturen.
4. In den fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen konnten mannosebindende Strukturen im apikalen Bereich der Spermienköpfe ejakulierter, percollgewaschener Spermien lokalisiert werden. Während des Kapazitationsprozesses verschwanden die Mannosebindungsstellen völlig.
5. Im Explant-Assay konnte festgestellt werden, dass eine signifikante Hemmung der Spermienbindung durch AQN-1 an das Oviduktepithel erreicht wird. Die inhibitorische Aktivität von AQN-1 konnte mit einer IC 50 von 4,6 µM berechnet werden. Bei der Verwendung verschiedener Modellzucker wurde die Spermienbindung an das Oviduktepithel ausschließlich durch Mannopentaose (Mannosylrest) inhibiert.
Die vorliegenden Daten verdeutlichen die besonderen Kohlenhydratbindungseigenschaften von AQN-1 im weiblichen Genitaltrakt und stützen die Vorstellung, dass AQN-1 als putativer Rezeptor die Bindung der Spermien an das Oviduktepithel im Bereich des porcinen Spermienreservoirs vermittelt.
Summary
7 Summary
Katrin Gohr: Identification of the receptor system involved in the interaction between spermatozoa and epithelial cells of the porcine oviduct in vitro.
In higher mammals cell-cell-interactions within the female genital tract are of crucial importance for a successful fertilisation. So far the molecular nature of the orchestrating ligand and receptor molecules involved in this tightly regulated scheme are neither identified nor characterised.
In the pig it is well documented that spermatozoa are bound to the epithelial layer of the caudal isthmus of the oviduct, thus generating a reservoir of sperm cells and in addition maintaining their vitality until the point of ovulation. Simultaneously, intact and fertile spermatozoa are selected, a local restriction of the number of spermatozoa is achieved by the mechanism of controlled release of adhered spermatozoa, and, finally, the processes of hyperactivation as well as capacitation is initiated.
The surface molecules involved in the cellular interaction and recognition processes differ with respect to their molecular structures. Whereas mannose residues containing oligosaccharides are expressed on the surface of the epithelial cells of the female genital tract, carbohydrate binding proteins are associated with the outer membrane of spermatozoa. However, data detailing the nature of the receptor molecules attached to the spermatozoa are rare. It was the aim of the present investigation to characterise ligand and receptor molecules biochemically and to analyse their physiological and functional role in the porcine model in greater detail.
Initially, seminal plasma proteins were isolated from porcine ejaculates. Following size fractionation by electrophoresis in SDS-polyacrylamidgels (SDS-PAGE) carbohydrate binding proteins were identified by Western blotting. Protein extracts were obtained from spermatozoa centrifuged in a Percoll density gradient in order to clarify whether these proteins are associated to the sperm membrane. Subsequently, by SDS-PAGE and Western-blotting these extracts were tested for their capacity to bind
carbohydrates. For further analysis, sperm protein extracts were run by reverse phase HPLC and the resulting peak fractions exhibiting carbohydrate binding activity were analysed by mass spectrometry. Flow cytometric techniques were used to measure alterations of the carbohydrate binding activity of spermatozoa associated proteins during the process of capacitation. These analyses were supplemented by fluorescence microscopy. Using explant assays imitating in vivo conditions competitive inhibition experiments were performed with the spermadhesins AQN-1 and AWN-2.
The following results were obtained:
1. Boar sperm seminal plasma proteins were isolated from ejaculates.
Subsequently, mass spectrometry resulted in the identification of spermadhesins.
2. Analysis of protein extracts isolated from spermatozoa by SDS-PAGE revealed a protein of 12 kDa. After further analysis by mass spectrometry this protein was identified as spermadhesin AQN-1.
3. Using the technique of flow cytometry a rapid decline of mannose binding sites paralleled by an increase of binding sites for α- and β-galactose was observed within a time period of 30 minutes after initiating the capacitation process of spermatozoa.
4. The data obtained by flow cytometric analysis are consistent with results generated by fluorescence microscopy. Whereas mannose binding sites were localised within the apical part of sperm heads of ejaculated and Percoll purified spermatozoa, these mannose binding sites, however, disappeared completely during the capacitation process.
5. In explant assays it was demonstrated that spermadhesin AQN-1 is able to significantly. inhibit the binding of spermatozoa to the epithelial layer of the oviduct Its inhibitory activity was estimated to be IC50 ~ 4,6 µM. Additionally, among the various sugar compound tested herein only mannopentaose inhibited the binding of spermatozoa to the epithelial layer of the oviduct.
These data show in detail the binding properties of spermadhesin AQN-1 for different carbohydrates within the porcine female genital tract. Further, they strongly suggest
Summary
that AQN-1 functions as a putative receptor mediating binding of spermatozoa to the epithelial layer of the oviduct at the site of the sperm reservoir.
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In synchronized pigs, the duration of ovulation is not affected by insemination and is
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