Mit der Durchflusszytometrie können physikalische Eigenschaften von Zellen, wie Größe, Form und Struktur bestimmt werden. Zusätzlich können Zellfunktionen erfaßt werden, die mit Hilfe von marker-gekoppelten Fluoreszenzfarbstoffen dargestellt werden können.
Das verwendete Durchflusszytometer (Galaxy, S 2314, DAKO, Hamburg ) ist mit einem Argonionenlaser und einer UV-Quecksilberlampe ausgestattet, wobei der Laser bei einer Wellenlänge von 488 nm detektiert. Zum Gerät gehört eine Computereinheit mit Software (Mikrosoft Windows 98, FloMax), die eine gezielte Auswertung der Messungen mit Hilfe der Sechsparameterdarstellung (zwei optische und vier Fluoreszenzparameter) ermöglicht.
Zur Messung muß eine Einzelzellsuspension vorliegen. Die Probenflüssigkeit wird durch Überdruck aus dem Probenröhrchen (No./ REF 55484; 3,5 ml; 55 x 12 mm;
Sarstedt, Nürnbrecht) über eine Stahlkapillare in die Quarz-Flowküvette eingeführt.
Um Zellaggregate aufzutrennen, werden die Zellen in der sie umgebenden Trägerflüssigkeit stark beschleunigt und dadurch hintereinander aufgereiht gemessen.
Jede einzelne Zelle passiert so den fokussierten Laserstrahl. Je nach Zellmorphologie (Größe und Granularität) entstehen Lichtbeugungen, die als Streulichtsignale von Lichtdetektoren in bis zu 65.536 Kanälen pro Parameter registriert werden. Das Vorwärtsstreulicht (FSC = forward scatter) verhält sich proportional zur Größe der gemessenen Zellen, während das Seitwärtsstreulicht (SSC = side scatter) Rückschlüsse über die intrazelläre Beschaffenheit (Granularität) sowie über die Oberflächenstruktur (Komplexität) der Zellen zulässt.
Bei der Verwendung von fluorochrommarkierten Partikeln werden diese durch die Intensität des einfallenden Lichtes angeregt (Anregungslicht) und emittieren Photonen einer für jeden Fluorochromfarbstoff typischen Wellenlänge. Die Fluoreszenzsignale werden von für verschiedene Wellenlängen empfindliche Lichtdetektoren ermittelt.
Für die Grünfluoreszenz (FL-1) ist das verwendete Durchflusszytometer genauso mit einem Messbereich ausgestattet wie für Messbereiche im Orange- und
Material und Methoden
Rotfluoreszenzbereich (FL-2, FL-3). Die Intensität der Fluoreszenz wird logarithmisch verstärkt und auf einer logarithmischen Skala dargestellt.
Durch das Computerprogramm (Mikrosoft Windows 98, FlowMax) wird eine gezielte Auswertung der Messungen durch eine Zweiparameterdarstellung ermöglicht. In einem Punktdiagramm (Dot Blot) wird jeweils ein Punkt eingezeichnet, wenn an einer Intensitätsachse (linear oder logarithmisch), an der beide Parameter gegeneinander aufgetragen werden, sich die ermittelten Werte der Parameter schneiden. Eine weitere Möglichkeit der Darstellung ist das Einparameter-Histogramm bei dem vertikal die Anzahl der Zellen je Kanal aufgetragen werden und horizontal die jeweilige Messgröße aufgetragen wird.
Eine separate Auswertung verschiedener Zellsubpopulationen aus einem Probenansatz ist möglich. In einem Dot Blot können bestimmte Meßfenster definiert (gating) und einzelnd analysiert werden. In den Versuchen sind als Markerfarbstoffe Propidiumjodid (610 nm Bandpass Filter) und Fluoreszenzisothiozyanat (FITC, 520 nm Bandpass Filter) eingesetzt worden.
3.3.1 Etablierung des Messverfahrens
Um die Kohlenhydratbindungsstellen quantifiziert darzustellen, erfolgte zur Etablierung des Messsystems zunächst eine Untersuchung mit α-D-Mannose-PAA-FITC. Zur Wahl der Messeinstellung des Durchflusszytometers wurde zunächst je eine Messung mit Spermatozoen in HBS-Puffer, denen entweder nur Propidiumjodid-Lösung oder nur immobilisierte Zucker (FITC-Konjugat) zugesetzt wurden, durchgeführt. Bei den unter Kapazitationsbedingungen durchgeführten Untersuchungen erfolgte eine zusätzliche Messung der Spermien mit den zu untersuchenden Zuckern in Tyrode-Kapazitationsmedium (HARRISON 1993), um das Gerät für alle nachfolgenden Untersuchungen desselben Tages einzustellen. Während der gesamten Untersuchungsreihe wurden bei einer Messung jeweils 10.000 Zellen (400-600 Spermienzellen pro Sekunde) im Trägermedium ausgewertet.
Bei jeder Messung betrug das Probenvolumen 1 ml, in das 5 µl Propidiumjodid-Stammlösung als Lebend-Tot-Kontrolle sowie BSA (5 µg/ml) zugesetzt wurden, um unspezifische Bindungen zu verhindern.
3.3.2 Bestimmung der optimalen Inkubationszeit bei der durchflusszytometrischen Untersuchung der Mannose-Bindungsstrukturen
Um die optimale Inkubationszeit für den Nachweis mannosebindender Strukturen auf der Spermienoberfläche festzustellen, wurden kinetische Vorversuche zu verschiedenen Zeitpunkten durchgeführt. In einer Konzentration von 3 µg/ml HBS-Puffer wurden mit α-D-Mannose-PAA-FITC markierte Spermiensuspensionen jeweils nach 1, 3, 5, 7 10 und 15 Minuten durchflusszytometrisch untersucht. Für den weiteren Versuchsablauf wurde nach dieser Untersuchung eine Inkubationszeit von 3 Minuten festgelegt.
3.3.3 Bestimmung der optimalen Zuckerkonzentration bei der durchflusszytometrischen Untersuchung der Mannose-Bindungsstrukturen
In diesem Vorversuch wurde die optimale Zuckerkonzentration bei einem Probenvolumen von 1 ml ermittelt. Jeweils nach einer Zeitspanne von 3 Minuten wurden verschiedene Konzentrationen von 0,5 µg, 1 µg, 2 µg, 5 µg und 8 µg jeweils pro Milliliter Probenvolumen durchflusszytometrisch gemessen. Nach der Untersuchung ergab sich ein Optimum der Fluoreszenz für 2-5 µg des Reagenzes/ml Probenvolumen. Für die weiteren Versuche wurde eine Zuckerkonzentration von 3 µg/ml Trägermedium festgelegt.
Material und Methoden
3.3.4 Durchflusszytometrische Untersuchung der Veränderungen in der Mannose/Galaktose Bindung unter Kapazitationsbedingungen
Nach dem heutigen Wissensstand ergibt sich die Hypothese, dass sich die Bindungsstellen der Spermatozoen während des Kapazitationsvorganges verändern.
Daher wurden die Spermien in diesem Versuchsabschnitt in ein spezielles Kapazitationsmedium (Tyrode-Medium) überführt und gemessen.
Die Messungen erfolgten 3, 15 und 30 Minuten nach Überführen der Spermatozoen in das Tyrode-Medium. Während der Inkubationszeiten wurden die Probenröhrchen in einem CO2-Brutschrank (Nuaire US Autoflow, Zapf, Langenhagen) bei 39 °C aufbewahrt. Die durchflusszytometrische Bestimmung der mittleren Fluoreszenz der Spermienpopulationen erfolgte unverzüglich nach der Entnahme der inkubierten Spwermiensuspensionen aus dem Brutschrank. Die Inkubation der Spermien wurde mit α-D-Mannose-PAA-FITC, α-Galaktose-PAA-FITC sowie mit β -Galaktose-PAA-FITC durchgeführt. Jeder Zucker wurde zu einer Endkonzentration von 3 µg/ml Tyrode-Medium hinzupipettiert und die mittlere Intensität der Fluoreszenz mit Hilfe der Flow Max Software ermittelt. Als Negativkontrolle wurde bei α -D-Mannose-PAA-FITC eine 0,5 M α-Methylmannopyranosid Lösung eingesetzt. Bei den Galaktosen wurde jeweils eine Kontrolle mit 0,5 M Laktose-Lösung durchgeführt.
Um die proportionale Umverteilung innerhalb der Population lebender Zellen zu beobachten, wurde eine Einteilung in vier Quadranten vorgenommen (Abb. 3).
Quadrant 1 (Q1) beeinhaltet die toten Zellen mit niedriger Fluoreszenz der gebundenen Zucker, während Quadrant 2 (Q2) die toten Spermienzellen repräsentiert, die eine hohe Fluoreszenz aufweisen. Im Quadrant 3 (Q3) werden die lebenden Spermienzellen mit niedriger Fluoreszenz dargestellt. Die hohe Fluoreszenz lebender Zellen zeigt Quadrant 4 (Q4). Die Darstellung der Umverteilung konnte mit dem Einfügen sogenannter „Gatings“ (Messfenster) erreicht werden, wobei die Trennung der Population mit hoher Zuckerbindungskapazität von der Spermienpopulation mit niedriger Fluoreszenz der Zucker erfolgte. Vor der Messung wurde die Trennung
durch Gatings vorgenommen, festgelegt und während der gesamten durchflusszytometrischen Analyse konstant gehalten.
Abb. 3: Darstellung eines Punktdiagrammes (Dot Blot) der durchflusszytometrischen Analyse
Q1: Tote Zellen mit niedriger Fluoreszenz; Q2: Tote Zellen mit hoher Fluoreszenz Q3: Lebende Zellen mit niedriger Fluoreszenz; Q4: Lebende Zellen mit hoher Fluoreszenz
Material und Methoden