• Keine Ergebnisse gefunden

Interaktion von Spermatozoen und Oviduktepithelzellen in vitro zur Identifizierung des Rezeptorsystems am porcinen Modell

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2022

Aktie "Interaktion von Spermatozoen und Oviduktepithelzellen in vitro zur Identifizierung des Rezeptorsystems am porcinen Modell"

Copied!
115
0
0

Wird geladen.... (Jetzt Volltext ansehen)

Volltext

(1)

Aus dem Institut für Reproduktionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Interaktion von Spermatozoen und Oviduktepithelzellen in vitro zur Identifizierung des Rezeptorsystems am porcinen Modell

Inaugural-Dissertation

Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin

(Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Katrin Gohr

aus Bremen

Hannover 2003

(2)

Wissenschaftliche Betreuung:

Univ.-Prof. Dr. rer. nat. Dr. med. habil. Edda Töpfer-Petersen

1. Gutachterin: Univ.-Prof. Dr. rer. nat. Dr. med. habil. Edda Töpfer-Petersen 2. Gutachter: Prof. Dr. Christiane Kirchhoff

Tag der mündlichen Prüfung: 04.06.2003

Gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (TO 114/5-3)

(3)
(4)

Abkürzungen

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis... 4

1 Einleitung... 11

2 Literaturübersicht ... 13

2.1 Besamung ... 13

2.2 Spermatozoon... 14

2.2.1 Morphologie der Samenzelle ... 14

2.2.2 Spermienkopf ... 15

2.2.3 Spermienschwanz... 15

2.3 Spermatozoenreifung ... 16

2.4 Kapazitation ... 18

2.5 Akrosomreaktion ... 20

2.6 Seminalplasma... 21

2.7 Spermientransport im weiblichen Genitaltrakt ... 22

2.8 Funktionelles Spermienreservoir... 24

2.9 Spermadhäsine... 26

3 Material und Methoden ... 29

3.1 Spermienaufbereitung... 29

3.1.1 Gewinnung der Ejakulate ... 29

3.1.2 Konventionelle spermatologische Untersuchung ... 29

3.1.3 Dichtegradientenzentrifugation mit Percoll ... 30

3.1.4 Darstellung der Membranintegrität durch Propidiumjodidfärbung... 31

3.2 Biochemische Charakterisierung von Proteinen ... 32

3.2.1 Auftrennen des Seminalplasmas mittels analytischer HPLC ... 32

3.2.2 Herstellung von Spermienextrakten... 32

3.2.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ... 33

(5)

3.2.4 Western Blot Analyse... 34

3.2.5 Spezifischer Proteinnachweis durch Immunfärbung ... 35

3.2.6 Nachweis von kohlenhydratbindenden Proteinen ... 36

3.2.7 Chemilumineszenzverfahren ... 37

3.2.8 Auftrennen des Spermienextraktes mittels analytischer HPLC ... 38

3.2.9 Massenspektrometrische Analyse ... 38

3.3 Durchflusszytometrie... 39

3.3.1 Etablierung des Messverfahrens ... 40

3.3.2 Bestimmung der optimalen Inkubationszeit bei der durchfluss- zytometrischen Untersuchung der Mannose-Bindungsstrukturen ... 41

3.3.3 Bestimmung der optimalen Zuckerkonzentration bei der durchfluss- zytometrischen Untersuchung der Mannose-Bindungsstrukturen ... 41

3.3.4 Durchflusszytometrische Untersuchung der Veränderungen in der Mannose/Galaktose Bindung unter Kapazitationsbedingungen ... 42

3.4 Fluoreszenzmikroskopie ... 44

3.5 Explant-Assay ... 45

3.5.1 Gewinnung der Explante ... 45

3.5.2 Koinkubation der Explante mit den Spermatozoen ... 47

3.5.3 Videomikrographie der gebundenen Spermien am Explant ... 47

3.5.4 Berechnung des Bindungsindexes ... 48

3.5.5 Kompetitive Hemmungsversuche ... 49

4 Ergebnisse... 50

4.1 Isolierung der Seminalplasmaproteine ... 50

4.2 Nachweis von mannosebindenden Proteinen im Seminalplasma ... 52

4.3 Nachweis von Spermadhäsinen im Spermienextrakt ... 54

4.4 Nachweis von kohlenhydratbindenden Proteinen im Spermienextrakt ... 55

4.5 Nachweis von AQN-1 im Spermienextrakt ... 57

4.6 Isolierung der Spermienextraktproteine ... 58

(6)

Abkürzungen

4.7 Nachweis mannosebindender Proteine an ejakulierten, Percoll gewaschenen

Spermien mittels durchflusszytometrischer Analyse ... 60

4.8 Nachweis von mannosebindenden Strukturen auf der Spermienoberfläche ... 63

4.9 Explant-Assay ... 64

4.9.1 Vergleich von AQN-1 und AWN-2 im Explant-Assay ... 65

4.9.2 Vergleich der inhibitorischen Wirkung von 2-Fukosyl-Laktose, ... 3-Fukosyl-Laktose, Mannopentaose, N-Acetyl-Neuraminyl-Laktose und β-Laktose im Explant-Assay... 66

5 Diskussion ... 68

5.1 Die Interaktion zwischen Spermium und Oviduktepithel ist ein kohlenhydratvermittelter Prozess ... 69

5.2 Die Rolle der Spermadhäsine... 72

5.3 Nachweis von AQN-1 auf percollgewaschenen Spermien... 74

5.4 Kohlenhydratbindungsstellen des Spermatozoens während der Kapazitation .... 75

5.5 Abschlussbetrachtung ... 77

6 Zusammenfassung ... 79

7 Summary... 82

8 Literaturverzeichnis ... 85

9 Anhang... 104

9.1 Rezeptverzeichnis...104

9.1.1 Spermienextrakte...106

9.1.2 Durchflusszytometrie ...110

9.1.3 Fluoreszenzmikroskopie...110

9.1.4 Explant-Assay ...111

10 Eidesstattliche Erklärung ... 113

11 Danksagung ... 115

(7)

Abkürzungen

Abb. Abbildung

AQN porcines Spermadhäsin mit N-Terminus AQN Aqua dest. Aqua destillata

AU Absorptions Unit

AWN porcines Spermadhäsin mit N-Terminus AWN BCIP 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-Phosphat

BI Bindungsindex

BSA Bovine Serum Albumin (Rinderserumalbumin)

bzw. beziehungsweise

°C Grad Celsius

CO2 Kohlenstoffdioxid

Da Dalton

et al. et alii (und andere)

Explant Gewebestück, welches aus dem ursprünglichen Zellverband entfernt wurde

FITC Fluoreszeinisothiocyanat

HBS Hepes-Buffered-Saline

Hepes N-(2-hydroxyethyl)piperazinN-2-ethan HPLC High Pressure Liquid Chromatography

kDa Kilodalton

l Liter

LMW Low Molecular Weight

MaldiTof Matrix-assisted Laser-Desorption Ionisation Time-of-Flight

M Molar

Mio. Millionen

mg Milligramm

min Minute

ml Milliliter

(8)

Abkürzungen

mM Millimolar

MS Massenspektrometrie

µg Mikrogramm

µl Mikroliter

µm Mikrometer

NaCl Natriumchlorid

NBT Nitroblau Tetrazoliumsalz

N-Glycan Über eine NH2-Gruppe an Glycoproteine gebundene Zuckerseitenkette

nm Nanometer

O-Glycan Über eine OH-Gruppe an Glycoproteine gebundene Zuckerseitenkette

PBS Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (Phosphate-Buffered- Saline)

pH Negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration

PI Propidiumjodid

PSP Porcine Seminalplasmaproteine PVDF Polyvinylidene Difluoride

SDS Sodium-Dodecyl-Sulfate

Tab. Tabelle

TBS Trisgepufferte Kochsalzlösung (Tris-Buffered-Saline) TEMED N,N,N`N`- Tetramethylethylendiamin

TFA Trifluoressigsäure

Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

v/v volume/volume (Volumen/Volumen)

w/v weight/volume (Gewicht/Volumen) x g x-fache der Erdbeschleunigung

z.B. zum Beispiel

(9)

Materialien

Alle verwendeten Chemikalien stammen von Merck, Darmstadt, soweit nicht anders angegeben ist. Die Rezepturen der verwendeten Pufferlösungen und Reagenzien sind im Anhang (9) aufgeführt.

Die Begriffe Spermium und Spermatozoon werden synonym verwendet.

(10)

Abkürzungen

(11)

geworden ist. Um eine erfolgreiche Besamung und Zucht sicherzustellen, ist es unablässig, dass befruchtungskompetente Gameten aufeinander treffen.

Da die Ovulation bei den Haussäugern erst gegen Ende der Brunst erfolgt, muß es einen Mechanismus geben, der das Zusammentreffen von Spermium und Oozyte optimiert. Der Eileiter des weiblichen Tieres birgt besondere Eigenschaften zur Erhaltung der Fortpflanzung. Die meisten Säugetiere haben zu diesem Zweck im Eileiter ein funktionelles Spermienreservoir ausgebildet, in welchem die Spermien gelagert werden können. Während der Lagerung werden die Energiereserven der Spermatozoen geschont und ihre Vitalität erhalten, um die Zeit bis zur Ovulation zu überbrücken.

Zur Aufrechterhaltung einer vitalen Spermienpopulation dient in erster Linie der kaudale Isthmus des Oviduktes. Das Spermienreservoir wird durch die Bindung der Spermien an die zilientragenden Epithelzellen etabliert, gleichzeitig erfolgt durch diesen Vorgang eine Selektion befruchtungskompetenter Spermien. Nachdem die Bindung wieder gelöst ist, erreicht das Spermatozoon durch den Vorgang der Kapazitation mit anschließender Akrosomreaktion seine vollständige Befruchtungsfähigkeit. Im Verlauf der Kapazitation kommt es zu einer Veränderung im Spermienmetabolismus, der zu Hyperaktivierung und durch damit verbundenen größeren Energieverlust auch zu einer geringeren Lebenserwartung führt. Die Aufgabe des Spermienreservoirs der Säugetiere liegt darin, diese komplizierten Vorgänge zu modulieren und mit der Ovulation zu synchronisieren.

Durch vorangegangene Studien ist bekannt, dass die initiale Bindung von Spermatozoen an den Eileiter ein Kohlenhydrat vermittelter Prozess ist, daher kommen lektinähnliche Substanzen (Spermadhäsine) in Frage, die die Bindung ermöglichen. Beim Schwein konnte bereits eine große Gruppe von

(12)

Einleitung

kohlenhydratbindenden Proteinen charakterisiert werden, die als Kandidatenproteine für die Bindung in Frage kommen.

Die Zellkontakte von Spermien und Epithelzellen können einerseits mit standardisierten Zellkulturen, andererseits mit Explant-Bindungs-Assays untersucht werden. Explante sind kleine Teile des Eileiterepithels, die aus dem Ovidukt frisch geschlachteter Altsauen gewonnen werden. Durch die Art der Zellgewinnung sind die Untersuchungen mit Hilfe des Explant-Bindungs-Assays sehr gut vergleichbar mit der in vivo Situation.

Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, den Nachweis zu erbringen, ob Spermadhäsine bei der Etablierung des Spermienreservoirs eine Rolle spielen. Durch Studien von WAGNER et al. (2002) konnte bereits beim Schwein die Zuckerspezifität des beteiligten Rezeptorsystems lokalisiert werden. Im Rahmen der vorliegenden Untersuchungen sollte dieses detailiert charakterisiert werden. Die kohlenhydratbindenden Strukturen der Spermienrezeptoren werden mit Hilfe von Spermienextrakten, Durchflusszytometrie, Fluoreszenzmikroskopie sowie mit dem Explant-Bindungs-Assay untersucht.

(13)

2 Literaturübersicht

2.1 Besamung

Zur Sicherstellung einer erfolgreichen Zucht ist eine exakte Koordination von Insemination und Ovulationszeitpunkt notwendig (FLOWERS u. ESBENSHADE 1993). Durch das angewendete Besamungsregime sollte sichergestellt sein, dass vor der Ovulation eine ausreichende Menge von befruchtungsfähigen Spermatozoen im Eileiter vorhanden ist (DZUIK u. POLGE 1965). Da Ovulationszeitpunkt und Östrusdauer beim Schwein variabel sein können, gibt es oft nur retrospektiv Anhaltspunkte hinsichtlich des Ovulationszeitpunktes. Beim Schwein wird der Beginn der Rausche durch den Zeitpunkt definiert, an dem der Eberaufsprung durch die Sau geduldet wird (WILLEMSE u. BOENDER 1967). Die Ovulation erfolgt bei den meisten Sauen im letzten Drittel der Brunst (WEITZE et al. 1994). Daher sollte die Östrusdauer einer Sau vor der Besamung bekannt sein, um einen geeigneten Besamungszeitpunkt zu wählen. Die Ovulationsdauer beträgt 1-6 Stunden (SOEDE u.

KEMP 1993). Durch Ultraschalltechnik konnte bei neueren Untersuchungen der Ovulationszeitpunkt exakt bestimmt werden und weitere Inseminations- Ovulationsintervalle ausprobiert werden (WABERSKI et al. 1994; NISSEN et al.

1997). Durch diese Studien war es möglich, die Reproduktionsleistung in Hinsicht auf den Besamungszeitpunkt zu bewerten. Bei der Durchführung einer Besamung vor der Ovulation waren zu wenig befruchtungskompetente Spermien am Ort der Befruchtung.

Dies wurde durch eine verminderte Anzahl von akzessorischen Spermien an der Zona pellucida nachgewiesen (SOEDE et al. 1995). Gleichzeitig war ein Anstieg von unbefruchteten bzw. mangelhaft befruchteten Sauen zu verzeichnen.

Bei einer postovulatorischen Besamung sind zwar ausreichend befruchtungsfähige Spermien am Ort der Befruchtung, allerdings sind hier Alterungsprozesse der Oozyten, die bereits 8-12 Stunden nach der Ovulation beginnen, der Grund für eine reduzierte Fertilisationsrate (HUNTER 1967, 1994; HUNTER u. DZUIK 1968).

(14)

Literaturübersicht

Um Schwankungen in der Vorhersage des Ovulationszeitpunktes entgegenzuwirken, wird die Besamungsfrequenz in praxi erhöht. Durch zweimalige Belegungen konnten FLOWERS u. ALHUSEN (1992) deutlich bessere Konzeptionsraten und Wurfgrößenerhöhungen feststellen als bei einmaligen Besamungen.

2.2 Spermatozoon

2.2.1 Morphologie der Samenzelle

Eberspermatozoen entsprechen im wesentlichen den Spermatozoen anderer Säugetierarten (Abb.1). Die Samenzelle geht als Produkt der Gametogenese des männlichen Tieres hervor. Das Spermium besteht aus Kopf, Hals und Schwanz, wobei sich der Spermienschwanz in Mittel-, Haupt- und Endstück gliedert (SETCHEL 1982).

Die Gesamtlänge eines Spermiums liegt zwischen 50 und 70 µm.

Abb. 1: Schematische Darstellung (Querschnitt) der Ebersamenzelle

(15)

2.2.2 Spermienkopf

Der Spermatozoenkopf beinhaltet fast ausschließlich den Zellkern, der aus stark kondensiertem Chromatin besteht, das die Desoxyribonucleinsäure als Träger der genetischen Information enthält (MONESI 1976). Der Zellkern ist von der inneren und äußeren Kernmembran umgeben und ist von ovaler bis rechteckiger, seitlich abgeflachter Form. Der Kopf eines Eberspermatozoen ist 7-10 µm lang und 4-5 µm breit (DÖCKE et al. 1982). Ungefähr 2/3 des Kopfes bestehen aus der Kopfkappe, dem sogenannten Akrosom, das aus den Vesikeln des Golgikomplexes entsteht. Das Akrosom beinhaltet hydrolytische Enzyme wie Akrosin und Hyaluronidase, die bei der Interaktion mit der Eizelle freigesetzt werden und dadurch dem Spermium die Penetration der Oozyte ermöglichen (YANAGIMACHI 1994). Das Halsstück des Spermiums stellt eine bewegliche Verbindung zwischen Spermienkopf und Spermienschwanz dar. Als Kontaktstelle gilt die Basalplatte, die zwischen der Implantationsgrube des Kerns und dem proximalen Zentriol eine Verbindung herstellt.

Dieser als Gelenkkopf bezeichnete Bereich ist eine Prädilektionsstelle für Halsbrüche.

2.2.3 Spermienschwanz

Der Spermienschwanz wird in Mittel-, Haupt- und Endstück unterteilt und entspringt als Achsenfaden am proximalen Zentriol des Spermienhalses. Der Achsenfaden besitzt eine für Geißeln typische radialsymetrische Struktur, die aus zwei zentral angeordneten Mikrotubuli, umgeben von neun Doppelmikrotubuli sowie neun Außenfibrillen, besteht. Um die Energieversorgung des Spermiums sicherzustellen, ist das Mittelstück von einer einlagigen, spiralförmig angeordneten Schicht Mitochondrien umgeben. Den längsten Teil des Spermienschwanzes bildet das Hauptstück, wobei die Dicke der Außenfibrillen nach distal abnimmt. Dieser Bereich ist von der sogenannten Ringfaserscheide umgeben, die aus einer Schicht fibrillärer Proteine besteht. Am Ende der Ringfaserscheide beginnt das Endstück, das weder Mantelfasern noch eine Faserscheide besitzt und in dessen Verlauf der Achsenfaden

(16)

Literaturübersicht

frei vom Plasmalemm umgeben ist (SETCHEL 1982). Alle Abschnitte eines Spermatozoons sind von einer Plasmamembran umgeben, deren Lipidzusammensetzung entsprechend der Funktion der einzelnen Spermatozoenareale variiert.

2.3 Spermatozoenreifung

Die sich an die Spermatogenese anschließende posttestikuläre Spermienreifung ist für die Befruchtungsfähigkeit der Samenzellen essentiell. Die posttestikuläre Spermienreifung vollzieht sich während der Nebenhodenpassage und der Ejakulation.

Die aus dem Keimepithel des Hodens freigesetzten Spermien besitzen noch nicht die Fähigkeit, sich aktiv fortzubewegen. Sie werden durch Kontraktionen der myoiden Zellen der Lamina propria der Samenkanälchen zum Rete testis des Hodens transportiert und gelangen von dort in den Nebenhoden. Der Nebenhoden wird in die Bereiche Nebenhodenkopf, Nebenhodenkörper und Nebenhodenschwanz gegliedert.

Durch die Passage im Nebenhoden erfahren die Spermien einige physiologische, morphologische und biochemische Veränderungen, die als Nebenhodenreifung bezeichnet werden. Verbunden mit diesen Prozessen kommt es im Nebenhodenkörper zum Erwerb der Motilität, während der Nebenhodenschwanz hauptsächlich als Spermienspeicher genutzt wird.

Im Verlauf der Nebenhodenpassage kommt es zu einer biochemischen Veränderung an der Oberfläche der Spermatozoen, die sowohl Kohlenhydrate und Proteine als auch in die Membran integrierte Lipide betreffen (YANAGIMACHI 1994). Hier finden Umbauprozesse der Plasmamembran statt, die durch Lokalisationsänderungen von integralen oder peripheren Membranproteinen gekennzeichnet sind (HAMMERSTEDT et al. 1982). Des weiteren werden Peptidstrukturen zum Teil partiell durch den Einbau von epididymalen Proteinen ersetzt (OVERSTREET 1983, DACHEUX et al. 1989).

(17)

Eine wichtige Rolle spielt das im Nebenhoden synthetisierte Cholesterin für den Schutz der Spermatozoen vor mechanischer Schädigung. Cholesterin wird vom Epithel des Nebenhodens sezerniert und in die Plasmamembran des Spermiums eingebaut (SEKI et al. 1992). Die Negativladung der Spermienoberfläche steigt während des Reifungsvorganges an; eine Hypothese beschreibt als Ursache die Übertragung von Sialsäuren auf Glykokonjugate durch Sialyltransferasen, die ebenfalls Bestandteil der Nebenhodenflüssigkeit sind (TULSANI et al. 1993; FLECHON 1979).

Nach der Passage durch den Nebenhoden besitzen die Spermatozoen die vollständige Fähigkeit, an die Zona pellucida der Oozyte zu binden und sind in der Lage, sich gerichtet vorwärts zu bewegen (COOPER 1996, KIRCHHOFF u. IVELL 1995). Die Dauer der Reifung im Nebenhoden variiert beim Säuger zwischen zwei und elf Tagen (JOHNSON und VARNER 1988).

Während der Ejakulation kommen die Spermatozoen mit den Sekreten der akzessorischen Geschlechtsdrüsen in Berührung und verlieren vorübergehend ihre Befruchtungsfähigkeit wieder. Dieser Vorgang dient dem Schutz des Spermiums vor Degeneration, aber vor allem soll frühzeitige Kapazitation beziehungsweise das Eintreten der Akrosomreaktion vermieden werden. Diese Schutzeinrichtung ist insbesondere während der Ejakulation und der nachfolgenden Wanderung im weiblichen Genital bis zum eigentlichen Ort der Befruchtung, dem Eileiter, notwendig (TÖPFER-PETERSEN et al. 1996).

(18)

Literaturübersicht

2.4 Kapazitation

Durch AUSTIN u. CHANG wurde 1952 erstmals die Bedeutung der Kapazitation beschrieben. Mit Kapazitation ist eine physiologische und biochemische Veränderung gemeint, die notwendig ist, um die Spermien auf die Befruchtung vorzubereiten bzw.

die Akrosomreaktion einzuleiten. Die Kapazitation kann als progressiver Destabilisierungsprozess angesehen werden, der für die Akrosomreaktion essentiell ist (YANAGIMACHI 1994).

Den Spermien sind so genannte Dekapazitationsfaktoren aufgelagert, die eine vorzeitige Kapazitation verhindern sollen (SHIVAJI et al. 1990, YANAGIMACHI 1994). Die Stabilisierung der Spermatozoenmembran erfolgt über den Einbau von Cholesterin, über Protein-Proteinwechselwirkungen wird dann eine Schutzschicht um die empfindliche akrosomale Region des Spermienkopfes gebildet.

Biochemisch gesehen betreffen die Veränderungen während der Kapazitation im wesentlichen die Membranen der Spermatozoen, sowie die intrazellulären Ionenkonzentrationen (BEDFORD u. HOSKINS 1990). Durch die Entfernung der Sialsäuren und der Sulfatreste aus der Plasmamembran durch Hydrolasen des weiblichen Genitalsekretes nehmen die negativen Oberflächenladungen ab (LANGLAIS et al. 1981). Aus der Plasmamembran wird zusätzlich Cholesterin entfernt, das über verschiedene Lipoproteine reguliert wird.

Durch die erhöhte Membrandurchlässigkeit kommt es zu einem zweiphasigen Calciuminflux. Hierbei ist die erste Phase mit dem Kapazitationsprozess eng verbunden, während die zweite Phase durch einen massiven Anstieg der Calciumionen den Beginn der Akrosomreaktion anzeigt (FRASER 1995). Durch die Aktivierung der Calcium abhängigen Adenylatcyclase steigt der intrazelluläre cAMP-Spiegel, Proteinkinase A wird aktiviert; die wiederum reguliert die Tyrosinkinaseaktivität (VISCONTI et al. 1997; VISCONTI u. KOPF 1998). Eine kapazitationsabhängige Tyrosinphosphorylierung wurde 1996 von TÖPFER-PETERSEN et al. beim Eber und Bullen beobachtet. Durch den Anstieg des intrazellulären Calciums und cAMP sowie

(19)

durch die Destabilisierung der Spermatozoenmembran kommt es zu einer Hyperaktivierung der Spermatozoen am Ende des Kapazitationsvorganges.

An welchem Ort im weiblichen Genitaltrakt die Kapazitation beginnt, ist speziesabhängig. Bei Tierarten mit intrauteriner Ejakulatdeponierung erfolgt die Kapazitation fast ausschließlich im unteren Isthmusabschnitt des Eileiters (YANAGIMACHI 1994).

KAWAKAMI et al. (1998) konnten in einer Studie zeigen, dass die Kapazitation bei Hundespermatozoen durch Eileiterflüssigkeit induzierbar ist. Durch verschiedene Medien mit Zusätzen wie BSA, Hydrogencarbonat oder Calcium kann in vitro eine Kapazitation herbeigeführt werden (VISCONTI et al. 1997). HARRISON (1996) berichtete, dass die Kapazitation ein spezifischer, initiierbarer und kontrollierbarer Prozeß ist, bei dem Hydrogencarbonat die entscheidende Rolle spielt.

Sind die Spermatozoen kapazitiert, ist ihre Membran instabil und ihre Lebensdauer verringert (BEDFORD 1970), so dass davon ausgegangen werden kann, dass der Prozeß der Kapazitation mit der Ovulation synchronisiert sein muß. Durch HUNTER (1995) wurde beschrieben, dass der Ablauf der vollständigen Kapazitation nicht von der Verweildauer der Spermien im unteren Isthmusabschnitt abhängt, sondern direkt mit der Ovulation in Zusammenhang zu bringen ist.

Diese Vorgänge sind in ihrer Gesamtheit notwendig, damit das Spermatozoon später die Akrosomreaktion durchführen und sich schließlich mit der Eizelle vereinigen kann.

(20)

Literaturübersicht

2.5 Akrosomreaktion

Bei der Akrosomreaktion werden akrosomale Enzyme aktiviert und freigesetzt, die für die Penetration der Zona pellucida benötigt werden. Bei dieser Reaktion fusioniert die äußere akrosomale Membran mit der darüber liegenden Plasmamembran; dadurch werden Kanäle im Akrosom gebildet und lytische Enzyme freigesetzt (YANAGIMACHI 1994). Durch diese Enzyme kommt es zu einer partiellen Hydrolyse der Zona pellucida, wodurch die Spermatozoen in der Lage sind, die extrazelluläre Matrix zu penetrieren. Die Penetration ist die Voraussetzung für die Fusion mit der Vitellinmembran der Oozyte.

Das zentrale Ereignis der Akrosomreaktion ist die Exozytose des Spermienakrosoms die durch einen massiven Influx extrazellulärer Calciumionen entsteht (FLORMANN et al. 1992; FRASER 1993). Dabei haben Untersuchungen von HARRISON et al.

(1993) bei Eberspermatozoen ergeben, dass durch die Anwesenheit von Bicarbonat die intrazelluläre Calciumaufnahme erleichtert wird. Durch den Anstieg des intrazellulären Calciumspiegels erhöht sich der pH-Wert intrazellulär, die negative Ladung an der Spermienoberfläche vermindert sich, und durch diese Komponenten wird die Plasmamembran der Spermatozoen direkt destabilisiert.

(21)

2.6 Seminalplasma

Direkt nach der Ejakulation verlieren Säugetierspermatozoen die bereits im Nebenhoden erworbene Fähigkeit, eine Eizelle zu befruchten. Dieses Phänomen ist auf den Einfluss des Seminalplasmas zurückzuführen. Als Seminalplasma wird das sekretorische Produkt von Hoden und Nebenhoden sowie der verschiedenen akzessorischen Organe (Ampulle, Samenblasendrüse, Prostata, Bulbourethraldrüse) des männlichen Genitaltraktes bezeichnet. Die verschiedenen Drüsen beinhalten sowohl vom Volumen als auch von der Zusammensetzung unterschiedliche Komponenten, die jahreszeitlichen und auch individuellen Schwankungen unterliegen.

Die Befruchtungsfähigkeit geht vorübergehend verloren, weil die Inhaltsstoffe des Seminalplasmas sich während der Ejakulation wie eine Schutzhülle um die Spermatozoen legen und die Spermien vor Schädigungen, Umwelteinflüssen und frühzeitiger Kapazitation schützen (SHIVAJI 1990).

Noch vor einigen Jahren waren Wissenschaftler der Meinung, dass diese Schutz- und Nährfunktion (WILLIAMS-ASHMAN 1988) die einzige Aufgabe des Seminalplasmas sei. Inzwischen ist die Zusammensetzung des flüssigen, spermienfreien Anteils des Ejakulates besser untersucht, und es sind diverse neue Erkenntnisse gewonnen worden.

Das Seminalplasma enthält niedermolekulare organische Substanzen wie freie Aminosäuren, Monosaccharide, Prostaglandine, Polyamine, Lipide, Steroidhormone und Proteine (MANN und LUTWACK-MANN 1981). Weiterhin sind eine Reihe von verschiedenen Ionen wie Na+, K+, H+, Mg2+, Cl- und Ca2+ gefunden worden (HAFEZ 1993; FRASER 1995). Der pH-Wert des Seminalplasmas liegt im basischen Bereich zwischen 7,2 und 7,8, um das saure Milieu im weiblichen Genitale zu neutralisieren, und bietet eine Spermienschutzfunktion (SETCHELL et al. 1994).

(22)

Literaturübersicht

2.7 Spermientransport im weiblichen Genitaltrakt

Bereits vor dem Zeitpunkt der Ovulation sind am Ort der Befruchtung schon ausreichend befruchtungskompetente Spermatozoen vorhanden. Dies kennzeichnet einen erfolgreichen Spermientransport, denn schon vor dem Einsetzen physiologischer Alterungsprozesse der Oozyte können die Spermatozoen die Eizelle penetrieren und befruchten. Der Spermientransport ist ein komplexer Vorgang, der durch verschiedene Faktoren beeinflusst wird. Seminalplasmaanteil, Seminalplasmazusammensetzung, Paarungsverhalten der Tierart, der weibliche Reproduktionstrakt mit mechanischen und physikochemischen Barrieren sowie immunogene Anteile des Uterus (HUNTER 1988, 1995) beeinflussen die Spermatozoen auf ihrem Weg zum Eileiter. Bei den Säugetieren wird zwischen Tieren unterschieden, die das Ejakulat vaginal (Rind, Ziege, Schaf, Kaninchen, Affe) oder im Uterus (Pferd, Schwein) deponieren. Der eigentliche Transport zum Ovidukt erfolgt in einer Kombination aus aktivem und passivem Transport. Durch VIRING u. EINARSSON (1981) wurde erstmals ein transuteriner Transport von Spermatozoen durch koordinierte Myometriumskontraktionen beim Schwein beschrieben.

Durch im Uterus vorhandene Hormone wie Östrogene und Progesteron wird die Motilität des Uterus gesteigert (CLAUS et al. 1989). Auch Östrogene sind im Seminalplasma enthalten, wodurch eine Synthese und Freisetzung von Prostaglandin F 2 α induziert wird (PAKRASI et al. 1983). Durch die Hormonfreisetzung kommt es zu einer Frequenzsteigerung der Kontraktionswellen am Uterus (CLAUS u. SCHAMS 1990). Die Tierarten bei denen die Spermatozoen direkt in den Uterus abgesetzt werden, besitzen als Hauptbarriere die uterotubale Verbindung, die aktiv überwunden werden muß und der eine gewisse selektive Funktion auf die Gesamtpopulation der Spermien zukommt (HUNTER 1995).

Je nach Tierart sind die Zeiten unterschiedlich, in denen sich eine Anzahl befruchtungsfähiger Spermien in der uterotubalen Verbindung und im kaudalen Isthmus etabliert. Untersuchungen von STEVERINK et al. (1998) ließen die

(23)

Vermutung zu, dass beim Schwein bereits 30 Minuten nach der Insemination eine ausreichende Anzahl Spermatozoen im Ovidukt vorhanden ist, um eine Fertilisation zu ermöglichen. Durch Untersuchungen von HUNTER (1981) konnte nachgewiesen werden, dass beim Schwein innerhalb von 30 Minuten 50 % der Oozyten befruchtet sind und nach maximal 2 Stunden eine 100%ige Fertilisation gewährleistet ist. Wird die Besamung oder Bedeckung einer Sau in Ovulationsnähe durchgeführt, ist die Transportgeschwindigkeit sowie die Anzahl transportierter Spermatozoen erhöht (HUNTER 1981). Untersuchungen ergaben, dass es bei Pferd und Rind nach der Bedeckung 4-8 Stunden dauert, bis sich eine ausreichende Anzahl befruchtungskompetenter Spermatozoen am Befruchtungsort befindet (SCOTT u.

OVERSTREET 1999).

(24)

Literaturübersicht

2.8 Funktionelles Spermienreservoir

Besonders bei Haussäugetieren mit mehrtägiger Östrusdauer ist bei einer frühen Bedeckung bzw. Besamung in der Brunst eine Art Spermienspeicher im weiblichen Genitaltrakt erforderlich, in dem die Befruchtungsfähigkeit der Spermatozoen bis zur Freissetzung der Eizelle bewahrt werden kann.

Der kaudale Isthmus des Eileiters erfüllt die Aufgaben eines funktionellen Spermienreservoirs sowohl bei Scheidenbesamern, wie Ziege, Schaf und Rind (Reservoir II) als auch bei Uterusbesamern, wie Pferd und Schwein (Reservoir I).

Das Spermienreservoir besitzt verschiedene wichtige Aufgaben:

1. Selektion intakter, befruchtungsfähiger Spermien

2. Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Spermien bis zum Zeitpunkt der Ovulation

3. Regulation von Hyperaktivierung und Kapazitation

4. Begrenzung der Spermienzahl am Ort der Befruchtung durch gezielte Loslösung

Durch das extrem enge Lumen im Bereich des Eileiteristhmus kommt es zu einer Auftrennung der Gesamtspermienpopulation. Ein Teil der Spermienpopulation befindet sich im Lumen des Eileiters, ein anderer Teil bindet an das Schleimhautepithel (MBURU et al. 1997). Die im Lumen befindlichen Spermien unterliegen morphologischen Veränderungen im Sinne eines Alterungsprozesses, während die an die Epithelzellen der Schleimhaut gebundenen Spermien vor einem Transport durch die Zilien geschützt sind (BLANDAU u. GADDUM-ROSSE 1974).

Die Spermien sind im Eileiter vor Phagozytose, übermäßigem Energieverlust sowie frühzeitiger Kapazitation geschützt. Die Regulation dieser Vorgänge unterliegt der zyklusstandabhängig unterschiedlichen Zusammensetzung der luminalen Eileiterflüssigkeit hinsichtlich des Proteingehaltes, enzymatischer Aktivität, Elektrolytgehalt und Viskosität.

(25)

Kapazitierte Spermien besitzen eine deutlich reduzierte Fähigkeit mit den Oviduktepithelzellen eine Bindung einzugehen (FAZELI et al. 1999) sowie deutlich sichtbare hyperaktive Geißelbewegungen, durch die sie aktiv zum Ort der Befruchtung (Ampulla) gelangen (SMITH 1998). Durch das funktionelle Spermienreservoir wird sichergestellt, dass zum Zeitpunkt der Ovulation ausreichend befruchtungskompetente Spermien zur Befruchtung zur Verfügung stehen, da die Spermatozoen zeitlich versetzt freigesetzt werden. Somit spielt das Spermienreservoir für eine erfolgreiche Befruchtung eine bedeutende Rolle (Abb.2).

In der Literatur wird die Beteiligung von Kohlenhydrat-Proteinbindungen bei der beschriebenen Anheftung der Spermien an das Epithel des Spermienrerservoirs diskutiert (SMITH u. YANAGIMACHI 1991; SUAREZ et al. 1991; HUNTER 1995 LEFEBRE et al. 1997; GEHLHAAR et al. 2000; WAGNER et al. 2001). Die Erkennung der spezifischen kohlenhydratbindenden Proteine oder lektinähnlichen Moleküle der Spermien erfolgt über vom Oviduktepithel exprimierte Oligosaccharide (SUAREZ 1998; SUAREZ et al. 1998).

Abb. 2: Bindungsmodell des funktionellen Spermienreservoirs; gebundene Spermatozoen (grau) an Oligosaccharidstrukturen des Oviduktepithels. Nach der Kapazitation lösen sich die Spermien (weiß) vom Epithel und setzen ihre Migration fort.

(26)

Literaturübersicht

2.9 Spermadhäsine

Als Spermadhäsine werden Proteinmoleküle mit kleiner molekularer Masse (12-15 kDa) bezeichnet, die sich im Seminalplasma verschiedener Säugetierspezies nachweisen lassen.

Tab. 1: Nomenklatur der Spermadhäsine

Tierart Spermadhäsine

Schwein AWN-1, AWN-2

AQN-1, AQN-3 PSP-1, PSP-2

Rind aSFP

Pferd HSP-7

Spermadhäsine sind spermienoberflächenassoziierte Eiweiße, für die Funktionen bei der Kapazitation sowie bei der Gametenerkennung gezeigt werden konnten (CALVETE et al. 1996, RODRIGUEZ-MARTINEZ et al. 1998). Die Analyse ihres Ursprungs, ihrer Lokalisation auf der Oberfläche und ihres Ligandenbindungsverhaltens sowie ihre quantitative Bestimmung kann wertvolle Hinweise geben, um die Funktion auf molekularer Ebene zu verstehen und damit auch reproduktionsmedizinisch effektiver in das Fortpflanzungsgeschehen eingreifen zu können.

Die Primärstruktur der Spermadhäsine besteht aus 111-133 Aminosäuren mit einer Sequenzidentität von 40 – 60% und einer homologen Anordnung von zwei Disulfidbrücken (SANZ et al. 1991, 1992a, 1992b; EINSPANIER et al. 1994). Jeweils zwei benachbarte Cysteinreste sind über zwei Disulfidbrücken verknüpft. Es konnte nachgewiesen werden, dass Spermadhäsine von ihrer Struktur zu einer Familie von ontogenetisch regulierten Proteinen gehören, die durch die sogenannte CUB-Domäne charakterisiert sind (BORK u. BECKMANN 1993).

(27)

Die Namensgebung erfolgte durch den Vergleich von Proteinsequenzen der Komplementfaktoren Clr/Cls, des embryonalen Seeigelproteins Uegf sowie des Knochen-morphogenetischen-Proteins bmpf. Für die CUB-Domäne wurde eine ähnliche Tertiärstruktur vorgefunden wie im variablen Bereich der Immunglobuline.

Als Erkennungsmerkmal sind neun antiparallele β-Faltblattstränge beschrieben (Bork u. Beckmann 1993). Durch ROMERO et al. konnte 1997 mittels Röntgenstrukturanalyse und durch biophysikalische Verfahren erstmals die dreidimensionale Struktur der CUB-Domäne am Beispiel der Spermadhäsine aufgeklärt werden. Spermadhäsine enthalten eine einzige CUB-Domäne.

Spermadhäsine sind in der Lage, spezifisch an Kohlenhydrate zu binden, zeigen mit den bisher bekannten Lektinen aber keinerlei Ähnlichkeit. Aus diesem Grund werden sie als eine Gruppe neuartiger Lektine angesehen.

Das Spermadhäsin AWN bildet in seinem Syntheseort eine Ausnahme zu den anderen Spermadhäsinen, denn es wird nicht erst in den akzessorischen Geschlechtsdrüsen gebildet, sondern bereits in den Tubuli recti und im Rete testis des Hodens (SINOWATZ et al. 1995; EKHLASI-HUNDRIESER et al. 2002).

Spermadhäsine besitzen verschiedene Möglichkeiten, an biochemischen Prozessen teilzunehmen. Über die Kohlenhydratbindungsmöglichkeiten hinaus sind Spermadhäsine in der Lage, Glycoaminoglycane, Phospholipide und Serinproteinaseinhibitoren zu binden (SANZ et al. 1992a). Durch ihr Bestreben, sulfatierte Glukosaminoglycane wie Heparin zu binden, können sie als regulative Kapazitationsfaktoren wirken (CALVETE et al. 1995).

Eine wichtige Rolle spielen die Spermadhäsine bei der Bindung der Gameten, die über die apikale Region des Spermienkopfes vermittelt wird. Durch indirekte Immunfluoreszenzmikroskopie zeigten SANZ et al. (1993), dass Spermadhäsine im akrosomalen Bereich des Spermienkopfes lokalisiert sind und gingen von einer Beteiligung der Spermadhäsine bei der initialen Bindung der Gameten aus. AWN wurde durchflusszytometrisch durch PETRUNKINA et al. (2000) an lebenden Spermatozoen nachgewiesen.

(28)

Literaturübersicht

RODRIGUEZ-MARTINEZ et al. (1998) konnten nachweisen, dass AWN bei an die Zona pellucida gebundenen Spermatozoen in vivo als Bindungspartner noch zur Verfügung steht.

(29)

3 Material und Methoden

3.1 Spermienaufbereitung

3.1.1 Gewinnung der Ejakulate

Für die Versuche wurden ausschließlich Spermatozoen klinisch gesunder, institutseigener Eber verwendet. Alle Eber wurden während der Versuchsdurchführung von November 2001 bis Dezember 2002 regelmäßig abgesamt, um eine möglichst gleichbleibende Samenqualität zu gewährleisten. Die Tiere wurden jeweils am Versuchstag mit Hilfe eines Phantoms durch die Handmethode abgesamt.

In einem isolierten Gefäß mit einem innenliegenden Plastikbeutel wurde das Ejakulat aufgefangen. Durch ein steriles Netz wurde das Bulbourethraldrüsensekret abgetrennt.

Für die Versuche im Explant-Assay wurde die spermienreiche Fraktion des Ejakulates gesammelt, bei allen anderen Untersuchungen wurde das Gesamtejakulat verwendet.

Es wurden für alle Untersuchungen ausschließlich Spermatozoen eingesetzt, die sich nach dem konventionellen Verfahren als normosperm erwiesen. Alle verwendeten Spermatozoen wurden einer Dichtegradientenzentrifugation mit Percoll (Amersham Biosciences, Uppsala, Schweden) unterzogen.

3.1.2 Konventionelle spermatologische Untersuchung

Mit Hilfe eines Phasenkontrastmikroskopes (Zeiss 1697, Jena) mit Wärmeplatte wurden die Samenzellen direkt nach der Gewinnung bei 160-facher Vergrößerung einer Motilitätsschätzung unterzogen. Weiterhin erfolgte eine makroskopische Beurteilung von Farbe und Beschaffenheit des Ejakulates, die Bestimmung der Samenzelldichte und Untersuchung der Samenzellmorphologie. Um den Anteil der morphologisch abweichenden Spermien festzustellen, wurden 200 Spermien unter dem Phasenkontrastmikroskop mit Ölimmersion bei 1000-facher Vergrößerung ausgezählt und beurteilt. Aus der spermienreichen Fraktion des Ejakulates wurden

(30)

Material und Methoden

10 µl in ein Eppendorfgefäß (Eppendorf, Sarstedt) zusammen mit temperaturgleicher Formolcitratlösung pipettiert und vermischt. Von dieser Suspension wurden auf einem staubfreien Objektträger zwei Tropfen aufgetragen und mit Deckgläsern (18 x 18 mm) abgedeckt. Diese fixierten Spermien wurden nach KRAUSE (1965) untersucht.

3.1.3 Dichtegradientenzentrifugation mit Percoll

Bei der Dichtegradientenzentrifugation mit Percoll (Amersham Biosciences, Uppsala, Schweden) wurde eine Trennung vorwärtsbeweglicher Spermien von den übrigen Bestandteilen des Ejakulates aufgrund des unterschiedlichen spezifischen Gewichtes und der unterschiedlichen Sedimentationsgeschwindigkeit erreicht (CLAASSENS et al. 1998, PERTOFT et al. 1977).

Ein Zentrifugenröhrchen aus Glas mit konischem Boden wurde in schräger Position zunächst mit 2 ml 70 % Percoll-Lösung befüllt und anschließend mit 4 ml 35 % Percoll-Lösung überschichtet. Dabei sollte darauf geachtet werden, dass die 35 % Percoll-Lösung beim Pipettieren vorsichtig an der Wand des Röhrchens entlang läuft und beide Lösungen sich nicht vermischen.

Die Zentrifugation erfolgte bei 20 °C in zwei Schritten:

a.) 10 min bei ca. 300 x g b.) 20 min bei ca. 800 x g

Nach der Zentrifugation konnte der Überstand mit Hilfe einer Eppendorfpipette abgehebert werden. Das Spermienpellet am Boden des Glasgefäßes wurde mit 500 µl HBS-Pufferlösung resuspendiert. Die Ermittlung der Spermiendichte folgte mit einer Zählkammer nach Thoma. Dazu wurden 10 µl Spermiensuspension in 10 ml einer 10

% Kochsalzlösung gegeben und nach der Durchmischung in eine vorbereitete Thoma- Zählkammer pipettiert. Nachdem die Spermien sich nach einer Minute Ruhezeit abgesetzt hatten, konnten sie unter dem Mikroskop bei einer 40 fachen Vergrößerung

(31)

ausgezählt werden. Zur Ermittlung der Dichte wurden im oberen und unteren Zählkreuz jeweils fünf Quadrate ausgezählt und addiert.

ausgezählte Spermien Dichte =

ausgezählte Fläche x Kammerhöhe x Verdünnung Ausgezählte Fläche = 10/25 mm2

Kammerhöhe = 1/10 mm Verdünnung = 1: 1000

Der durch Einsetzen in die Formel errechnete Faktor beträgt 10.000 und wurde mit den ausgezählten Spermien multipliziert. Das Resultat ergab die Dichte in Mio Spermienzellen /ml.

3.1.4 Darstellung der Membranintegrität durch Propidiumjodidfärbung

Propidiumjodid gehört zu den Farbstoffen, die in der Lage sind, eine nicht intakte Zellmembran zu durchdringen und an die DNA der Zelle zu binden. Das Absorptionsmaximum liegt bei 536 nm, der maximale Emissionsbereich bei 617 nm.

Hierbei weisen Zellen mit nicht intakter Zellmembran eine rote Fluoreszenz auf. Mit einer Endkonzentration von 0,5 mg/ml wurde Propidiumjodid in Aqua dest. gelöst und im Gefrierschrank bei -20 °C lichtgeschützt aufbewahrt (HARRISON u. WICKERS 1990). Die Spermiensupension (970µl) wurde mit 20µl Formolcitrat und 10µl Propidiumjodid versetzt. Nach 5 Minuten Reaktionszeit unter Lichtabschluss wurden rote (membrandefekt) und grüne (membranintakt) Spermienzellen ausgezählt. Je 200 Samenzellen wurden unter dem Fluoreszenzmikroskop bei einer Wellenlänge von 536 nm ausgewertet und prozentual angegeben. Durch dieses Verfahren konnte der Anteil der membrandefekten Spermien objektiv ermittelt werden.

(32)

Material und Methoden

3.2 Biochemische Charakterisierung von Proteinen

3.2.1 Auftrennen des Seminalplasmas mittels analytischer HPLC

Zur Herstellung eines spermienfreien Seminalplasmas wurde das Gesamtejakulat zentrifugiert und der Überstand abpipettiert. Die Zentrifugation erfolgte bei 160 x g bei 20 °C für 10 Minuten. Nach einer lichtmikroskopischen Kontrolle auf Spermienfreiheit wurde das Seminalplasma lyophilisiert und davon 4 mg mit 1 ml eines 0,0085 %igen Trifuoressigsäure (TFA)-Wassergemisches (Puffer A) verdünnt, und über eine analytische C18-Säule (ET 250/10, Nucleosil 100-7, Macherey-Nagel, Düren, Deutschland), die mit einem reverse phase HPLC-System (Beckman mit LKB 2141 Detektor, Pharmacia, Freiburg) verbunden war, aufgetrennt. Die Detektion erfolgte bei einer Wellenlänge von 220 nm. Die Durchflussrate betrug 2 ml/min, die Range 2,0 AU. Die Elution erfolgte durch 90 % Acetonitril + 0,085 % TFA in Wasser (Puffer B) bei einem Gradienten von 25-70 % in 60 Minuten und von 70-90 % in 10 Minuten. Das Chromatogramm wurde bei einem Papiervorschub von 2 mm/min erstellt. Die Fraktionen wurden aufgefangen und lyophylisiert.

3.2.2 Herstellung von Spermienextrakten

Die Dichte der Spermatozoen wurde auf 107 Spermatozoen/ml HBS-Puffer eingestellt.

Die Extraktion erfolgte durch Extraktionspuffer/1 % Chaps in PBS-Puffer (AppliChem, Darmstadt). Das vorbereitete Gefäß mit Spermien und Puffern wurde 20 Minuten bei 1000 x g zentrifugiert und der Überstand in ein frisches Gefäß abpipettiert.

(33)

3.2.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Zu analytischen Zwecken wurde die Elektrophorese in einer Modifikation nach der von LAEMMLI (1970) beschriebenen Methode durchgeführt. Die verwendeten 18 %igen Polyacrylamidgele wurden selbst hergestellt und mit einem 4,5 % igen Sammelgel überschichtet. In diesem Sammelgel wurden je nach Versuchsansatz Kunststoffkämme eingesetzt, durch die eine unterschiedliche Anzahl von Probentaschen im Gel geformt wurden. Die aufgebrachten Spermienextrakte wurden von 2 bis 15 µl mit je 2fach konzentriertem Laemmli-Puffer versetzt, 7 Minuten bei 95 °C erhitzt, 1 Minute auf Eis gestellt und 1 Minute bei 13.000 x rpm zentrifugiert. Je nach Auftragsvolumen der Probe variierten die Taschengrößen des Gels. Zur Ermittlung der relativen Molekulargewichte wurde routinemäßig ein LMW-Standard (Low Molecular Weight Proteinstandard, Bio Rad, 161-0304) verwendet.

Die Elektrophorese wurde in einer Elektrophoresekammer (Bio Rad Mini-Protein II, Bio Rad) durchgeführt. Im oben aufgetragenen Sammelgel erfolgte die Auftrennung der Proteine mit 100 V, im Trenngel wurde die Stromstärke auf 200 V erhöht. Durch das Austreten des blauen Farbstoffes am unteren Gelrand wurde das Ende der Elektrophorese sichtbar. Nach diesem Verfahren konnten die zu analysierenden Proteine auf Membranen übertragen werden oder mit Coomassie Brilliant Blue R (Serva, Heidelberg, 35051) angefärbt werden.

Die Gele wurden nach der Elektrophorese für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit Coomassie Brilliant Blue R (Serva, Heidelberg 35051) 0,25 % ige Färbelösung (40 % Methanol, 10 % Eisessig) angefärbt. Um die überschüssige Hintergrundfarbe zu entfernen, wurde das Gel in einer Entfärbelösung (20 % Methanol, 10 % Eisessig) geschwenkt. Die Entfärbelösung wurde bei diesem Vorgang mehrmals gewechselt.

Zwischen mit Wasser befeuchteten Cellophanblättern (Gel Drying Film, Promega, Madison) wurden die Gele bei Raumtemperatur getrocknet.

(34)

Material und Methoden

3.2.4 Western Blot Analyse

Zu den empfindlichsten Nachweismethoden der Proteine nach elektrophoretischer Auftrennung gehören immunologische Verfahren. Zu diesem Zweck werden Proteine aus dem Gel durch ein Blotting-Verfahren auf eine Membran transferiert. Nach der von TOWBIN et al. (1992) beschriebenen Methode wurde der Elektroblot durchgeführt. Die 6 x 8 cm große PVDF Membran (Roche, Nr. 1722026) wurde für eine Minute mit 100 % Methanol durchfeuchtet und danach in Aqua dest. und Blotting-Puffer äquilibriert. In einem Semi-dry-Apparat (Biometra, Göttingen) mit Wasserkühlung wurde ein Blotsandwich, bestehend aus drei Lagen Blotpapier (GB 003, Schleicher & Schuell, Dassel), der Blotmembran, dem Gel und wiederum drei Lagen Blotpapier, angeordnet. Das Blotpapier wurde vorher in Blottingpuffer angefeuchtet, dann wurden die Proteine bei 1 mA/cm2 für zwei Stunden bei Raumtemperatur übertragen.

(35)

3.2.5 Spezifischer Proteinnachweis durch Immunfärbung

Die Qualität der Übertragung durch den Blotvorgang wurde durch das Färben der geblotteten Gele in Coomassie Brilliant Blue und durch eine reversible Färbung der geblotteten Membran in Ponceau Rot (5 min bei Raumtemperatur) kontrolliert. Bei erfolgreicher Übertragung wurde die angefärbte Membran mit Aqua dest. entfärbt und über Nacht bei 4 °C in Blocking Reagenz (Roche, Nr. 1096176) inkubiert, um die freien Kapazitäten der Membran abzusättigen und unspezifische Bindungen der verwendeten Antikörper an die Membran zu verhindern. Die darauf folgende Inkubation mit dem ersten Antikörper wurde für eine Stunde bei Raumtemperatur durchgeführt. Alle verwendeten Antikörper wurden vor der Inkubation mit Blocking Reagenz in der optimalen Konzentration verdünnt. Nicht gebundene Antikörper wurden durch Waschen (3 x 10 min) mit TBS-Puffer von der Membran entfernt. Die Membran wurde für eine Stunde bei Raumtemperatur mit dem zweiten an Alkalische Phosphatase gebundenen Antikörper beschickt und danach in TBS/1 % TWEEN und in Detektionspuffer je 2 x 10 min gewaschen.

Die Farbreaktion erfolgte mit NBT/BCIP Stock Solution (AppliChem, Darmstadt Nr. 298 83 9) in 100 mM TRIS-HCl bei einem pH-Wert 9,5 in 100mM NaCl. Bei dieser Färbung dient BCIP als Substrat für die alkalische Phosphatase, das nach der Dephosphorylierung oxidativ in einen Indigofarbstoff überführt wird. Bei dieser Reaktion oxidiert NBT ebenfalls zu einem blauen Farbstoff und wirkt somit farbverstärkend. Die Färbung findet unter Lichtabschluß statt und wird mit Wasser gestoppt.

Tab. 2: Verwendete Antikörper

Primärantikörper Sekundärantikörper

Anti AQN-1 1:1000

(eigene Herstellung) in Blocking-Reagenz

Anti-Rabbit-AP 1:5000 (Dianova, Hamburg) in Blocking- Reagenz

(36)

Material und Methoden

3.2.6 Nachweis von kohlenhydratbindenden Proteinen

Bei diesen Versuchen wurde die Membran nach dem Blockieren über Nacht in Blocking Reagenz Lösung bei 4 °C mit immobilisierten Zuckern (40 µg α-D-Mannose-Biotin/ml Blocking Reagenz), die kovalent an eine Polyacrylamidmatrix gebunden sind, inkubiert. Überschüssige Reagenzien wurden durch 3 x Waschen mit TBS entfernt. Der Nachweis der Bindung der Modellzucker erfolgt über Streptavidin-Alkalische-Phosphatase. Die überschüssige Sekundärsubstanz wird durch 2 x 10 Minuten Waschen mit TBS Puffer/1 % Tween entfernt. Abschließend wird die Membran 2 x 10 Minuten in Detektionspuffer gewaschen.

Die Membran wurde mit NBT/BCIP Stock Solution (Roche Nr. 1681451) gefärbt und getrocknet.

Tab. 3: Verwendete Primär-und Sekundärsubstanzen

Primärsubstanz Sekundärsubstanz

α-Mannose-PAA-Biotin 40µg/ml Blocking Reagenz

(Synthesome/ Lectinity, Bad Homburg)

Streptavidin- Alkalische-Phosphatase 1:5000 in TBS-Puffer

(Dianova, Hamburg, 016030084) α-Galaktose-PAA-Biotin (1-3 Verknüpfung)

20 µg/ml Blocking-Reagenz

(Synthesome/ Lectinity, Bad Homburg)

Streptavidin- Alkalische-Phosphatase 1:5000 in TBS-Puffer

(Dianova, Hamburg, 016030084) β-Galaktose-PAA-Biotin (1-3 Verknüpfung)

20 µg/ml Blocking-Reagenz

(Synthesome/ Lectinity, Bad Homburg)

Streptavidin- Alkalische-Phosphatase 1:5000 in TBS-Puffer

(Dianova, Hamburg, 016030084)

(37)

3.2.7 Chemilumineszenzverfahren

Alternativ wurde bei sehr geringen Proteinmengen das Chemilumineszenzverfahren eingesetzt, das sich durch eine empfindliche Detektion auszeichnet. Durch variable Belichtungszeiten sind unterschiedlich intensive Bilder von einer Membran herstellbar.

Nach der Inkubation mit Primär- und Sekundärantikörper wurden die Membranen in eine Folie mit 4 ml working solution des Chemilumineszenz-Substrates (Super Signal West Pico; Pierce über KMF Laborchemie, St. Augustin-Buisdorf) eingeschweißt und für 60 Sekunden leicht geschwenkt. Die Membran wurde aus der Folie entfernt und in einer mit einer neuen Folie ausgestatteten Röntgenkassette mit Klebestreifen befestigt.

Ein Röntgenfilm (XAR-5, Kodak GmbH, Stuttgart) wurde in einer Dunkelkammer in die Röntgenkassette eingelegt und durch das von der Membran ausgehende Lichtsignal belichtet.

Die Belichtungszeiten variierten zwischen 15 Sekunden und drei Minuten. In einem Entwicklungsbad (G 150, Agfa Deutschland) wurde der Film für 20-40 Sekunden geschwenkt, danach in einem mit Aqua dest. gefüllten Stoppbad für einige Sekunden gewaschen. Die Fixation des Röntgenfilms erfolgte für eine Minute in einem Fixierbad (G 350, Agfa Deutschland). Nach einer fünfminütigen Wässerung wurde der Film hängend getrocknet.

Die Membran kann nach einer Behandlung mit 3 M Kaliumthiocyanatlösung (Merck, Darmstadt) über Nacht („Strippen“) für andere Verfahren eingesetzt werden. Eine weitere Inkubation mit Primär- und Sekundärsubstanzen ist nach erneutem Blockieren durchführbar. Zur Überprüfung des erfolgreichen Ablösens der Zuckerstrukturen wurde nach dem „Strippen“ der Membran eine Leeruntersuchung mit 4 ml working solution durchgeführt. Auf dem verwendeten Röntgenfilm konnten keinerlei Signale erkannt werden.

(38)

Material und Methoden

3.2.8 Auftrennen des Spermienextraktes mittels analytischer HPLC

Um eine Auftrennung der im Spermienextrakt enthaltenen Proteine durchführen zu können, wurde die Probe in einer Verdünnung von 1 : 20 verwendet. Davon wurden 50 µl Probe mit 450µl eines 0,085 %igen Trifluoressigsäure (TFA)-Wassergemisches (Puffer A) verdünnt und über eine analytische C18 –Säule (ET 250/4, Nucleosil 300-5, Macherey-Nagel, Düren, Deutschland), die mit einem reverse phase HPLC-System (Beckman mit LKB 2141 Detektor, Pharmacia, Freiburg) verbunden war, aufgetrennt.

Die Detektion erfolgte bei einer Wellenlänge von 220 nm. Die Durchflußrate betrug 800 µl/min, die Range 1,0 AU. Die Elution wurde mit 90 % Acetonitril +0,085 % TFA in Wasser (Puffer B) bei einem Gradienten von 5-60 % in 120 Minuten durchgeführt.

Das Chromatogramm wurde bei einem Papiervorschub von 2 mm/min erstellt. Die Fraktionen wurden aufgefangen und lyophylisiert.

3.2.9 Massenspektrometrische Analyse

Die mittels reverse phase HPLC isolierten Proteine wurden in der massenspektrometrischen Analyse mit einem matrix-assisted laser desorption/ionization MALDI-II (Kratos Analytical V 5.2), der mit einem Bruker REFLEX time-of flight (TOF) ausgestattet war, untersucht. Die Proteinfraktionen wurden mit α-Cyano-4-hydroxycinnamidsäure in einer Acetonitril/0,1 % TFA- Mischung (70:30, v/v) auf einen Stahlobjektträger gegeben und nach der Sandwich- Methode (KUSSMANN et al. 1997) kokristallisiert. Die Profilerstellung fand im positiven Ionenmodus mit linearer High-Power von 100 - 120 statt. Pro Spektrum wurden 60 - 80 Laserschüsse abgegeben.

(39)

3.3 Durchflusszytometrie

Mit der Durchflusszytometrie können physikalische Eigenschaften von Zellen, wie Größe, Form und Struktur bestimmt werden. Zusätzlich können Zellfunktionen erfaßt werden, die mit Hilfe von marker-gekoppelten Fluoreszenzfarbstoffen dargestellt werden können.

Das verwendete Durchflusszytometer (Galaxy, S 2314, DAKO, Hamburg ) ist mit einem Argonionenlaser und einer UV-Quecksilberlampe ausgestattet, wobei der Laser bei einer Wellenlänge von 488 nm detektiert. Zum Gerät gehört eine Computereinheit mit Software (Mikrosoft Windows 98, FloMax), die eine gezielte Auswertung der Messungen mit Hilfe der Sechsparameterdarstellung (zwei optische und vier Fluoreszenzparameter) ermöglicht.

Zur Messung muß eine Einzelzellsuspension vorliegen. Die Probenflüssigkeit wird durch Überdruck aus dem Probenröhrchen (No./ REF 55484; 3,5 ml; 55 x 12 mm;

Sarstedt, Nürnbrecht) über eine Stahlkapillare in die Quarz-Flowküvette eingeführt.

Um Zellaggregate aufzutrennen, werden die Zellen in der sie umgebenden Trägerflüssigkeit stark beschleunigt und dadurch hintereinander aufgereiht gemessen.

Jede einzelne Zelle passiert so den fokussierten Laserstrahl. Je nach Zellmorphologie (Größe und Granularität) entstehen Lichtbeugungen, die als Streulichtsignale von Lichtdetektoren in bis zu 65.536 Kanälen pro Parameter registriert werden. Das Vorwärtsstreulicht (FSC = forward scatter) verhält sich proportional zur Größe der gemessenen Zellen, während das Seitwärtsstreulicht (SSC = side scatter) Rückschlüsse über die intrazelläre Beschaffenheit (Granularität) sowie über die Oberflächenstruktur (Komplexität) der Zellen zulässt.

Bei der Verwendung von fluorochrommarkierten Partikeln werden diese durch die Intensität des einfallenden Lichtes angeregt (Anregungslicht) und emittieren Photonen einer für jeden Fluorochromfarbstoff typischen Wellenlänge. Die Fluoreszenzsignale werden von für verschiedene Wellenlängen empfindliche Lichtdetektoren ermittelt.

Für die Grünfluoreszenz (FL-1) ist das verwendete Durchflusszytometer genauso mit einem Messbereich ausgestattet wie für Messbereiche im Orange- und

(40)

Material und Methoden

Rotfluoreszenzbereich (FL-2, FL-3). Die Intensität der Fluoreszenz wird logarithmisch verstärkt und auf einer logarithmischen Skala dargestellt.

Durch das Computerprogramm (Mikrosoft Windows 98, FlowMax) wird eine gezielte Auswertung der Messungen durch eine Zweiparameterdarstellung ermöglicht. In einem Punktdiagramm (Dot Blot) wird jeweils ein Punkt eingezeichnet, wenn an einer Intensitätsachse (linear oder logarithmisch), an der beide Parameter gegeneinander aufgetragen werden, sich die ermittelten Werte der Parameter schneiden. Eine weitere Möglichkeit der Darstellung ist das Einparameter-Histogramm bei dem vertikal die Anzahl der Zellen je Kanal aufgetragen werden und horizontal die jeweilige Messgröße aufgetragen wird.

Eine separate Auswertung verschiedener Zellsubpopulationen aus einem Probenansatz ist möglich. In einem Dot Blot können bestimmte Meßfenster definiert (gating) und einzelnd analysiert werden. In den Versuchen sind als Markerfarbstoffe Propidiumjodid (610 nm Bandpass Filter) und Fluoreszenzisothiozyanat (FITC, 520 nm Bandpass Filter) eingesetzt worden.

3.3.1 Etablierung des Messverfahrens

Um die Kohlenhydratbindungsstellen quantifiziert darzustellen, erfolgte zur Etablierung des Messsystems zunächst eine Untersuchung mit α-D-Mannose-PAA- FITC. Zur Wahl der Messeinstellung des Durchflusszytometers wurde zunächst je eine Messung mit Spermatozoen in HBS-Puffer, denen entweder nur Propidiumjodid- Lösung oder nur immobilisierte Zucker (FITC-Konjugat) zugesetzt wurden, durchgeführt. Bei den unter Kapazitationsbedingungen durchgeführten Untersuchungen erfolgte eine zusätzliche Messung der Spermien mit den zu untersuchenden Zuckern in Tyrode-Kapazitationsmedium (HARRISON 1993), um das Gerät für alle nachfolgenden Untersuchungen desselben Tages einzustellen. Während der gesamten Untersuchungsreihe wurden bei einer Messung jeweils 10.000 Zellen (400-600 Spermienzellen pro Sekunde) im Trägermedium ausgewertet.

(41)

Bei jeder Messung betrug das Probenvolumen 1 ml, in das 5 µl Propidiumjodid- Stammlösung als Lebend-Tot-Kontrolle sowie BSA (5 µg/ml) zugesetzt wurden, um unspezifische Bindungen zu verhindern.

3.3.2 Bestimmung der optimalen Inkubationszeit bei der durchflusszytometrischen Untersuchung der Mannose-Bindungsstrukturen

Um die optimale Inkubationszeit für den Nachweis mannosebindender Strukturen auf der Spermienoberfläche festzustellen, wurden kinetische Vorversuche zu verschiedenen Zeitpunkten durchgeführt. In einer Konzentration von 3 µg/ml HBS- Puffer wurden mit α-D-Mannose-PAA-FITC markierte Spermiensuspensionen jeweils nach 1, 3, 5, 7 10 und 15 Minuten durchflusszytometrisch untersucht. Für den weiteren Versuchsablauf wurde nach dieser Untersuchung eine Inkubationszeit von 3 Minuten festgelegt.

3.3.3 Bestimmung der optimalen Zuckerkonzentration bei der durchflusszytometrischen Untersuchung der Mannose-Bindungsstrukturen

In diesem Vorversuch wurde die optimale Zuckerkonzentration bei einem Probenvolumen von 1 ml ermittelt. Jeweils nach einer Zeitspanne von 3 Minuten wurden verschiedene Konzentrationen von 0,5 µg, 1 µg, 2 µg, 5 µg und 8 µg jeweils pro Milliliter Probenvolumen durchflusszytometrisch gemessen. Nach der Untersuchung ergab sich ein Optimum der Fluoreszenz für 2-5 µg des Reagenzes/ml Probenvolumen. Für die weiteren Versuche wurde eine Zuckerkonzentration von 3 µg/ml Trägermedium festgelegt.

(42)

Material und Methoden

3.3.4 Durchflusszytometrische Untersuchung der Veränderungen in der Mannose/Galaktose Bindung unter Kapazitationsbedingungen

Nach dem heutigen Wissensstand ergibt sich die Hypothese, dass sich die Bindungsstellen der Spermatozoen während des Kapazitationsvorganges verändern.

Daher wurden die Spermien in diesem Versuchsabschnitt in ein spezielles Kapazitationsmedium (Tyrode-Medium) überführt und gemessen.

Die Messungen erfolgten 3, 15 und 30 Minuten nach Überführen der Spermatozoen in das Tyrode-Medium. Während der Inkubationszeiten wurden die Probenröhrchen in einem CO2-Brutschrank (Nuaire US Autoflow, Zapf, Langenhagen) bei 39 °C aufbewahrt. Die durchflusszytometrische Bestimmung der mittleren Fluoreszenz der Spermienpopulationen erfolgte unverzüglich nach der Entnahme der inkubierten Spwermiensuspensionen aus dem Brutschrank. Die Inkubation der Spermien wurde mit α-D-Mannose-PAA-FITC, α-Galaktose-PAA-FITC sowie mit β-Galaktose-PAA- FITC durchgeführt. Jeder Zucker wurde zu einer Endkonzentration von 3 µg/ml Tyrode-Medium hinzupipettiert und die mittlere Intensität der Fluoreszenz mit Hilfe der Flow Max Software ermittelt. Als Negativkontrolle wurde bei α-D-Mannose- PAA-FITC eine 0,5 M α-Methylmannopyranosid Lösung eingesetzt. Bei den Galaktosen wurde jeweils eine Kontrolle mit 0,5 M Laktose-Lösung durchgeführt.

Um die proportionale Umverteilung innerhalb der Population lebender Zellen zu beobachten, wurde eine Einteilung in vier Quadranten vorgenommen (Abb. 3).

Quadrant 1 (Q1) beeinhaltet die toten Zellen mit niedriger Fluoreszenz der gebundenen Zucker, während Quadrant 2 (Q2) die toten Spermienzellen repräsentiert, die eine hohe Fluoreszenz aufweisen. Im Quadrant 3 (Q3) werden die lebenden Spermienzellen mit niedriger Fluoreszenz dargestellt. Die hohe Fluoreszenz lebender Zellen zeigt Quadrant 4 (Q4). Die Darstellung der Umverteilung konnte mit dem Einfügen sogenannter „Gatings“ (Messfenster) erreicht werden, wobei die Trennung der Population mit hoher Zuckerbindungskapazität von der Spermienpopulation mit niedriger Fluoreszenz der Zucker erfolgte. Vor der Messung wurde die Trennung

(43)

durch Gatings vorgenommen, festgelegt und während der gesamten durchflusszytometrischen Analyse konstant gehalten.

Abb. 3: Darstellung eines Punktdiagrammes (Dot Blot) der durchflusszytometrischen Analyse

Q1: Tote Zellen mit niedriger Fluoreszenz; Q2: Tote Zellen mit hoher Fluoreszenz Q3: Lebende Zellen mit niedriger Fluoreszenz; Q4: Lebende Zellen mit hoher Fluoreszenz

(44)

Material und Methoden

3.4 Fluoreszenzmikroskopie

Durch fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen sollten mannosebindende Strukturen auf der Oberfläche der Spermatozoen sichtbar gemacht werden. Es wurden wie bei der Durchflusszytometrie Spermatozoen in Tyrode-Medium inkubiert und jeweils 3, 15 und 30 Minuten nach der Inkubation Spermienausstriche angefertigt, die eine Stunde luftgetrocknet wurden. Die Fixation erfolgte mit Paraformaldehydlösung.

Um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren, wurden die Ausstriche mit PBS/10 % BSA in einer feuchten Kammer über Nacht bei 4 °C inkubiert. Danach wurde Mannose-PAA-FITC in 100 µl Portionen auf die Objektträger gegeben. Die Inkubation mit Mannose-PAA-FITC (20 µg/ml in PBS/1 % BSA) in einer feuchten Kammer bei 37 °C wurde 60 Minuten durchgeführt. Zum Waschen wurden die Objektträger 3 x 10 Minuten in PBS geschwenkt. Die Objektträger wurden mit 50 µl Glycerin-PBS-Gemisch (9:1; Mountingpuffer) beschichtet und mit einem Deckgläschen versehen. Bis zur Fluoreszenzmikroskopie wurden die Objektträger unter Lichtabschluss aufbewahrt.

Als Negativkontrolle wurde bei einem Ausstrich vor der Zugabe von Mannose-PAA- FITC eine Lösung von 0,5 M α-Methylmannopyranosid auf einen Objektträger gegeben und unter den oben genannten Bedingungen inkubiert.

(45)

3.5 Explant-Assay

Für den Versuchsabschnitt wurden die Ejakulate von zwei klinisch gesunden, institutseigenen Ebern verwendet. Für die Versuche wurde ausschließlich die spermienreiche Fraktion des Ejakulates eingesetzt.

Am örtlichen Schlachthof wurden am Tag des Versuches zwei Eileiter von verschiedenen Altsauen gewonnen, die in 4 °C gekühlter PBS-Lösung transportiert wurden. Die Eileiter von postpuberalen Sauen wurden ausgewählt, da sie ausgeprägtere Epithelfalten aufweisen und sich dadurch zur Explantgewinnung besser eignen als solche von Jungsauen. Der Zyklusstand der Tiere konnte für diesen Versuchsansatz vernachlässigt werden (GEHLHAAR et al. 2000).

3.5.1 Gewinnung der Explante

Die Eileiter wurden im Labor in eine mit frischer, gekühlter PBS-Pufferlösung vorbereitete Petrischale (Greiner GmbH, Frickenhausen) überführt. Mit Hilfe einer anatomischen Pinzette (TBH GmbH, Langenhagen) und einer Schere mit zwei spitzen Schenkeln (Aesculap, TBH GmbH, Langenhagen) wurde das Eileitergekröse (Mesosalpinx) vom Eileiter (Abb. 4/1) entfernt. Zur weiteren Präparation wurden eine Mikropinzette (Dumont forceps 45°, Fine Science Tools GmbH, Heidelberg) und eine Mikroschere mit zwei spitzen Schenkeln und einer Schnittfläche von drei Millimetern (Mini-Vannas, Fine Science Tools GmbH, Heidelberg) verwendet. Nachdem das Gekröse nahezu vollständig abpräpariert war, konnte der Eileiter mit der Schere longitudinal eröffnet werden. In einer mit Parafin gefüllten Petrischale wurde der Eileiter unter leichtem Zug mit zwei grauen Kanülen (0,7 x 30mm, Luer Lock, Heiland, Hamburg) fixiert und das Epithel mit PBS-Lösung feuchtgehalten. Aus den Epithellängsfalten (Abb. 4/2) des kaudalen Isthmus des Oviduktes wurden nun die Explante (0,5-1mm, Abb. 4/3) unter einem Stereomikroskop (Zeiss 475003, Jena) mit Hilfe der Mikroinstrumente gewonnen. Für den Versuch wurden nur die Explante

(46)

Material und Methoden

verwendet, die sich bei der anschließenden Prüfung mit Hilfe des Inversmikroskopes (IM 35, Zeiss, Jena) durch ihre Größe, einen vorhandenen Epithelsaum sowie gute Zilienbewegung als tauglich erwiesen. Die ausgewählten Explante wurden in kleinen mit TALP-Medium gefüllten Petrischalen (35 x 10 mm, Greiner GmbH, Frickenhausen) bis zum Versuchsbeginn im Kühlschrank gelagert.

Abb. 4: Schematische Darstellung der Explantgewinnung:

1 = Querschnitt durch den Eileiter 2 = Längsschnitt durch den Eileiter

3 = Explant (im Verhältnis etwas vergrößert)

1 2 3

(47)

3.5.2 Koinkubation der Explante mit den Spermatozoen

In einer kleinen Petrischale wurden zwei Explante in 60 µl TALP-Medium im Brutschrank (Nuaire US Autoflow, Zapf, Langenhagen) für fünf Minuten bei 39 °C und fünf Prozent CO2 Begasung äquilibriert. Gleichzeitig wurden auch die in einem Eppendorfgefäß vorverdünnten Spermatozoen und eine Gewebekulturschale mit vier Nocken (35 x10 mm, Greiner GmbH, Frickenhausen) in den Brutschrank verbracht.

Zu diesen Explanten wurde nach Ablauf der fünf Minuten die 10 µl Spermiensuspension (105 Spermien/ml TALP-Medium) hinzugegeben und unter denselben Bedingungen für weitere fünfzehn Minuten koinkubiert. Die Explante wurden nun in einer Gewebekulturschale mit Nocken je 2 x in 60 µl TALP-Medium gewaschen. Ein mit Silikonrahmen (Silicone Stopcock Grease, Dow-Corning, Serva Feinbiochemica, Heidelberg) versehener Objektträger (IDL, Interessengemeinschaft der Laborffachhändler, GmbH + Co KG) wurde mit frischem, vorgewärmten TALP- Medium (60 µl) beschickt und die Explante mit Hilfe der Mikropinzette auf den gewärmten Objektträger aufgegeben und mit einem Deckglas abgedeckt.

3.5.3 Videomikrographie der gebundenen Spermien am Explant

Mit Hilfe des Inversmikroskopes, welches mit einer Videokamera (Kappa, CF 8/1), einem Monitor (WV-BM 1400, Panasonic) und einem Videorecorder (SLV- E 720,VHS, Sony) gekoppelt war, wurde der Versuch dokumentiert. Der Objektträger wurde auf dem Deckglas liegend auf den Mikroskoptisch verbracht und die Explante in ihrer Gesamtheit bei einer 50,4 fachen (6,3 x 8) Vergrößerung gefilmt. Zusätzlich wurden von jedem Explant drei Fragmente (Teilstücke) in der 256 fachen (32 x 8) Vergrößerung aufgenommen. Durch das Drehen der Mikrometerschraube des Inversmikroskopes konnten die gebundenen Spermatozoen in allen Ebenen erfaßt und gezählt werden. Nachdem alle Versuche durchgeführt und aufgezeichnet waren, erfolgte die Auswertung in der 256 fachen Vergrößerung mit Hilfe einer am Monitor befestigten Folie, auf der jedes Spermium mit einem Folienstift markiert wurde.

(48)

Material und Methoden

Um die Größe der gefilmten Explante und Fragmente bestimmen zu können, wurde an jedem Versuchstag eine Skalierung (OT, 0,01mm2, Olympus) in den beschriebenen Vergrößerungen auf der Videokassette festgehalten. Die Flächenausmessung wurde mit Hilfe des computergestützten Flächenmeßprogrammes „ AIDA “ (mika medical GmbH, Bildanalyse Ver. 2.0, Copyright 1992, Rosenheim) durchgeführt. Zu diesem Zweck wurde der Computer (Dell 450/M, Germany) mit einem Monitor (Trinitron, Germany) und dem Videorekorder gekoppelt. Die während des Versuches aufgenommene Skalierung wurde vor Beginn der Berechnungen gespeichert. Durch Umfahren des Explantes bzw. des Fragmentes (im Standbild) mit der Maus des Computers konnte die Fläche der Explante und Fragmente errechnet werden.

3.5.4 Berechnung des Bindungsindexes

Durch die gezählten Spermien und die mit dem Flächenmessprogramm gemessene Größe des Explantes konnte der Bindungsindex mit einem SAS-Computerprogramm ermittelt werden. Definiert ist der Bindungsindex als die mittlere Anzahl der gezählten und am Explant gebundenen Spermien pro 0,01 mm2 Explantfläche (PETRUNKINA et al. 2001)

BIE = (SG1 + SG2 + SG3 ) / (FF1 + FF2 + FF3)

BIE = Bindungsindex der an das Explant gebundenen Spermien

SG1,2,3 = Anzahl der gebundenen Spermien an das Fragment des jeweiligen Explantes FF1,2,3 = Gemessene Fläche des Fragmentes eines Explantes

BI= (BIE1+ BIE2) / 2

BIE1 + BIE2 sind die Bindungsindices des ersten und zweiten Explantes, die gleichzeitig im Versuch verwendet wurden.

(49)

3.5.5 Kompetitive Hemmungsversuche

Bei diesen Versuchen sollte eine mögliche Beteiligung verschiedener Spermadhäsine bei der Interaktion der Spermatozoen mit den Oviduktepithelzellen untersucht werden.

Dazu wurden zu den vorinkubierten Explanten und Spermien Spermadhäsine gegeben, so dass Spermien und Spermadhäsine miteinander um die Strukturen der Oviduktepithelzellen konkurrieren konnten. Die Versuchsbedingungen entsprechen denen in 3.5-3.5.4 beschriebenen. Eine signifikant herabgesetzte Anzahl (p < 0,05) der gebundenen Spermien war ein Hinweis auf die Beteiligung des kompetitiv eingesetzten Spermadhäsins bei der Spermatozoen-Oviduktepithelzellbindung. Als Spermadhäsine wurden vergleichsweise AQN-1 und AWN-2 in verschiedenen Konzentrationen (1,25 µM – 20 µM) eingesetzt.

In einem weiteren Versuch wurden verschiedene Kohlenhydrate eingesetzt und ihre Rolle als Inhibitionssubstanzen untersucht. Bei einer Konzentration von 3 µM wurden 2-Fukosyl-Laktose, 3-Fukosyl-Laktose, Mannopentaose, N-Acetyl-Neuraminyl- Laktose und β-Laktose (Sigma, Aldrich) zu den vorinkubierten Explanten gegeben und in ihrer Fähigkeit, die Spermatozoenbindung an das Eileiterepithel zu beeinflussen, verglichen.

(50)

Ergebnisse

4 Ergebnisse

Durch die Spermadhäsine wird eine Gruppe von Proteinen repräsentiert, die oberflächenassoziiert den Spermatozoen aufliegen. Hinsichtlich ihrer physiologischen Funktion wird den Spermadhäsinen sowohl eine Rolle bei der initialen Bindung der Spermatozoen an die Zona pellucida der Eizelle als auch bei der Etablierung des Spermienreservoirs zugedacht. Verschiedene Spermadhäsine aus dem porcinen Seminalplasma sind proteinbiochemisch charakterisiert, allerdings stehen Untersuchungen im Spermienreservoir des weiblichen Genitaltraktes zur Identifizierung des Rezeptorsystems beim Schwein noch aus. Zu diesem Zweck wurden im Rahmen dieser Arbeit Untersuchungen auf proteinbiochemischer Ebene, durchflusszytometrische und fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen, sowie kompetitive Hemmversuche im Explant-Assay durchgeführt.

4.1 Isolierung der Seminalplasmaproteine

Das Seminalplasma setzt sich aus den Sekreten von Hoden, Nebenhoden und akzessorischen Geschlechtsdrüsen zusammen und weist einen hohen Gehalt unterschiedlicher Proteine auf. Ein Einfluß der Seminalplasmaproteine auf die Spermienfunktion bei der Spermien-Epithelzell-Interaktion bei der Kapazitation sowie als Protektor während der Ejakulation und des Transportes im weiblichen Genital wird diskutiert. Mit einem reverse phase HPLC System konnten 16 Proteinfraktionen aus dem zellfreien Eberseminalplasmapool isoliert werden. Davon sind sechs Fraktionen als Spermadhäsine mittels massenspektrometrischer Untersuchung (Malditof, Kratos Analytical V 5.2) identifiziert worden (Tab. 4). Die Identifizierung erfolgte für die Spermadhäsine PSP-1, PSP-2, AWN-1, AWN-2, AQN-1 sowie AQN-3. Das entsprechende Chromatogramm ist in Abbildung 5 dargestellt. Für die weiteren Untersuchungen wurden die gekennzeichneten Proteinfraktionen aufgefangen, dialysiert und gefriergetrocknet.

(51)

Abb. 5 : Chromatogramm der Spermadhäsine aus porcinem Seminalplasma, aufgetrennt über ein reverse phase HPLC System; Säule: C18 (ET 250/10, Nucleosil 100-7), Durchfluss = 2ml/min; Range = 2 AU; Wellenlänge = 220 nm;

Papier 2mm/min; Gradienten von 25-70 % in 60 Minuten und von 70 – 90 % in 10 Minuten

I = PSP-1, II = AQN-1, III = PSP-2, IV = AQN-3, V = AWN-1, VI = AWN-2

Referenzen

ÄHNLICHE DOKUMENTE

Beteiligung an der Entstehung von Muskelzellhypertrophie 11 Abb.2: Schema von v-fos und c-fos 14 Abb.3: Grundstruktur von c-fos 15 Abb.4: Funktionelle Domäne von Fos 19

Dem Oberflächenepithel schließt sich die drüsenreiche Tunica propria mucosae an: eine schmale Schicht dem Stratum cellulare, dann das Stratum reticulare und das

Pigs fed the high- lysine diet had lower concentrations of free and total carnitine in plasma, liver, kidney and skeletal muscle than control pigs (P, 0·05).. Pigs fed the

(1999) kombinierten diesen Farbstoff mit Propidiumiodid und FITC-markiertem PSA zur Beurteilung der Auswirkungen zweier unterschiedliche Einfrier- und Auftauprotokolle

Jedoch beziehen sich die Referenzen für die porcinen Gene für HSPA1, HSPA1A sowie HSPA2 sämtlich auf Sequenzinformationen zum porcinen HSP70.2 – Gen, so dass nach wie vor

Es gibt nun eine Waisenrente für die Kinder von ermordeten Frauen – bis vor Kurzem wur- de eine solche Rente, wenn der Vater der Täter war und noch lebt, nicht

Im Rahmen der Operation Opson X wurden 15 ausländische Honige aus verschiedenen europäischen Ländern bei der Einfuhr in die Schweiz durch das Bundesamt für Zoll und

kalziumfreies System untersucht (Abb. Der signifikante Anstieg des Anteils Spermatozoen mit induzierter AR nach der Kapazitierung in TALPmEGTA bestätigte die Vermutung, daß