3.2.1 Auftrennen des Seminalplasmas mittels analytischer HPLC
Zur Herstellung eines spermienfreien Seminalplasmas wurde das Gesamtejakulat zentrifugiert und der Überstand abpipettiert. Die Zentrifugation erfolgte bei 160 x g bei 20 °C für 10 Minuten. Nach einer lichtmikroskopischen Kontrolle auf Spermienfreiheit wurde das Seminalplasma lyophilisiert und davon 4 mg mit 1 ml eines 0,0085 %igen Trifuoressigsäure (TFA)-Wassergemisches (Puffer A) verdünnt, und über eine analytische C18-Säule (ET 250/10, Nucleosil 100-7, Macherey-Nagel, Düren, Deutschland), die mit einem reverse phase HPLC-System (Beckman mit LKB 2141 Detektor, Pharmacia, Freiburg) verbunden war, aufgetrennt. Die Detektion erfolgte bei einer Wellenlänge von 220 nm. Die Durchflussrate betrug 2 ml/min, die Range 2,0 AU. Die Elution erfolgte durch 90 % Acetonitril + 0,085 % TFA in Wasser (Puffer B) bei einem Gradienten von 25-70 % in 60 Minuten und von 70-90 % in 10 Minuten. Das Chromatogramm wurde bei einem Papiervorschub von 2 mm/min erstellt. Die Fraktionen wurden aufgefangen und lyophylisiert.
3.2.2 Herstellung von Spermienextrakten
Die Dichte der Spermatozoen wurde auf 107 Spermatozoen/ml HBS-Puffer eingestellt.
Die Extraktion erfolgte durch Extraktionspuffer/1 % Chaps in PBS-Puffer (AppliChem, Darmstadt). Das vorbereitete Gefäß mit Spermien und Puffern wurde 20 Minuten bei 1000 x g zentrifugiert und der Überstand in ein frisches Gefäß abpipettiert.
3.2.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Zu analytischen Zwecken wurde die Elektrophorese in einer Modifikation nach der von LAEMMLI (1970) beschriebenen Methode durchgeführt. Die verwendeten 18 %igen Polyacrylamidgele wurden selbst hergestellt und mit einem 4,5 % igen Sammelgel überschichtet. In diesem Sammelgel wurden je nach Versuchsansatz Kunststoffkämme eingesetzt, durch die eine unterschiedliche Anzahl von Probentaschen im Gel geformt wurden. Die aufgebrachten Spermienextrakte wurden von 2 bis 15 µl mit je 2fach konzentriertem Laemmli-Puffer versetzt, 7 Minuten bei 95 °C erhitzt, 1 Minute auf Eis gestellt und 1 Minute bei 13.000 x rpm zentrifugiert. Je nach Auftragsvolumen der Probe variierten die Taschengrößen des Gels. Zur Ermittlung der relativen Molekulargewichte wurde routinemäßig ein LMW-Standard (Low Molecular Weight Proteinstandard, Bio Rad, 161-0304) verwendet.
Die Elektrophorese wurde in einer Elektrophoresekammer (Bio Rad Mini-Protein II, Bio Rad) durchgeführt. Im oben aufgetragenen Sammelgel erfolgte die Auftrennung der Proteine mit 100 V, im Trenngel wurde die Stromstärke auf 200 V erhöht. Durch das Austreten des blauen Farbstoffes am unteren Gelrand wurde das Ende der Elektrophorese sichtbar. Nach diesem Verfahren konnten die zu analysierenden Proteine auf Membranen übertragen werden oder mit Coomassie Brilliant Blue R (Serva, Heidelberg, 35051) angefärbt werden.
Die Gele wurden nach der Elektrophorese für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit Coomassie Brilliant Blue R (Serva, Heidelberg 35051) 0,25 % ige Färbelösung (40 % Methanol, 10 % Eisessig) angefärbt. Um die überschüssige Hintergrundfarbe zu entfernen, wurde das Gel in einer Entfärbelösung (20 % Methanol, 10 % Eisessig) geschwenkt. Die Entfärbelösung wurde bei diesem Vorgang mehrmals gewechselt.
Zwischen mit Wasser befeuchteten Cellophanblättern (Gel Drying Film, Promega, Madison) wurden die Gele bei Raumtemperatur getrocknet.
Material und Methoden
3.2.4 Western Blot Analyse
Zu den empfindlichsten Nachweismethoden der Proteine nach elektrophoretischer Auftrennung gehören immunologische Verfahren. Zu diesem Zweck werden Proteine aus dem Gel durch ein Blotting-Verfahren auf eine Membran transferiert. Nach der von TOWBIN et al. (1992) beschriebenen Methode wurde der Elektroblot durchgeführt. Die 6 x 8 cm große PVDF Membran (Roche, Nr. 1722026) wurde für eine Minute mit 100 % Methanol durchfeuchtet und danach in Aqua dest. und Blotting-Puffer äquilibriert. In einem Semi-dry-Apparat (Biometra, Göttingen) mit Wasserkühlung wurde ein Blotsandwich, bestehend aus drei Lagen Blotpapier (GB 003, Schleicher & Schuell, Dassel), der Blotmembran, dem Gel und wiederum drei Lagen Blotpapier, angeordnet. Das Blotpapier wurde vorher in Blottingpuffer angefeuchtet, dann wurden die Proteine bei 1 mA/cm2 für zwei Stunden bei Raumtemperatur übertragen.
3.2.5 Spezifischer Proteinnachweis durch Immunfärbung
Die Qualität der Übertragung durch den Blotvorgang wurde durch das Färben der geblotteten Gele in Coomassie Brilliant Blue und durch eine reversible Färbung der geblotteten Membran in Ponceau Rot (5 min bei Raumtemperatur) kontrolliert. Bei erfolgreicher Übertragung wurde die angefärbte Membran mit Aqua dest. entfärbt und über Nacht bei 4 °C in Blocking Reagenz (Roche, Nr. 1096176) inkubiert, um die freien Kapazitäten der Membran abzusättigen und unspezifische Bindungen der verwendeten Antikörper an die Membran zu verhindern. Die darauf folgende Inkubation mit dem ersten Antikörper wurde für eine Stunde bei Raumtemperatur durchgeführt. Alle verwendeten Antikörper wurden vor der Inkubation mit Blocking Reagenz in der optimalen Konzentration verdünnt. Nicht gebundene Antikörper wurden durch Waschen (3 x 10 min) mit TBS-Puffer von der Membran entfernt. Die Membran wurde für eine Stunde bei Raumtemperatur mit dem zweiten an Alkalische Phosphatase gebundenen Antikörper beschickt und danach in TBS/1 % TWEEN und in Detektionspuffer je 2 x 10 min gewaschen.
Die Farbreaktion erfolgte mit NBT/BCIP Stock Solution (AppliChem, Darmstadt Nr. 298 83 9) in 100 mM TRIS-HCl bei einem pH-Wert 9,5 in 100mM NaCl. Bei dieser Färbung dient BCIP als Substrat für die alkalische Phosphatase, das nach der Dephosphorylierung oxidativ in einen Indigofarbstoff überführt wird. Bei dieser Reaktion oxidiert NBT ebenfalls zu einem blauen Farbstoff und wirkt somit farbverstärkend. Die Färbung findet unter Lichtabschluß statt und wird mit Wasser gestoppt.
Material und Methoden
3.2.6 Nachweis von kohlenhydratbindenden Proteinen
Bei diesen Versuchen wurde die Membran nach dem Blockieren über Nacht in Blocking Reagenz Lösung bei 4 °C mit immobilisierten Zuckern (40 µg α-D-Mannose-Biotin/ml Blocking Reagenz), die kovalent an eine Polyacrylamidmatrix gebunden sind, inkubiert. Überschüssige Reagenzien wurden durch 3 x Waschen mit TBS entfernt. Der Nachweis der Bindung der Modellzucker erfolgt über Streptavidin-Alkalische-Phosphatase. Die überschüssige Sekundärsubstanz wird durch 2 x 10 Minuten Waschen mit TBS Puffer/1 % Tween entfernt. Abschließend wird die Membran 2 x 10 Minuten in Detektionspuffer gewaschen.
Die Membran wurde mit NBT/BCIP Stock Solution (Roche Nr. 1681451) gefärbt und getrocknet.
3.2.7 Chemilumineszenzverfahren
Alternativ wurde bei sehr geringen Proteinmengen das Chemilumineszenzverfahren eingesetzt, das sich durch eine empfindliche Detektion auszeichnet. Durch variable Belichtungszeiten sind unterschiedlich intensive Bilder von einer Membran herstellbar.
Nach der Inkubation mit Primär- und Sekundärantikörper wurden die Membranen in eine Folie mit 4 ml working solution des Chemilumineszenz-Substrates (Super Signal West Pico; Pierce über KMF Laborchemie, St. Augustin-Buisdorf) eingeschweißt und für 60 Sekunden leicht geschwenkt. Die Membran wurde aus der Folie entfernt und in einer mit einer neuen Folie ausgestatteten Röntgenkassette mit Klebestreifen befestigt.
Ein Röntgenfilm (XAR-5, Kodak GmbH, Stuttgart) wurde in einer Dunkelkammer in die Röntgenkassette eingelegt und durch das von der Membran ausgehende Lichtsignal belichtet.
Die Belichtungszeiten variierten zwischen 15 Sekunden und drei Minuten. In einem Entwicklungsbad (G 150, Agfa Deutschland) wurde der Film für 20-40 Sekunden geschwenkt, danach in einem mit Aqua dest. gefüllten Stoppbad für einige Sekunden gewaschen. Die Fixation des Röntgenfilms erfolgte für eine Minute in einem Fixierbad (G 350, Agfa Deutschland). Nach einer fünfminütigen Wässerung wurde der Film hängend getrocknet.
Die Membran kann nach einer Behandlung mit 3 M Kaliumthiocyanatlösung (Merck, Darmstadt) über Nacht („Strippen“) für andere Verfahren eingesetzt werden. Eine weitere Inkubation mit Primär- und Sekundärsubstanzen ist nach erneutem Blockieren durchführbar. Zur Überprüfung des erfolgreichen Ablösens der Zuckerstrukturen wurde nach dem „Strippen“ der Membran eine Leeruntersuchung mit 4 ml working solution durchgeführt. Auf dem verwendeten Röntgenfilm konnten keinerlei Signale erkannt werden.
Material und Methoden
3.2.8 Auftrennen des Spermienextraktes mittels analytischer HPLC
Um eine Auftrennung der im Spermienextrakt enthaltenen Proteine durchführen zu können, wurde die Probe in einer Verdünnung von 1 : 20 verwendet. Davon wurden 50 µl Probe mit 450µl eines 0,085 %igen Trifluoressigsäure (TFA)-Wassergemisches (Puffer A) verdünnt und über eine analytische C18 –Säule (ET 250/4, Nucleosil 300-5, Macherey-Nagel, Düren, Deutschland), die mit einem reverse phase HPLC-System (Beckman mit LKB 2141 Detektor, Pharmacia, Freiburg) verbunden war, aufgetrennt.
Die Detektion erfolgte bei einer Wellenlänge von 220 nm. Die Durchflußrate betrug 800 µl/min, die Range 1,0 AU. Die Elution wurde mit 90 % Acetonitril +0,085 % TFA in Wasser (Puffer B) bei einem Gradienten von 5-60 % in 120 Minuten durchgeführt.
Das Chromatogramm wurde bei einem Papiervorschub von 2 mm/min erstellt. Die Fraktionen wurden aufgefangen und lyophylisiert.
3.2.9 Massenspektrometrische Analyse
Die mittels reverse phase HPLC isolierten Proteine wurden in der massenspektrometrischen Analyse mit einem matrix-assisted laser desorption/ionization MALDI-II (Kratos Analytical V 5.2), der mit einem Bruker REFLEX time-of flight (TOF) ausgestattet war, untersucht. Die Proteinfraktionen wurden mit α-Cyano-4-hydroxycinnamidsäure in einer Acetonitril/0,1 % TFA-Mischung (70:30, v/v) auf einen Stahlobjektträger gegeben und nach der Sandwich-Methode (KUSSMANN et al. 1997) kokristallisiert. Die Profilerstellung fand im positiven Ionenmodus mit linearer High-Power von 100 - 120 statt. Pro Spektrum wurden 60 - 80 Laserschüsse abgegeben.