3 Untersuchungsgut, Material und Methoden
Tab 28: Gradeinteilung der subjektiv beurteilten Farbintensität von immunzytologisch gefärbten Primärtumoren, Organmetastasen und Körperhöhlenergüssen
3.5 Statistische Auswertung
4.1.1 Ermittlung der optimalen Primärantikörper-Arbeitsverdünnung
Basierend auf den Kriterien deutliche Anfärbbarkeit der Zellen und möglichst geringste Hintergrundfärbung konnte für die Breitspektrumantizytokeratine KL1 und AE1/AE3 die Verdünnung 1:5 bzw. 1:100 als optimale Antikörperverdünnung ermittelt werden (Tab. 29 und Tab. 30).
Tab. 29: Beurteilung der spezifischen Anfärbbarkeit der Zellen und der Hintergrundfärbung in zwei Testpräparaten (Mundhöhlenschleimhaut, Plattenepithelkarzinom) nach immunzytologischer Färbung mit dem Antikörper KL1 in verschiedenen Verdünnungsstufen.
KL1 unverdünnt 1:5 1:10 1:20 1:50
spezifische
Anfärbbarkeit +++, +++ +++, +++ ++, +++ ++; +++ +, ++
unspezifische
Hintergrundfärbung +, - -, - -, - -, - -, -
- = negativ, + = geringgradige Farbintensität; ++ = mittelgradige Farbintensität, +++ = hochgradige Farbintensität
Tab. 30: Beurteilung der spezifischen Anfärbbarkeit der Zellen und der unspezifischen Hintergrundfärbung in zwei Testpräparaten (Mundhöhlenschleimhaut, Plattenepithelkarzinom) nach immunzytologischer Färbung Streptavidin-Biotin-Komplex (SABC)-Verstärkung) mit dem Antikörper AE1/AE3 in verschiedenen Verdünnungsstufen.
AE1/AE3 1:25 1:50 1:100 1:200 1:400 spezifische
Anfärbbarkeit +++, +++ +++, +++ +++, +++ ++, +++ +, ++
unspezifische
Hintergrundfärbung -, + -, - -, - -, - -, -
- = negativ, + = geringgradige Farbintensität; ++ = mittelgradige Farbintensität, +++ = hochgradige Farbintensität
Für die spezifischen Antikörper gegen CK7, CK8 und CK18 konnte eine optimale Arbeitsverdünnung von 1:20 ermittelt werden (Tab. 31 - 33).
Tab. 31: Beurteilung der spezifischen Anfärbbarkeit der Zellen und der unspezifischen Hintergrundfärbung in zwei Testpräparaten (Hyperplasie Mamma, Gallengangkarzinom) nach immunzytologischer Färbung (Streptavidin-Biotin-Komplex (SABC)-Verstärkung) mit dem Antikörper Zytokeratin 7 (CK7) in verschiedenen Verdünnungsstufen.
CK7 1:5 1:10 1:20 1:50 1:100
spezifische
Anfärbbarkeit +++, +++ +++, +++ +++, +++ ++, ++ +, ++
unspezifische
Hintergrundfärbung +, + +, - -, - -, - -, -
- = negativ, + = geringgradige Farbintensität; ++ = mittelgradige Farbintensität, +++ = hochgradige Farbintensität
Tab. 32: Beurteilung der spezifischen Anfärbbarkeit der Zellen und der unspezifischen Hintergrundfärbung in zwei Testpräparaten (Hyperplasie Mamma, Lungenkarzinom) nach immunzytologischer Färbung (Streptavidin-Biotin-Komplex (SABC)-Verstärkung) mit dem Antikörper Zytokeratin 8 (CK8) in verschiedenen Verdünnungsstufen.
CK8 1:5 1:10 1:20 1:50 1:100
spezifische
Anfärbbarkeit +++, +++ +++, +++ +++, +++ ++, +++ +, + unspezifische
Hintergrundfärbung ++, + +, + -, - -, - -, -
- = negativ, + = geringgradige Farbintensität; ++ = mittelgradige Farbintensität, +++ = hochgradige Farbintensität
Tab. 33: Beurteilung der spezifischen Anfärbbarkeit der Zellen und der unspezifischen Hintergrundfärbung in zwei Testpräparaten (Hyperplasie Mamma, Lungenkarzinom) nach immunzytologischer Färbung (Streptavidin-Biotin-Komplex (SABC)-Verstärkung) mit dem Antikörper Zytokeratin 18 (CK18) in verschiedenen Verdünnungsstufen.
CK18 1:5 1:10 1:20 1:50 1:100
spezifische
Anfärbbarkeit +++, +++ +++, +++ +++, +++ ++, ++ +, ++
unspezifische
Hintergrundfärbung ++, + -, + -, - -, - -, -
- = negativ, + = geringgradige Farbintensität; ++ = mittelgradige Farbintensität, +++ = hochgradige Farbintensität
Hinsichtlich der angewendeten Beurteilungskriterien zeigten auch die spezifischen Antikörper CK14 und CK20 optimale immunzytologische Färbeergebnisse bei einer Verdünnung von 1:20 (Tab. 34 und 35).
Tab. 34: Beurteilung der spezifischen Anfärbbarkeit der Zellen und der unspezifischen Hintergrundfärbung in zwei Testpräparaten (Mundhöhlenschleimhaut, Basalzellkarzinom) nach immunzytologischer Färbung (Streptavidin-Biotin-Komplex (SABC)-Verstärkung) mit dem Antikörper Zytokerati 14 (CK14) in verschiedenen Verdünnungsstufen.
CK14 1:5 1:10 1:20 1:50 1:100
spezifische
Anfärbbarkeit +++, +++ +++, +++ +++, +++ ++, + +, +
unspezifische
Hintergrundfärbung ++, + +, - -, - -, - -, -
- = negativ, + = geringgradige Farbintensität; ++ = mittelgradige Farbintensität, +++ = hochgradige Farbintensität
Tab. 35: Beurteilung der spezifischen Anfärbbarkeit der Zellen und der unspezifischen Hintergrundfärbung in zwei Testpräparaten (Darmschleimhaut, Dünndarmkarzinom) nach immunzytologischer Färbung (Streptavidin-Biotin-Komplex (SABC)-Verstärkung) mit dem Antikörper Zytokeratin 20 (CK20) in verschiedenen Verdünnungsstufen.
CK20 1:5 1:10 1:20 1:50 1:100
spezifische
Anfärbbarkeit +++, +++ +++, +++ +++, +++ ++, +++ +, ++
unspezifische
Hintergrundfärbung ++, ++ +, - -, - -, - -, -
- = negativ, + = geringgradige Farbintensität; ++ = mittelgradige Farbintensität, +++ = hochgradige Farbintensität
Die Antikörper gegen die Proteine der Intermediärfilamente Vimentin und Desmin zeigten die besten spezifischen Anfärbungen der Zellen bei geringster Hintergrundfärbung bei einer Verdünnung von 1:400 bzw. 1:100 (Tab. 36 und Tab.
37).
Tab. 36: Beurteilung der spezifischen Anfärbbarkeit der Zellen und der unspezifischen Hintergrundfärbung in zwei Testpräparaten (Fibrom, Osteosarkom) nach immunzytologischer Färbung (Streptavidin-Biotin-Komplex (SABC)-Verstärkung) mit dem Antikörper Vimentin in verschiedenen Verdünnungsstufen.
Vimentin 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 spezifische
Anfärbbarkeit +++, +++ +++, +++ +++, +++ ++, +++ +, + unspezifische
Hintergrundfärbung ++, ++ ++, ++ -, - -, - -, -
- = negativ, + = geringgradige Farbintensität; ++ = mittelgradige Farbintensität, +++ = hochgradige Farbintensität
Tab. 37: Beurteilung der spezifischen Anfärbbarkeit der Zellen und der unspezifischen Hintergrundfärbung in zwei Testpräparaten (Rhabdomyosarkom, Leiomyosarkom) nach immunzytologischer Färbung (Streptavidin-Biotin-Komplex (SABC)-Verstärkung) mit dem Antikörper Desmin in verschiedenen Verdünnungsstufen.
Desmin 1:25 1:50 1:100 1:200 1:400
spezifische
Anfärbbarkeit +++, +++ +++, +++ +++, +++ ++, ++ +, ++
unspezifische
Hintergrundfärbung +++, ++ ++, ++ -, - -, - -, -
- = negativ, + = geringgradige Farbintensität; ++ = mittelgradige Farbintensität, +++ = hochgradige Farbintensität
Die Marker für die Melanomdiagnostik Melan-A und S100 zeigten bei einer Verdünnung von 1:25 bzw. 1:400 eine spezifische Anfärbung der Zellen ohne Hintergrundfärbung (Tab. 38 und 39).
Tab. 38: Beurteilung der spezifischen Anfärbbarkeit der Zellen und der unspezifischen Hintergrundfärbung in zwei Testpräparaten (benignes Melanom, malignes Melanom) nach immunzytologischer Färbung (Avidin-Biotin-Komplex (ABC)-Verstärkung) mit dem Antikörper Melan-A in verschiedenen Verdünnungsstufen.
Melan-A 1:5 1:10 1:25 1:50 1:100
spezifische
Anfärbbarkeit +++, +++ +++, +++ +++, +++ ++, ++ +, ++
unspezifische
Hintergrundfärbung ++, + +, - -, - -, - -, -
- = negativ, + = geringgradige Farbintensität; ++ = mittelgradige Farbintensität, +++ = hochgradige Farbintensität
Tab. 39: Beurteilung der spezifischen Anfärbbarkeit der Zellen und der unspezifischen Hintergrundfärbung in den Testpräparaten (benignes Melanom, malignes Melanom) nach immunzytologischer Färbung (Avidin-Biotin-Komplex (ABC)-Verstärkung) mit dem Antikörper S100 in verschiedenen Verdünnungsstufen.
S100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 spezifische
Anfärbbarkeit +++, +++ +++, +++ ++, +++ ++, + -, +
unspezifische
Hintergrundfärbung +, ++ -, - -, - -, - -, -
- = negativ, + = geringgradige Farbintensität; ++ = mittelgradige Farbintensität, +++ = hochgradige Farbintensität
Für die beiden polyklonalen Antikörper gegen den vWF und Lysozym konnten eine optimale Arbeitsverdünnung von 1:200 ermittelt werden (Tab. 40 und 41).
Tab. 40: Beurteilung der spezifischen Anfärbbarkeit der Zellen und der unspezifischen Hintergrundfärbung in zwei Testpräparaten (Hämangiom, Hämangiosarkom) nach immunzytologischer Färbung (Streptavidin-Biotin-Komplex (SABC)-Verstärkung) mit dem Antikörper von Willebrand-Faktor (vWF) in verschiedenen Verdünnungsstufen.
vWF 1:50 1:100 1:200 1:400 1:800
spezifische
Anfärbbarkeit +++, +++ +++, +++ +++, +++ ++, +++ -, + unspezifische
Hintergrundfärbung ++, +++ +, ++ -, - -, - -, -
- = negativ, + = geringgradige Farbintensität; ++ = mittelgradige Farbintensität, +++ = hochgradige Farbintensität
Tab. 41: Beurteilung der spezifischen Anfärbbarkeit der Zellen und der unspezifischen Hintergrundfärbung in zwei Testpräparaten (Histiozytom, maligne Histiozytose) nach immunzytologischer Färbung (Streptavidin-Biotin-Komplex (SABC)-Verstärkung) mit dem Antikörper Lysozym in verschiedenen Verdünnungsstufen.
Lysozym 1:50 1:100 1:200 1:400 1:800 spezifische
Anfärbbarkeit +++, +++ +++, +++ +++, +++ ++, +++ +, + unspezifische
Hintergrundfärbung ++, +++ ++, ++ -, - -, - -, -
- = negativ, + = geringgradige Farbintensität; ++ = mittelgradige Farbintensität, +++ = hochgradige Farbintensität
4.1.2 Einfluss der Verstärkung mittels des Streptavidin-Biotin-Peroxidase-Komplexes auf die Färbung mit dem Breitspektrumantizytokeratin KL1
4.1.2.1 Normalgewebe und benigne epitheliale Tumoren
Der Vergleich der immunzytologischen Reaktivität von KL1 in einer Arbeitsverdünnung von 1:5 in epithelialen Normalgeweben und benignen Tumoren ohne und mit Verstärkung durch Streptavidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (SABC) zeigte keine deutlichen Unterschiede in der Reaktivität zwischen beiden Färbemethoden in den verschiedenen Gewebe (Tab. 42). Bei einem statistischen Vergleich der zusammengefassten Ergebnisse konnte kein signifikanter Unterschied in der Farbintensität und im Anteil der positiven Zellen festgestellt werden (p=1,0Wilcoxon-Test).
Tab. 42: Vergleichende Darstellung der immunzytologischen Ergebnisse nach Färbung mit dem Breitspektrumantizytokeratin KL1 (Verdünnung 1:5) ohne und mit Streptavidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (SABC)-Verstärkung in zwei Normalgeweben und sechs benignen Tumoren epithelialen Ursprungs des Hundes
ohne Verstärkung
(A)1) mit Verstärkung
(B)1)