3 Material und Methoden
4.2 Ergebnisse des Hauptversuches .1 Motilität der Spermien
4.2.1.1 Vorwärtsbeweglichkeit
Die Varianzanalyse (ANOVA) zeigte signifikante Unterschiede bezüglich der Faktoren Einfrierhäufigkeit und Hengstgruppe (p≤0,05). Der Mittelwertsvergleich des prozentualen Anteils vorwärtsmotiler Spermien hinsichtlich der Effekte multipler Einfrier- und Auftauzyklen und Hengstgruppen ist in Abbildung 12 dargestellt.
Der prozentuale Anteil vorwärtsmotiler Samenzellen war bei allen Einfrierzyklen signifikant niedriger als bei den flüssigkonservierten Spermaproben vor dem Einfrieren (p≤0,05). Alle Einfrierzyklen unterschieden sich signifikant untereinander (p≤0,05). Die Unterschiede waren von den flüssigkonservierten Spermaproben (88,3
± 4,1%) zum ersten TG achtzehn Prozent (70,5 ± 5,9%), vom ersten zum zweiten TG vierzig Prozent (30,9 ± 16,8%) und vom zweiten zum dritten TG sechsundzwanzig Prozent (4,9 ± 3,9%).
Bei den flüssigkonservierten Spermaproben und nach dem ersten Einfrier- und Auftauzyklus hatten die Spermatozoen der Hengstgruppe mit empirisch guter Tiefgefriereignung signifikant höhere Vorwärtsmotilitäten als die Spermien der Hengste mit empirisch schlechter Tiefgefriereignung (p≤0,05)
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Abb. 12: Mittelwertsvergleiche (Mittelwerte ± SD) der Vorwärtsmotilität der Spermien nach dem Auftauen unter Berücksichtigung der Anzahl Einfrier- und Auftauzyklen bei Hengsten mit guten und schlechten Tiefgefriereigenschaften des Spermas
Gruppe Gesamt: n = 10 Hengste, m=3 Ejakulate pro Hengst
Gruppe A: n = 5 Hengste mit guter Eignung zur Samentiefgefrierung Gruppe B: n = 5 Hengste mit schlechter Eignung zur Samentiefgefrierung Frisch= flüssigkonservierte Spermaprobe
1.TG= ein Einfrier- und Auftauzyklus 2.TG= zwei Einfrier- und Auftauzyklen 3.TG= drei Einfrier- und Auftauzyklen
a, b, c, d
Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich signifikant (p≤0,05)
# signifikanter Unterschied zwischen Gruppe A und B (p≤0,05)
4.2.1.2 Lineare Geschwindigkeit (VSL)
Die Varianzanalyse (ANOVA) zeigte einen signifikanten Einfluss der Faktoren Einfrierhäufigkeit und Hengstgruppe (p≤0,05). Der Mittelwertsvergleich der linearen Geschwindigkeit der Spermien hinsichtlich der Effekte multipler Einfrier- und Auftauzyklen und Gruppen ist in Abbildung 13 dargestellt. Die linearen Geschwindigkeiten der Samenzellen der flüssigkonservierten Spermaproben nach dem ersten Einfrier- und Auftauzyklus und dem zweiten Einfrier- und Auftauzyklus
waren dreiundvierzig Prozent höher als nach dem dritten Einfrier- und Auftauzyklus (p≤0,05). Bei allen Proben der verschiedenen Einfrier- und Auftauzyklen besteht kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Hengstgruppen (p>0,05).
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Abb. 13: Mittelwertsvergleiche (Mittelwerte ± SD) der linearen Geschwindigkeit (Velocity Straight Line = VSL) der Spermien nach dem Auftauen unter Berücksichtigung der Anzahl Einfrier- und Auftauzyklen bei Hengsten mit guten und schlechten Tiefgefriereigenschaften des Spermas.
Gruppe Gesamt: n = 10 Hengste, m=3 Ejakulate pro Hengst
Gruppe A: n = 5 Hengste mit guter Eignung zur Samentiefgefrierung Gruppe B: n = 5 Hengste mit schlechter Eignung zur Samentiefgefrierung Frisch= flüssigkonservierte Spermaprobe
1.TG= ein Einfrier- und Auftauzyklus 2.TG= zwei Einfrier- und Auftauzyklen 3.TG= drei Einfrier- und Auftauzyklen
a, b Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich signifikant (p≤0,05)
# signifikanter Unterschied zwischen Gruppe A und B (p≤0,05)
4.2.1.3 Mittlere Geschwindigkeit (VAP)
Die Varianzanalyse (ANOVA) zeigte einen signifikanten Einfluss der Faktoren Einfrierhäufigkeit und Hengstgruppe (p≤0,05). Der Mittelwertsvergleich der mittleren Geschwindigkeit der Spermien hinsichtlich der Effekte multipler Einfrier- und
Auftauzyklen und Gruppen ist in Abbildung 14 dargestellt. Die mittleren Geschwindigkeiten der Samenzellen der flüssigkonservierten Spermaproben, des ersten Einfrier- und Auftauzyklus und des zweiten Einfrier- und Auftauzyklus waren signifikant höher als die des dritten Einfrier- und Auftauzyklus (p≤0,05) Der Unterschied betrug fünfundvierzig Prozent. Bei allen Einfrier- und Auftauzyklen besteht hinsichtlich der mittleren Geschwindigkeiten kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Hengstgruppen (p>0,05).
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Abb. 14: Mittelwertsvergleiche (Mittelwerte ± SD) der mittleren Geschwindigkeit (Velocity Average Path = VAP) der Spermien nach dem Auftauen unter Berücksichtigung der Anzahl Einfrier- und Auftauzyklen bei Hengsten mit guten und schlechten Tiefgefriereigenschaften des Spermas.
Gruppe Gesamt: n = 10 Hengste, m=3 Ejakulate pro Hengst
Gruppe A: n = 5 Hengste mit guter Eignung zur Samentiefgefrierung Gruppe B: n = 5 Hengste mit schlechter Eignung zur Samentiefgefrierung Frisch= flüssigkonservierte Spermaprobe
1.TG= ein Einfrier- und Auftauzyklus 2.TG= zwei Einfrier- und Auftauzyklen 3.TG= drei Einfrier- und Auftauzyklen
a, b,
Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich signifikant (p≤0,05)
# signifikanter Unterschied zwischen Gruppe A und B (p≤0,05)
4.2.2 Membranintegrität der Spermien
4.2.2.1 Anteil membranintakter Spermien nach FITC-PNA/ SYTO® 17 / PI – Färbung Die Varianzanalyse (ANOVA) zeigte einen signifikanten Einfluss der Faktoren Einfrierhäufigkeit und Hengstgruppe (p≤0,05). Abbildung 15 zeigt den Mittelwertsvergleich des prozentualen Anteils membranintakter und somit vitaler Spermien hinsichtlich der Effekte multipler Einfrier- und Auftauzyklen und Gruppen.
Die Proben der Hengste mit empirisch guter Tiefgefriereignung zeigten nach einmaligem Einfrieren einen acht Prozent höheren Anteil membranintakter und somit vitaler Samenzellen als die Gruppe der Hengste mit empirisch schlechter Tiefgefriereignung (p≤0,05).
Die Samenzellen der jeweiligen Einfrier- und Auftauzyklen zeigten untereinander jeweils signifikante Unterschiede hinsichtlich des prozentualen Anteils membranintakter Spermien (p≤0,05). Die Unterschiede waren vom flüssigkonservierten Samen (61,4 ± 13,8) zum ersten TG achtundzwanzig Prozent (33,5 ± 7,6%), vom ersten zum zweiten TG neunzehn Prozent (14,9 ± 6,4%) und vom zweiten zum dritten TG sechs Prozent (8,3.± 3,2%).
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Abb. 15: Mittelwertsvergleiche (Mittelwerte ± SD) des Anteils vitaler Spermien nach dem Auftauen unter Berücksichtigung der Anzahl Einfrier- und Auftauzyklen bei Hengsten mit guten und schlechten
Tiefgefriereigenschaften des Spermas nach FITC-PNA / SYTO® 17 / PI- Färbung.
Gruppe A: n = 5 Hengste mit guter Eignung zur Samentiefgefrierung Gruppe B: n = 5 Hengste mit schlechter Eignung zur Samentiefgefrierung Frisch= flüssigkonservierte Spermaprobe
1.TG= ein Einfrier- und Auftauzyklus 2.TG= zwei Einfrier- und Auftauzyklen 3.TG= drei Einfrier- und Auftauzyklen
a, b, c, d
Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich signifikant (p≤0,05)
# signifikanter Unterschied zwischen Gruppe A und B (p≤0,05)
4.2.2.2 Akrosomaler Status der Spermien
Die Varianzanalyse (ANOVA) zeigte einen signifikanten Einfluss der Faktoren Einfrierhäufigkeit und Hengstgruppe (p≤0,05).
Der Mittelwertsvergleich des Anteils akrosomgefärbter Spermien nach FITC-PNA / SYTO® 17 / PI-Färbung hinsichtlich der Effekte multipler Einfrier- und Auftauzyklen und Gruppen ist in Abbildung 16 dargestellt.
Bezüglich des akrosomalen Status war bei dieser Färbung ein Unterschied der Samenproben zwischen den beiden Hengstgruppen nach dem dritten Einfrier- und Auftauzyklus von vier Prozent feststellbar (p≤0,05).
Die akrosomengefärbten Spermien nahmen im Vergleich zu den flüssigkonservierten Spermaproben nach dem folgenden Einfrier- und Auftauzyklus signifikant zu (p≤0,05). Die Unterschiede betrugen von den flüssigkonservierten Spermaproben zum ersten TG sieben Prozent, vom ersten TG zum zweiten TG fünf Prozent und vom zweiten zum dritten TG fünf Prozent.
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Abb. 16: Mittelwertsvergleiche (Mittelwerte ± SD) des Anteils akrosomgefärbter Spermien nach dem Auftauen unter Berücksichtigung der Anzahl Einfrier- und Auftauzyklen bei Hengsten mit guten und schlechten Tiefgefriereigenschaften des Spermas nach FITC-PNA / SYTO® 17 / PI- Färbung.
Gruppe Gesamt: n = 10 Hengste, m=3 Ejakulate pro Hengst
Gruppe A: n = 5 Hengste mit guter Eignung zur Samentiefgefrierung Gruppe B: n = 5 Hengste mit schlechter Eignung zur Samentiefgefrierung Frisch= flüssigkonservierte Spermaprobe
1.TG= ein Einfrier- und Auftauzyklus 2.TG= zwei Einfrier- und Auftauzyklen 3.TG= drei Einfrier- und Auftauzyklen
a, b, c, d
Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich signifikant (p≤0,05)
# signifikanter Unterschied zwischen Gruppe A und B (p≤0,05)
4.2.3 Spermienchromatinstruktur
Die Varianzanalyse (ANOVA) zeigte einen signifikanten Einfluss der Faktoren Einfrierhäufigkeit und Hengstgruppe (p≤0,05). Der Mittelwertsvergleich des prozentualen Anteils an DFI-Spermien nach SCSA™-Färbung hinsichtlich der Effekte multipler Einfrier- und Auftauzyklen und Gruppen ist in Abbildung 17 dargestellt.
Bei allen Einfrierzyklen war kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Hengstgruppen feststellbar, wobei die Hengste mit empirisch guter Tiefgefriereignung einen niedrigeren Anteil an DFI-Spermien aufwiesen als die Hengste mit empirisch schlechter Tiefgefriereignung. Das Nativsperma wies in der SCSA™-Färbung einen signifikant niedrigeren Prozentsatz an DFI-Spermien auf als alle anderen Proben nach einmaliger- und mehrmaliger Kryokonservierung (p≤0,05), der Unterschied betrug sechs Prozent.
Der Anteil an DFI-Spermien unterschied sich nach dem ersten, dem zweiten und dem dritten Einfrier- und Auftauzyklus nicht signifikant untereinander (p>0,05).
0 5 10 15 20 25 30
Frisch 1. TG 2. TG 3. TG
Einfrierhäufigkeit
DFI [%] Gesamt
Gruppe A Gruppe B a
b b b
Abb. 17: Mittelwertsvergleiche (Mittelwerte ± SD) des Anteils der Spermien mit hohem DNA-Fragmentationsindex (DFI-Spermien) nach dem Auftauen unter Berücksichtigung der Anzahl Einfrier- und Auftauzyklen bei Hengsten mit guten und schlechten Tiefgefriereigenschaften des Spermas nach SCSA™-Färbung.
Gruppe Gesamt: n = 10 Hengste, m=3 Ejakulate pro Hengst
Gruppe A: n = 5 Hengste mit guter Eignung zur Samentiefgefrierung Gruppe B: n = 5 Hengste mit schlechter Eignung zur Samentiefgefrierung Frisch= flüssigkonservierte Spermaprobe
1.TG= ein Einfrier- und Auftauzyklus 2.TG= zwei Einfrier- und Auftauzyklen 3.TG= drei Einfrier- und Auftauzyklen
a, b Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich signifikant (p≤0,05)
# signifikanter Unterschied zwischen Gruppe A und B (p≤0,05)