3 Material und Methoden
5.6 Einfluss der Verdünner
Um den Einfluss des Verdünners auf die Vitalität, Chromatinintegrität und Fertilität equiner Spermatozoen nach multiplen Auftauzyklen zu untersuchen, wurden im zweiten und dritten Einfrierzyklus zwei verschiede Verdünner eingesetzt. Neben dem französischen Verdünner INRA-82 mit 2% Eidotter wurde ein Merck-Laktose-Verdünner mit 20% Eidotter verwendet. Beide Merck-Laktose-Verdünner wurden auf einen Glycerolgehalt von 2,5% in der Endverdünnung eingestellt.
Hinsichtlich der Vorwärtsbeweglichkeit, der Membranintegrität und des Akrosomstatus der Spermien zeigten sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Verdünnern (p>0,05). Die optimale Glycerolkonzentration in einem auf Milch basierenden Verdünner ist im Hinblick auf die Motilität der Spermien schwer zu bestimmen, kann aber nach VIDAMENT et al. (2001) bei 2,4% bis 2,8% angesiedelt werden. Zufriedenstellende Ergebnisse nach der Besamung mit kryokonserviertem Samen erzielten VIDAMENT et al. (1998b) mit einer Konzentration von 2,5%
Glycerol im INRA-82 Verdünner mit 2% Eidotter.
Die signifikant höheren linearen und mittleren Geschwindigkeiten der Spermatozoen bei dem auf Milch basierenden INRA-82 Verdünner (p≤0,05) sind vermutlich auf eine niedrigere Viskosität aufgrund des geringeren Eidotteranteils zurückzuführen.
Auffällig sind die signifikant niedrigeren DFI-Werte nach dem zweiten und dritten Tiefgefrierzyklus mit Merck-Laktose Verdünner mit 20% Eidotter. Das könnte auf die protektive Wirkung des Eidotters auf die Spermien zurückzuführen sein. Die Ergebnisse aus der Publikation von KARABINUS et al. (1991) bestätigten ebenfalls ein geringeres Vorkommen von DNA-instabilen Spermatozon unter Verwendung eines eidotterhaltigen Verdünners im Vergleich zur Verwendung eine Magermilch-Verdünners.
Schlussbetrachtung
In den Vorversuchen zeigten sich Einflüsse der technologischen Parameter Abfüllfraktion und Positionierung der Pailletten in der Gefrierkammer im Rahmen der Kryokonservierung. Die Ergebnisse könnten auf eine zu geringe Durchmischung der Spermiensuspension oder zu schnelles Absinken der immotilen Spermien vor der Abfüllung in Aufbewahrungsröhrchen zurückzuführen sein. Bei der Lagerung der Pailletten im unteren Bereich des automatischen Einfrierautomaten sind statistisch gesehen signifikant höhere Motilitätswerte (V, VAP und VSL) zu erreichen (p≤0,05), dies könnte mit der direkten Lage an der Stickstoffzufuhr zusammenhängen.
Um eine genauere Aussage über die Fertilität mehrfach eingefrorener Spermatozoen zu erhalten, sollte unter Umständen die Zahl der zu besamenden Stuten erhöht werden.
Eine Verbesserung der Motilität, Membranintegrität und des akrosomalen Status der mehrfach tiefgefrorenen Ejakulate könnte durch Spermienselektion mittels Dichtegradientenzentrifugation (PureSperm®) erzielt werden. Eine Überprüfung der Fertilität nach Anwendung dieser Modifikation wäre sinnvoll.
Die erfolgreiche Durchführung multipler Einfrier-Auftauzyklen bietet vielfältige Anwendungsmöglichkeiten in der Pferdezucht. So könnte sie die geschlechtspezifische Trennung X- und Y-chromosomaler Spermatozoen aus bereits kryokonservierten Spermien ermöglichen und nach Aufteilung der Besamungsdosis die Effizienz des Tiefgefrierspermas bei wertvollen, nur im begrenzten Umfang zur Verfügung stehenden Hengsten erhöhen.
Christiane Hagen
Effekte der Aufbereitungstechnik und multipler Einfrier- und Auftauzyklen auf Vitalitätseigenschaften und Chromatinstruktur equiner Spermatozoen
6 Zusammenfassung
In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss technologischer Parameter auf den Tiefgefrierprozess und die Auswirkungen mehrfacher Einfrier- und Auftauzyklen auf die Vitalitätseigenschaften, Chromatinstruktur und Befruchtungskapazität equiner Spermatozoen untersucht.
In den Vorversuchen konnte der Einfluss der Abfüllfraktion und der Positionierung der Pailletten während der automatisierten Kryokonservierung bestimmt werden. Die im unteren Teil der Gefrierkammer gelagerten Proben zeigten 4 % höhere Auftaumotilitäten als die oben gelagerten und die am Anfang des Abfüllvorgangs abgefüllten Pailletten 3 % schlechtere Auftaumotilitäten.
Im Hauptversuch wurden die Auswirkungen multipler Einfrier-Auftauzyklen auf die Motilität, die Plasmamembranintegrität und den Akrosomstatus sowie die Chromatinintegrität untersucht. Zehn Hannoveraner Zuchthengste des Niedersächsischen Landgestüts Celle wurden aufgrund empirisch guter und empirisch schlechter Tiefgefriereignung des Samens in zwei Gruppen aufgeteilt.
Jeweils drei Ejakulate wurden mit Hilfe einer künstlichen Scheide gewonnen, zentrifugiert (10min, 600g), auf eine Konzentration von 400 x 106 Spermien/ml mit dem Verdünner INRA-82 verdünnt und mit einer automatisierten Einfriermaschine (+5°C -> -140°C; 60°/min) eingefroren. Die Endkonze ntration des Glycerols betrug 2,5 %. Im Anschluss an diese routinemäßige Spermatiefgefrierung wurden die TG-Proben aufgetaut, mit INRA-82- oder Merck-Laktose Verdünner auf 40 x 106 Spermien/ml resuspendiert, in 0,5 ml Pailletten abgefüllt und wieder eingefroren. Die Verfahrensschritte wurden wiederholt und die Spermien in einer Konzentration von 20 x 106 Spermien/ml erneut eingefroren. Die Messung und Beurteilung der Motilität,
der Plasmamembranintegrität, des Akrosomenstatus und der Chromatinstruktur der Spermien erfolgte nach dem ersten, zweiten und dritten Einfrier- und Auftauzyklus mit einem computer-assistierten Motionanalyser (MIKA Motion Analyser) und einem Durchflusszytometer (FACScan™).
Die Spermienmotilität und die Spermienmembranintegrität (FITC/PNA-Syto®17/PI-Färbung) reduzierte sich nach dem 1., 2., und 3. Einfrier-Auftauzyklus kontinuierlich (62.3% +/-9.35, 24.0% +/-15.42, 3.3% +/-4.34, p≤0.05; 29.6% +/-8.64, 14.9% +/-6.38, 8.3% +/-3.24, p≤0.05), während der prozentuale Anteil an akrosomreagierten Spermien sich signifikant zwischen den einzelnen Einfrier- und Auftauzyklen erhöhte (19.5% +/-7.59, 23.9% +/-8.51, 29.2% +/-6.58, p≤0.05). Die Integrität der Chromatinstruktur der einmal und mehrfach tiefgefrorenen Spermien zeigte keine signifikanten Abweichungen (18.6% +/-6.6, 17.2% +/-6.84, 17.1% +/-7.21, p>0.05).
Es ergaben sich folgende Unterschiede zwischen dem INRA-82 Verdünner und dem Merck-Laktose Verdünner beim zweiten und dritten Einfrier- und Auftauzyklus. Die linearen und die mittleren Geschwindigkeiten der Spermatozoen waren bei dem INRA-82 Verdünner signifikant höher als beim Merck-Laktose Verdünner (75.12% 13.27, 68.78% 13.38, 37.72% 35.21, 30.12% 31.91, p≤0.05, 77.93% +/-13.66, 71.30% +/-13.69, 39.26% +/-36.62, 31.44% +/-33.32, p≤0.05). Der prozentuale Anteil an DFI-Spermien war signifikant niedriger beim Merck-Laktose Verdünner nach dem zweiten und dem dritten Einfrier- und Auftauzyklus im Vergleich zu dem INRA-82 Verdünner (15.39% 5.96, 19.19% 7.71, p≤0.05; 13.8% +/-7.12, 20.34% +/-7.3, p≤0.05).
Im anschließenden Besamungsversuch wurden Hannoveranerstuten mit Tiefgefrierspermaproben von 2 Hengsten besamt, die aus dem ersten, zweiten oder dritten Einfrier-Auftauzyklus stammten. Die Inseminationsdosis betrug jeweils 200 x 106 Spermatozoen in einem Besamungsvolumen von 10 ml. Die Trächtigkeitsrate nach der ersten Tiefgefrierung betrug 4/10, 40%, nach dem zweiten Einfrier-Auftauzyklus 1/10, 10% und nach dem dritten Einfrierzyklus 0/10, 0%.
Christiane Hagen
Effect of cryopreservation technique and multiple freezing of stallion semen on sperm quality and fertility
7 Summary
In preliminary tests the influence of the filling fraction during sperm packaging, and the position of the straws in the freezing chamber on post-thaw sperm quality was examined. Spermatozoa stored at the bottom of the freezing automate chamber showed a 4 % higher motility and membrane integrity. The viability of the part of the sperm suspension filled first, was 3 % lower.
In Experiment I, 10 Hanoverian Warmblood sires were divided into two groups according to their semen freezability (good and poor freezers). Semen was collected by artificial vagina, centrifuged (10min., 600g), extended in INRA-82 at 400 x 106 spermatozoa/ml and automatically frozen (+5°C → -140°C; 60°C./min). The final glycerol concentration was adjusted to 2.5% in Exp. I. Semen from each stallion was thawed, resuspended in either INRA-82 or Merck-Lactose-Extender at 40 x 106 sperm./ml, filled in 0.5ml straws, and refrozen. These steps were repeated and semen concentration was adjusted to 20 x 106 sperm/ml after a third freezing cycle.
The motility, plasmamembrane-, acrosome- and chromatin integrity of spermatozoa after the first, second and third freeze/thaw cycle were assessed by computer-assisted motility analysis (MIKA Motion Analyser) and flow cytometry (FACScan™).
Motility, and plasmamembrane integrity (FITC/PNA-Syto-PI-stain) decreased stepwise after first, second and third freezing (29.6% +/-8.64, 14.9% +/-6.38, 8.3%
+/-3.24, p≤0.05), whereas the percentage of acrosome-reacted cells increased significantly between each freezing and thawing step (19.5% +/-7.59, 23.9% +/-8.51, 29.2% +/-6.58, p≤0.05). Sperm chromatin integrity did not differ significantly (18.6%
+/-6.6, 17.2% +/-6.84, 17.1% +/-7.21, p>0.05).
Linear (VSL) and mean velocity (VAP) of spermatozoa were significantly higher when using INRA-82 for cryopreservation compared to Merck-Lactose extender (75.12%
13.27, 68.78% 13.38, 37.72% 35.21, 30.12% 31.91, p≤0.05, 77.93% +/-13.66, 71.30% +/-13.69, 39.26% +/-36.62, 31.44% +/-33.32, p≤0.05). The percentage of DFI sperm was significantly lower with Merck-Lactose extender after the second and third freeze/thaw cycle compared with the INRA- 82 extender (15.39% +/-5.96, 19.19% +/-7.71, p≤0.05; 13.8% +/-7.12, 20.34% +/-7.3, p≤0.05).
Estrous Hanoverian mares were inseminated with semen of two stallions originating from the first, second or third freeze/thaw cycle. The AI-dose was adjusted to a total of 200 x 106 spermatozoa in an AI-volume of 10 ml. First-cycle pregnancy rates were 4/10, 40 %; 1/10, 10%, and 0/10, 0% after the use of semen frozen/thawed once, twice and three times.
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