Effekte der Aufbereitungstechnik und multipler Einfrier- und Auftauzyklen auf Vitalitätseigenschaften und Chromatinstruktur
equiner Spermatozoen
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Christiane Hagen
aus Rheine
Hannover 2009
Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken
1. Gutachter: Prof. Dr. Harald Sieme 2. Gutachter: Prof. Dr. Bollwein
Tag der mündlichen Prüfung: 20.05.2009
Ein Beitrag aus dem Virtuellen Zentrum für Reproduktionsmedizin Niedersachsen
Meinen Eltern
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 11
2 Schrifttum 12
2.1 Tiefgefrierkonservierung von Hengstsperma 12
2.2 Grundlagen der Tiefgefrierkonservierung 12
2.2.1 Kälteschock 14
2.3 Einflüsse der verschiedenen Verdünnersubstanzen 16
2.3.1 Milch 17
2.3.2 Eigelb 18
2.3.3 Puffer 19
2.3.4 Zucker 20
2.3.5 Kryoprotektiva 21
2.4 Einflüsse der verschiedenen Aufbereitungsverfahren 23
2.4.1 Zentrifugation 23
2.4.1.1 Einfluss des Seminalplasmas auf die Spermienmotilität 25 2.4.1.2 Auswirkungen der Zentrifugation auf die Motilität
und Fertilität 27
2.4.2 Konfektionierung 29
2.4.3 Einfrierverfahren 30
2.5 Effekte multipler Einfrier-und Auftauzyklen auf die Spermien 32 2.6 Fertilitätsergebnisse nach Besamung mit kryokonserviertem
Hengstsperma 34
3 Material und Methoden 36
3.1 Allgemeine Angaben 36
3.1.1 Probanden 36
3.1.2 Ejakulatgewinnung 37
3.1.3 Ejakulatbeurteilung 37
3.1.4 Aufbereitung der einzelnen Ejakulate 38
3.1.5 Kühlung 38
3.1.6 Konfektionierung der Proben 39
3.2 Durchführung des Vorversuches 39
3.2.1 Probanden 39
3.2.2 Abfüllung und Konfektionierung 39
3.2.3 Aufteilung im Tiefgefrierautomaten 41
3.3 Durchführung der multiplen Einfrier- und Auftauzyklen 43 3.3.1 Aufbereitung der Proben nach den Einfrier- und Auftauzyklen 43
3.3.2 Kühlung und Konfektionierung 43
3.3.3 Erneute Kryokonservierung und Lagerung 43 3.3.4 Aufbereitung der Proben nach dem zweiten Einfrier-
und Auftauzyklus 43
3.3.5 Kühlung, Konfektionierung und Kryokonservierung 44 3.3.6 Auswertung der Proben nach dem dritten Einfrier-
und Auftauzyklus 44
3.4 Untersuchungsparameter der Tiefgefrierspermaproben 44
3.4.1 Motilität 44
3.4.2 Spermatologische Untersuchungen mit dem Durchflusszytometer 45
3.4.2.1 FITC-PNA /Syto®17 /PI Färbung 46
3.4.2.1.1 Aufbereitung der Proben 46
3.4.2.1.2 Auswertung 47
3.4.2.2 Spermienchromatinstrukturanalyse (SCSA™) 48
3.4.2.2.1 Funktion des Farbstoffes 48
3.4.2.2.2 Aufbereitung der Proben 48
3.4.2.2.3 Auswertung 49
3.5 Besamungsversuch 50
3.5.1 Probanden für den Besamungsversuch 50
3.5.2 Besamungsproben 51
3.5.3 Besamungsdosis 51
3.5.4 Untersuchung der Stuten 52
3.5.5 Medikation zur Induktion der Ovulation 53
3.5.6 Insemination 53
3.5.7 Trächtigkeitsuntersuchung 53
3.5.8 Statistische Auswertung 53
4 Ergebnisse 55
4.1 Ergebnisse des Vorversuches 55
4.1.1 Motilität der Spermien 55
4.1.1.1 Vorwärtsbeweglichkeit 57
4.1.1.2 Lineare Geschwindigkeit (VSL) 57
4.1.1.3 Mittlere Geschwindigkeit (VAP) 59
4.1.2 Membranintegrität der Spermien 61
4.1.2.1 Anteil membranintakter Spermien nach
FITC-PNA/Syto®17/PI-Färbung 61
4.1.2.2 Akrosomaler Status der Spermien 63
4.2 Ergebnisse des Hauptversuches 65
4.2.1 Motilität der Spermien 65
4.2.1.1 Vorwärtsbeweglichkeit 65
4.2.1.2 Lineare Geschwindigkeit (VSL) 66
4.2.1.3 Mittlere Geschwindigkeit (VAP) 67
4.2.2 Membranintegrität der Spermien 69 4.2.2.1 Anteil an membranintakten Spermien nach
FITC-PNA /Syto®17/PI- Färbung 69
4.2.2.2 Akrosomaler Status der Spermien 70
4.2.3 Spermienchromatinstruktur 72
4.3 Ergebnisse des Verdünnervergleiches 74
4.4 Ergebnisse des Besamungsversuches 76
5 Diskussion 77
5.1 Einfluss der Abfüllfraktionen 77
5.2 Einfluss der Lage während des Einfrierprozesses 78 5.3 Motilitätsanalysen von den Proben der Einfrier- und Auftauzyklen 79
5.3.1 Motilität 79
5.4 Durchflusszytometrisch erfasste Spermaparameter 81 5.4.1 Membranintegrität der Spermatozoen 81 5.4.2 Akrosomaler Status der Spermien 82 5.4.3 Spermien mit hohem DNA-Fragmentationsindex 84 5.5 Einfluss des mehrmaligen Einfrierens auf die Fertilität 85
5.6 Einfluss der Verdünner 86
6 Zusammenfassung 89
7 Summary 91
Literaturverzeichnis 93
Anhang 112
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS Abb. = Abbildung
ATP = Adenosintriphosphat bidest = bidestillata
bzw. = beziehungsweise
C = Celsius
ca. = circa
Ca2+ = Calciumionen
CASA = computer-assisted-sperm-analysis CMA-system = computer managed assessment system d.h. = das heißt
DFI = DNA-Fragmentationsindex DNA = Desoxyribonukleinsäure DMSO = Dimethylsulfoxid
EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure et al. = et alii (und andere)
Fa. = Firma
FITC = Fluoreszeinisothiocyanat I. E. = internationale Einheiten
m = Anzahl der Wiederholungen pro Pferd ml = Milliliter
MMP = Mitochondrienmembranpotential mm/s = Millimeter pro Sekunde
mod. = modifiziert
n = Anzahl der Pferde NaCl = Natriumchlorid
pH = Pondus Hydrogenii: <lat.> negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration
p = Irrtumswahrscheinlichkeit
ROS = reaktive Sauerstoffverbindungen SCSA™ = Spermienchromatinstrukturanalyse
s. = siehe
SD = standard deviation: <engl.> Standardabweichung sog. = so genannte
Tab. = Tabelle Temp. = Temperatur
TG-Verdünner = Tiefgefriersamenverdünner
1.TG = einmal eingefrorener Hengstsamen 2.TG = zweimal eingefrorener Hengstsamen 3. TG = dreimal eingefrorener Hengstsamen
u. = und
z.B. = zum Beispiel z.T. = zum Teil µl = Mikroliter µm = Mikrometer
µm/s = Mikrometer pro Sekunde
Einleitung
In der Pferdezucht hat die Bedeutung der Insemination mit Tiefgefriersperma in den letzten Jahren deutlich zugenommen. Die unbegrenzte Haltbarkeit des kryokonservierten Samens ermöglicht den weltweiten Zuchteinsatz und verursacht ein rapides Wachstum des internationalen Hengstspermahandels. Ein Problem stellen die hengstspezifischen Qualitätsunterschiede des Samens bezüglich der Konservierungsfähigkeit dar. Eine Modifizierung der Konservierungsverfahren zur Anpassung an individuelle Bedürfnisse ist dringend notwendig. Da fertilitätsrelevante Parameter bei der Selektion von Zuchthengsten zurzeit nur eine untergeordnete Rolle spielen, ist der Samen von ~1/3 der Hengste nicht für die Kryokonservierung geeignet (VIDAMENT et al. 1997).
Bisher wird in der Pferdezucht das Tiefgefriersperma mit reduzierten Vitalitätseigenschaften direkt nach dem Auftauen zur Insemination verwendet. Um die Effizienz bei wertvollen, nur im begrenzten Umfang zur Verfügung stehenden oder bereits verstorbenen Hengsten zu erhöhen, könnte es von Nutzen sein, die Inseminationsdosis aufzuteilen, mit Hilfe moderner Inseminationstechniken eine reduzierte Anzahl Spermatozoen zu übertragen und die überzähligen Spermien erneut einzufrieren. Weitere Einsatzmöglichkeiten multipler Einfrier-Auftauzyklen wäre die geschlechtsspezifische Trennung nach X- und Y-chromosomalen Spermatozoen aus bereits kryokonservierten Spermien und die Reduzierung der Lagerkapazitäten durch Tiefgefrierung höherer Spermienzahlen, die bei Bedarf aufgetaut und wieder eingefroren werden könnten (ARAV et al. 2002 b).
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, zunächst den Einfluss technologischer Aspekte auf die Kryokonservierung equiner Spermatozoen zu untersuchen. Es wurden die Auswirkungen der Abfüllfraktion der Spermiensuspension und der Positionierung der Pailletten im Kryokonservierungsautomaten bestimmt. Im Weiteren wurde der Einfluss multipler Einfrier- und Auftauzyklen auf die Vitalität und die Chromatinstruktur der Spermatozoen untersucht. Die Fertilität der mehrfach eingefrorenen Spermatozoen wurde im anschließenden Besamungsversuch mit tiefgefrorenen Ejakulaten von zwei Hengsten ermittelt.
2 Schrifttum
2.1 Tiefgefrierkonservierung von Hengstsperma
Ziel der Tiefgefrierkonservierung von Spermatozoen ist die Erhaltung der Befruchtungsfähigkeit über einen unbegrenzten Zeitraum. Die Temperaturerniedrigung bewirkt die Herabsetzung aller Stoffwechselprozesse. Mit dem Prozess des Kühlens, Gefrierens und Auftauens werden die Zellen jedoch erheblichem Stress ausgesetzt. Abhängig von der Einfrierrate sind die an der Zelle auftretenden Veränderungen zum einen auf Lösungseffekte, zum anderen auf die intrazelluläre Eisbildung zurückzuführen (MAZUR 1970).
Bedingt durch die im Rahmen der Kryokonservierung auftretenden Veränderungen an den Spermatozoen werden mit der künstlichen Besamung mit Tiefgefriersperma im Vergleich zur Besamung mit Frischsperma herabgesetzte Trächtigkeitsraten erzielt (BLACH et al. 1989; WATSON 2000). Die Einfriertauglichkeit weist deutliche interindividuelle Variationen auf. Die Auswirkungen des Tiefgefrierprozesses auf die Motilität, die Spermienchromatinstruktur, die Plasmamembranintegrität und das Mitochondrienmembranpotential unterschieden sich zwischen den Hengsten (DIGRASSI 2000). 9 % der Hengstpopulation sind nach wie vor nicht zur Kryokonservierung geeignet (VIDAMENT 2005) Eine Modifizierung der Konservierungsverfahren zur Anpassung an individuelle Bedürfnisse ist daher angebracht (SIEME et al.2003)
2.2 Grundlagen der Tiefgefrierkonservierung
Bei der Kryokonservierung werden folgende Basisschritte durchlaufen (BRINSKO und VARNER 1992): Nach der Samengewinnung wird das Ejakulat mit einem Zentrifugationsverdünner verdünnt und zur Abtrennung des Seminalplasmas zentrifugiert (MÜLLER 1982; KLUG 1989; VIDAMENT et al. 1999).
Nach Entfernung des Überstandes wird im Anschluss das Spermienpellet mit dem für die Tiefgefrierung bestimmten Verdünner resuspendiert und auf die vorgesehene Spermienkonzentration verdünnt. Diese Schritte erfolgen optimalerweise bei Raumtemperatur (CHOCHRAN et al. 1984). Per Abfüllautomaten wird die Spermiensuspension durch Unterdruck in die Pailletten gefüllt, welche im Anschluss verschlossen werden. Die Verpackungsformen sollten eine große Oberfläche bei kleinem Volumen besitzen, um ein homogenes Einfrieren und Auftauen zu ermöglichen. Aus diesem Grund werden vorzugsweise 0,5 ml fassende Normalpailletten verwendet (VOLKMANN et al. 1987; COCHRAN et al. 1984).
Der Verpackung des Samens, der sog. Konfektionierung, schließt sich die Abkühlung auf +5°C an. Dieser Schritt sollte bei niedrigen Kü hlraten erfolgen, da equine Spermatozoen vor allem in einem Temperaturbereich von 18°C bis 8°C empfindlich sind (MORAN et al 1992; DROBNIS et al. 1993).
Nach abgeschlossenem Kühlvorgang auf 5°C folgt die kontrollierte Tiefgefrierung auf -196°C und die anschließende Lagerung in flüssigem Stickstoff. Dabei kommt es in einem Temperaturbereich von -6°C bis -15°C zur Kris tallisation, die im extrazellulären Medium schneller als im intrazellulären Medium voranschreitet. Der optimale Temperaturverlauf beim Einfrieren und Auftauen hängt von mehreren Faktoren ab. Für die Auswirkungen von Einfrier- und Auftauvorgang ist neben der Konzentration der Spermien auch die Konfektionierungsform von Bedeutung. Laut verschiedener Modellberechnungen beträgt die optimale Einfriergeschwindigkeit für Spermien 25°C bis 120°C pro Minute. Sowohl zu hohe als auch zu niedrige Einfriergeschwindigkeiten haben einen Einfluss auf die Samenzellen, da die Formation der intra- und extrazellulären Eisbildung von der Abkühlgeschwindigkeit abhängt (MAZUR 1985). Bei Einfrierraten von -25°C b is -40°C/Minute wird der größte Teil des intrazellulären Wassers die Zelle verlassen. Durch diese Dehydratation der Zelle kommt es zu einer Erhöhung der Konzentration intrazellulärer Substanzen, was als Lösungseffekt bezeichnet wird (MAZUR 1970). Schnellere Einfriergeschwindigkeiten von mehr als 60°C/Minute haben zur Folge, dass nicht alles Wasser aus der Zelle diffundieren kann. Es kommt zur intrazellulären Eisbildung. Die so entstandenen Eiskristalle können während des Auftauprozesses zu größeren Kristallen rekristallisieren und die Zelle mechanisch schädigen
(GRAHAM 1996). Bei Einlagerung des während der Aufbereitung auf Raumtemperatur herabgekühlten Samens im Kühlschrank werden initiale Kühlraten von 0,2°C/min. erreicht. Geringere Kühlraten (0,07° C/min.) können erreicht werden, indem das Samenaufbereitungsgefäß in ein Wasserbad mit Raumtemperatur verbracht und dieses im Kühlschrank heruntergekühlt wird. Der Wasserstand im Wasserbad muss gleich oder höher sein als die Füllhöhe des Samens. Unterhalb des temperatursensitiven Bereiches kann wiederum eine schnelle Abkühlung erfolgen (SQUIRES et al. 1999). Die Überlebensrate von Spermatozoen hängt vom Verlauf der Einfriergeschwindigkeit ab; entspricht die Kurve der Form einer nach unten geöffneten Parabel, ist sie annähernd optimal. Zunächst steigt die Überlebensrate mit steigender Gefrierrate an, um dann nach Erreichen eines Optimums mit zunehmender Gefrierrate wieder abzufallen (MAZUR 1985).
Während der Lagerung des Spermas bei -196°C sind ke ine schädigenden Einflüsse zu erwarten (MAZUR 1984). Das Auftauen des Spermas zur anschließenden Besamung erfolgt in Abhängigkeit vom jeweiligen Einfrierprotokoll (GRAHAM 1996).
2.2.1 Kälteschock
Durch die Temperaturerniedrigung im für equine Spermatozoen sensitiven Bereich (zwischen 19°C und 8°C) (MORAN et al. 1992) kommt e s zu verschiedenen Struktur- und Funktionsänderungen an den Spermatozoen, die unter dem Begriff Kälteschock zusammengefasst werden (AMANN und PICKETT 1987).
Folgen der Kälteeinwirkung sind eine verringerte ATP-Produktion, die durch die Bestimmung der Enzymaktivität, der ATP-ase gemessen werden kann (HOLT und NORTH 1985; QUINN 1985). Ebenso lassen sich ein Verlust der Membranintegrität und der Zellfunktion (BWANGA et al. 1991), Motilitätsabnahme, abnorme Bewegungsmuster mit Kreisbewegungen und ein Verlust der Akrosomenintegrität beobachten (WATSON 1995).
Wesentlicher Angriffspunkt des Kälteschocks sind die Zellmembranen. Die Abkühlung der Membran bewirkt den Phasenübergang der in ihr enthaltenen Phospholipide vom flüssigen in den kristallinen Zustand. Da sich die Membran aus unterschiedlichen Lipiden zusammensetzt und diese wiederum unterschiedliche Phasenübergangstemperaturen besitzen, erreichen einige Membranareale den kristallinen Zustand, während sich andere noch im flüssigen Zustand befinden. In den flüssigen Membranregionen kommt es zur Konzentrierung von Membranproteinen. Die Folge dieses Prozesses ist eine Erhöhung der Membranpermeabilität (ROBERTSON und WATSON, 1986; ROBERTSON et al.
1988) und der Verlust metabolischer Funktionen. Die Aggregation einzelner Phospholipidklassen zu hexagonalen Arealen (STEPONKUS und LYNCH 1989) führt zu einer gestörten Funktion und Permeabilität der Membran (HAMMERSTEDT et al.
1990). Die Regeneration der Membranen nach Wiedererwärmung bleibt unvollständig (HOLT und NORTH 1986; DE LEEUW et al. 1990).
Durch den Kühlprozess kommt es zudem zu einer gestörten Kalziumregulation der Zelle. Die verminderte Aktivität ATP-abhängiger Pumpen bei niedrigen Temperaturen führt zu einer intrazellulären Anhäufung von Natrium. Die daraus folgende stellenweise Depolarisation der Zelle hat Auswirkungen auf spannungsabhängige Kalziumkanäle. Die Kanäle öffnen sich und der Einstrom von Kalzium aktiviert Signalwege, die der Kapazitation ähnelnde Veränderungen am Spermium bewirken.
In Folge des Kühlprozesses kommt es zu einer verfrühten Depolymerisation von Aktinfilamenten (HALL et al. 1993; SAUNDERS und PARKS 1999). Die Depolymerisation von zytoskelettalem F-Aktin ist Voraussetzung für die Annäherung der Plasmamembran an die darunterliegende äußere Akrosommembran und fördert somit die akrosomale Exozytose (SPUNGIN et al. 1995). Diese Vorgänge sind möglicherweise an der akrosomreaktionsähnlichen Verschmelzung der Plasmamembran und der akrosomalen Membran während der Kühlung beteiligt.
Die mitochondrialen Membranen der Spermatozoen werden ebenfalls in Mitleidenschaft gezogen. Dies führt zu einem gestörten Energiestoffwechsel der Zelle, der eine Motilitätsabnahme bewirkt (WATSON 2000).
Des Weiteren kommt es durch die Senkung der Temperatur zu Membranschädigungen des Spermienkopfes. Dabei ist zuerst die Plasmamembran betroffen, später die äußere Akrosommembran. Letztere erleidet keine totale Ruptur, sondern behält ihre Struktur bei. Diese Veränderungen führen aber zu einer messbaren akrosomalen Expansion (WATSON et al. 1987).
Auch langsame Kühlraten können das Entstehen von Membranschäden infolge des Kälteschocks nicht komplett verhindern (WATSON 1981). Das kontrollierte Herunterkühlen in einem für equine Spermatozoen kritischen Temperaturbereich, sowie die Zugabe von Lipiden (Eidotter) und Lipoproteinen (Milch) minimieren die Negativauswirkungen des Kälteschocks.
2.3 Einflüsse der verschiedenen Verdünnersubstanzen
Zur Tiefgefrierkonservierung von equinem Sperma werden zwei verschiedene Verdünner eingesetzt. Der Zentrifugationsverdünner wird zur partiellen Entfernung des Seminalplasmas und zur Konzentration der Spermien während des Zentrifugationsschrittes verwendet (PALMER 1984; AMANN und PICKETT 1987).
Die meisten Zentrifugationsverdünner setzen sich aus Milch oder Milchprodukten, Puffersubstanzen, Nährstoffen, Antibiotika und Antioxidantien zusammen. Die Puffersubstanzen sind für die Erhaltung des pH – Wertes um 7,0 notwendig. Die Nährstoffe dienen als Energiequelle für die Spermien. Die aus verschiedenen Lipidkomponenten (Milch, Eigelb, Phosphatidylcholin) bestehenden Membranprotektiva verhindern eine vorzeitige Destabilisierung der Membran durch Lipidverlagerungen und den Verlust von Lipiden sowie die durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) hervorgerufene Lipidperoxidation. Zugesetzte Antibiotika unterbinden ein Keimwachstum, während Antioxidantien zum Schutz der Plasmamembran vor einer Lipidperoxidation durch Reaktive Sauerstoffspezies dienen (WEITZE 2001b; AITKEN und BAKER 2004).
Der Tiefgefrierverdünner (TG-Verdünner) erfüllt kryoprotektive Aufgaben. Die Auswahl und Konzentration des Kryoprotektivums und der Puffersubstanzen sind für die Qualität des Samens von entscheidender Bedeutung. Die genauen Konzentrationen dieser Bestandteile variieren zwischen den einzelnen Verdünnern (PALMER 1984; AMANN und PICKETT 1987). Die Zusammensetzung des Tiefgefrierverdünners besteht aus Eidotter, Elektrolyten, Glucose und Glycerol (HEITLAND et al. 1996).
2.3.1 Milch
Milch und deren Nebenprodukte dienen als Grundsubstanz vieler Verdünnermedien für Hengstsamen. Ihre Inhaltsstoffe, vor allem Lipoproteine und Phospholipide, schützen die Pferdespermatozoen und dienen dem größtmöglichen Erhalt der Motilität (EBERTUS 1960). Da Magermilch genauso effizient zur Stabilisierung der Membran beiträgt, scheint der Fettanteil nicht in erster Linie für die Schutzwirkung verantwortlich zu sein. Verdünner, die auf Trockenmilch bzw. Magermilch basieren, kommen häufig zur Anwendung, da sie aufgrund von fehlenden Fettkügelchen optisch klar sind und die Motilität und Fertilität der Spermien gut erhalten (HUGHES und LOY 1970; KENNEY et al. 1975).
Das INRA (L’Institut National de la Recherche Agronomique, Nouzilly, Frankreich) isolierte natives Phosphocaseinat (NPPC) und ß-Lactoglobulin als wirksame Milchkomponenten zur Erhaltung von Motilität und Fertilität equiner Spermatozoen (BATELLIER et al. 1997) und entwickelte hieraus den Verdünner INRA 96 (IMV Technologies, L’Aigle, Frankreich), der im Vergleich zu herkömmlichen Verdünnern (INRA 82 und Kenney) eine höhere Motilität und Fertilität der Spermien nach 24- stündiger Lagerung zeigte (57% (n = 178) vs 40% (n = 173)) Trächtigkeitsrate pro Rosse; p<0,001) (BATELLIER et al. 1998). PILETT et al. (2008) erzielten mit Tiefgefriersperma in INRA 96 deutlich bessere Trächtigkeitsraten pro Rosse als mit INRA 82 (71% (30/42) vs. 40% (17/42)).
2.3.2 Eigelb
Eigelb ist ein wichtiger Bestandteil vieler Verdünnermedien (PAQUINON 1985; HOLT 2000) und dient als Gefrierschutz (PHILLIPS und LARDY 1940; WATSON 1976). Die membranprotektiv wirkende Substanz im Eigelb ist das Lecithin (Phosphatidylcholin) (QUINN et al. 1980), das sich aufgrund der negativen Ladung der Zellmembranproteine schützend an die Zellmembran anlagert (AMANN und PICKETT 1987). In den Untersuchungen über Widdersperma veröffentlichte WATSON (1981), dass sowohl durch Lipoproteinfraktionen des Eidotters als auch durch Lecithin die Schädigungen durch Kälteschock bei einer Lagerung bei + 5°C minimiert werden können. Eine Modifikation des Tiefgefrierverdünners wird durch Zugabe einer Emulgatorpaste auf der Basis von Tri-Ethanolamin-Lauryl-Sulfat erreicht. Der Zusatz bewirkt eine bessere Verteilung des Eidotters in der Verdünnerlösung, wodurch die eidottervermittelte membranprotektive Wirkung verbessert werden kann (NAGASE und GRAHAM 1964; MARTIN und KLUG 1979).
Auch die synthetischen Detergenzien wie delta-Amino-Na-Laurylsulfat (Orvus ES Paste (OEP)) mit dem Handelsnamen Equex STM ® werden den Tiefgefrierverdünnern für Pferde zugesetzt (GRAHAM et al. 1971b; COCHRAN et al.
1984). Durch die Steigerung des Dispersierungsgrades der Eidotterlipide können sich diese leichter in die Zellmembran integrieren und es kommt zur Verbesserung des Membranschutzes (PURSEL et al. 1978c; HOFMO und ALMLID 1991; PETTIT und BUHR 1998; BUHR et al. 1999).
Die membranprotektive Wirkung des Eigelbs ist jedoch für die Spermien der verschiedenen Spezies unterschiedlich ausgeprägt. So werden z. B. Eberspermien im Vergleich zu Bullen- oder Schafbockspermien weniger gut durch Eigelb geschützt (BENSON et al.1967; PURSEL et al. 1973). Für Spezies, bei denen Eidotter eine schützende Wirkung besitzt, identifizierten QUINN et al. (1980) Lecithin (Phosphatidylcholin) als vermutlich wirksamen Bestandteil, während BUTTLER und ROBERTS (1975) für Eberspermien dem Phosphatidylserin die schützende Wirkung zusprechen.
Bei einem Austausch einer bestimmten Menge Eigelb durch Soja und Lecithin kommt es zu keiner Veränderung des akrosomalen Status bei Hengstspermien (OETJEN 1988). Auch bei dem Vergleich zweier Ei-Lecithin-Verdünner, einem Verdünner mit
PMSF-Zusatz und einem Magermilchverdünner nach KENNEY et al. (1975), stellte HEFFE (1993) sowohl hinsichtlich der Motilität, als auch der membranprotektiven Wirkung, schlechtere Ergebnisse bei dem Verdünner mit Lecithinzusatz fest. Eine Erklärung konnte er dafür nicht finden. Bei dem Versuch 75 % des Eidotteranteils des Merk-Laktose-Verdünners (MARTIN und KLUG 1979) durch Magermilchverdünner (KENNEY et al. 1975) zu ersetzen, erzielte RÖBBELEN (1993) keine besseren, sondern signifikant schlechtere Auftauergebnisse.
Von einigen Autoren wird die Verwendung eines Überstandes aus einer zentrifugierten Eidotterlösung statt des gesamten Dotters beschrieben (GRAHAM et al. 1971a; PURSEL und JOHNSON 1975). Die membranprotektiven Komponenten des Eidotters, die ein hohes Molekulargewicht haben, befinden sich in einer Lipoproteinfraktion geringerer Dichte (FOULKES 1977). Zusätzlich fand FOULKES (1977) heraus, dass die Low-density-Fraktionen des Eigelbs zusammen mit Citrat und Glycerol die Motilität von Bullensperma genauso positiv beeinflussen, wie vollständiges Eidottermaterial.
2.3.3 Puffer
Da Hengstspermatozoen eine pH-Wert-Spanne von 6,8 bis 7,4 ohne negative Effekte auf die Fertilität tolerieren, sollten Verdünnermedien einen ph-Wert um 7,0 besitzen (AMANN und PICKETT 1987). Die Wasserlöslichkeit des Puffers muss optimal sein.
Die Pufferkonzentration, die Temperatur und die Ionenzusammensetzung des Verdünnermediums dürfen nur einen minimalen Einfluss auf die Dissoziation des Puffers haben. Zudem muss der Puffer über bekannte Metallbindungseigenschaften verfügen und gegenüber enzymatischen und nicht-enzymatischen Einwirkungen widerstandsfähig sein, um neutralisierend und stabilisierend auf die toxischen Endprodukte des anaeroben Stoffwechsels (u. a. Milchsäure) der Spermatozoen zu wirken, die sonst akkumulieren und im umgebenden Milieu eine pH-Wert Senkung hervorrufen (WEITZE 2001). In Magermilch-Glukose-Verdünnern wird häufig Natriumbikarbonat (pH-Optimum 6,8 - 7,2) als Puffer eingesetzt, da es gute neutralisierende und pH-stabilisierende Eigenschaften besitzt (PAQUINON 1985).
Eine weitere Puffersubstanz ist Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA; pH-Optimum 4 - 5), das häufig bei Ebersperma verwendet wird. EDTA ist in der Lage, Kalziumionen zu binden, um so den Durchtritt durch die Plasmamembran zu begrenzen und die kalziumabhängige Auslösung von Kapazitation und Akrosomenreaktion zu verhindern (PAQUINON 1985).
Die meisten Verdünner basieren auf sog. Zwitterionenpuffern wie z.B. HEPES (N-(2- Hydroxyläthylpiperazine-N-(2-Athenäsylfunidacid)) oder MOPS (-3(N- Morpholino)- propansulfonsäure). Letzterer wird hauptsächlich für die Konservierung von Eberspermien verwendet (Pufferbereich: pH 7,2- 7,8). PADILLA und FOOTE (1991) verwendeten den HEPES-Puffer erfolgreich in ihrem modifizierten Magermilchverdünner. Der HEPES-Puffer erfüllt alle Anforderungen an eine ideale Puffersubstanz (FERGUSON et al. 1980). Er bindet Schwermetalle und wird daher häufig in Verdünnern für Pferdesamen eingesetzt (Pufferbereich: pH 7-8).
2.3.4 Zucker
Als Zucker werden in erster Linie Glukose und Laktose bei Tiefgefrierverdünnern für Pferdespermien (BWANGA et al. 1991), sowie Fruktose in Tiefgefrierverdünnern für Eberspermien eingesetzt. Ihre Wirkung beruht größtenteils auf osmotischen Eigenschaften. Zusätzlich bestehen Wechselwirkungen mit anderen Verdünnerbestandteilen (PAQUINON 1985). Sie dienen in glykolysierbarer Form als Energiesubstrate. Höhermolekulare Zucker sind nicht in der Lage, die Zellmembran zu passieren und wirken so als extrazellulärer Gefrierschutz, indem sie den Anteil an ungefrorenem Wasser bei einer bestimmten Temperatur erhöhen oder die Konzentration von extrazellulärem Salz in ungefrorenem Wasser reduzieren (MAZUR 1984). Zucker, insbesondere Laktose, verfügen über akrosomschützende Wirkungen (WILMUT und POLGE 1977). Am Besten eignen sich bei Eberspermatozoen Glukose und Fruktose, da diese in höheren Konzentrationen gegenüber Maltose, Laktose, Succrose und Raffinose einen positiven Einfluss auf die Motilität der Spermatozoen haben (PAQUINON 1985).
2.3.5 Kryoprotektiva
Kryoprotektiva werden aufgrund ihrer Wirkungsweise und ihres Verhaltens gegenüber den einzufrierenden Spermien in penetrierende und nicht penetrierende Kryoprotektiva unterteilt. Penetrierende Gefrierschutzsubstanzen, wie z.B. Glycerol, Zuckeralkohole und Dimethylsulfoxid (DMSO), können sich sowohl intra- als auch extrazellulär aufhalten (AMANN und PICKETT 1987). Die nicht penetrierenden Substanzen wie z.B. Zucker, Aminosäuren und verschiedene Proteine befinden sich hingegen nur im extrazellulären Raum.
Die Tiefgefrierung tierischer Zellen wurde erst durch den Einsatz von Glycerol möglich, ihre kryoprotektive Wirkung beschrieben erstmals POLGE et al. (1949). Sie zeigten, dass sich Geflügelsperma mit Glycerolzusatz erfolgreich einfrieren lässt.
Auch bei vielen anderen Tierarten wird seitdem Glycerol als Gefrierschutzmittel eingesetzt (PARKS und GRAHAM 1992). Durch die Anwesenheit des Kryoprotektivums entsteht im Extrazellularraum ein hyperosmotisches Milieu, da die Plasmamembran eine höhere Permeabilität für Wasser als für das Kryoprotektivum aufweist. Es kommt zunächst zur Schrumpfung der Zelle. Nach kurzer Zeit penetriert das Kryoprotektivum die Zellmembran. Durch den entstandenen osmotischen Effekt diffundiert Wasser in die Samenzelle, was zu einer Volumenzunahme derselben führt. Dabei hängt die Wirkung eines Kryoprotektivums von verschiedenen Faktoren ab, unter anderem von ihrer Waserlöslichkeit (NASH 1996).
Das Glycerol erhöht die Viskosität des Wassers. Zusätzlich senkt es den Gefrierpunkt (STEINBERNER und PREUSS 1987), da es in der Lage ist Wasser zu binden (WEITZE 2001b). Nach Penetration der Spermienmembran löst sich das Glycerol in der Spermienmembran und erhält so deren Plastizität. Dadurch werden Schäden wie Mikrofissuren in der Plasmamembran verhindert, die durch Volumenänderungen der Zelle während des Einfrier- und Auftauvorgangs entstehen können (ALVAREZ und STOREY 1993). Die Membranfluidität wird durch das Glycerol in der Lipiddoppelmembran verändert (HAMMERSTEDT und GRAHAM 1992).
In höheren Konzentrationen (8-10 %) wirkt Glycerol zelltoxisch (FAHY 1986). Die im Tiefgefrierverdünner verwendete Glycerolkonzentration ist von den anderen kryoprotektiven Verdünnerbestandteilen abhängig.
Die Erhaltung der Befruchtungsfähigkeit der Spermien wird durch die Glycerolkonzentration, die Dauer der Glyceroleinwirkung und die Temperatur beeinflusst, bei der der glycerolhaltige Verdünner den Spermien zugegeben wird (BERNDTSON und FOOTE 1972; WILMUT und POLGE 1974; BAMBA und CRAN 1988). Bei Eberspermien gibt es unterschiedliche Glycerolkonzentrationen, die auf verschiedene Kompartimente des Spermiums positiv wirken, eine 3 bzw.4 % ige Glycerolkonzentration auf die Motilität, eine 2 bzw. 3 % ige Glycerolkonzentration auf die Akrosomenintegrität und eine 4 bzw. 6 % ige Glycerolkonzentration auf die Plasmamembranintegrität (ALMID et al. 1988). Bei Pferdespermien nimmt die Fertilität mit steigender Glycerolkonzentration (2 – 7 %) signifikant ab (PACE und SULLIVAN 1975), so dass üblicherweise dem Tiefgefrierverdünner Glycerolkonzentrationen von 2,5 % zugesetzt werden (SAMPER und MORRIS 1998). BURNS und REASNER (1995) und VIDAMENT et al. (2001) fanden heraus, dass ein Glycerolzusatz von 2 % im Tiefgefriersamenverdünner einen optimalen Schutz bewirkt und gleichzeitig einen sehr geringen schädigenden Einfluss hat.
Auch die Temperatur des glycerolhaltigen Verdünners spielt eine entscheidende Rolle. So werden bei Zugabe eines Tiefgefriersamenverdünners bei einer Temperatur von 30°C bessere Ergebnisse hinsichtlich der Motilität und Membranintegrität erzielt, als bei einer Temperatur von 5°C (RÖBBELEN 1993).
VIDAMENT et al. (1999) zeigten, dass es zu einer höheren Motilität und Fertilität der aufgetauten Spermien kommt, wenn der Zusatz des glycerolhaltigen Tiefgefriersamenverdünners bei einer Umgebungstemperatur von 22°C anstatt von 4°C erfolgt.
Desweiteren spielt die Anpassungszeit an den glycerolhaltigen Tiefgefrierverdünner eine entscheidene Rolle. Eine Adaptation an den glycerolhaltigen Verdünner bei +5°C vor der Tiefgefrierung wirkt sich positiv auf die Spermienmorpholgie aus. Die
Motilität wird durch eine kürzere Anpassungszeit des glycerolhaltigen Tiefgefriersamenverdünners jedoch nicht negativ beeinflusst (RÖBBELEN 1993).
Aufgrund der zelltoxischen Eigenschaften von Glycerol wurde nach alternativen Kryoprotektiva gesucht. So wurden z. B. Ethylenglykol, Polyethylenglykol und Propylenglykol durch NISHIKAWA et al. (1968), Betain durch KOSKINEN et al.
(1989) sowie DMSO durch LOVELOCK und BISHOP (1959) auf ihre kryoprotektiven Eigenschaften getestet. Da sich bisher jedoch kein befriedigender Ersatz fand, ist Glycerol in den meisten Laboren bis heute das gängige Kryoprotektivum.
ASHWOOD-SMITH klassifizierte 1987 die bis dahin untersuchten Substanzen, denen eine kryoprotektive Wirksamkeit zugesprochen wurde, in Alkohole (Glycerol, Ethylenglykol etc.) und Amide. Ein ideales Kryoprotektivum sollte sich durch ein niedriges Molgewicht, eine gute Wasserlöslichkeit und eine geringe Toxizität auszeichnen. ALVARENGA et al. (2005) testeten als Alternative zum Glycerol die im Molargewicht niedrigen Amide. N-Methylformamide sind formell Amide der Ameisensäure, bzw. am Stickstoff methylierte (= Wasserstoff durch eine Methyl- Gruppe ersetzte) Derivate des Formamids mit ähnlichen Eigenschaften. Formamide liegen bei Raumtemperatur als farblose, hygroskopische Flüssigkeit von glycerolartiger Konsistenz vor. Im Gegensatz zu Glycerol sind N-Methylformamide für den Laboranten toxisch.
2.4 Einflüsse der verschiedenen Aufbereitungsverfahren 2.4.1 Zentrifugation
Schon 1950 verfolgten McLEOD und McGEE die Idee, die Zentrifugationskraft für die Konzentration von Hengstspermien auszunutzen. Der Einfluss der Zentrifugation auf die Qualität des Hengstspermas ist abhängig von der Kombination aus Gravitationskraft und Zentrifugationsdauer (PICKETT et al. 1975 b). Je niedriger die Zentrifugalkräfte, desto geringer die Schadwirkung auf die Samenzellen. Selbst
durch geringe Zentrifugalkräfte (400 x g) ist eine ausreichende Abtrennung des Seminalplasmas zu erreichen, um die Lagerungszeit der Samenzellen entscheidend zu verlängern. Diesen positiven Einfluss der Zentrifugation auf die partielle Reduktion des Seminalplasmas von Hengstsperma mit schlechter Kühl – und Lagerungstoleranz fanden BRINSKO et al (2000) heraus.
BLACH et al. (1989) und WATSON (2000) hoben wiederum Spermienverluste und Membranschädigungen der Samenzellen als Nachteile der Zentrifugation hervor. Um das Ausmaß dieser negativen Auswirkungen abzuklären, verglich WEISS (2004) in einer Studie drei verschiedene Zentrifugationsmethoden mit unterschiedlicher Zentrifugalbeschleunigung und Zentrifugationsdauer. Laut ihm zufolge ist der Spermienverlust am geringsten und die Samenqualität nach dem Auftauen am besten, wenn der Samen vor der Kryokonservierung bei 600 x g 10 min zentrifugiert wird. Das Resultat verdeutlicht die signifikante Beeinflussung von Spermienverlust und funktioneller Membranintegrität durch die Zentrifugationsmethode. MAKLER et al. (1984) und REVELL et al. (1997) beschrieben die Kissenzentrifugationsmethode („cushion-centrifugation“) als eine Technik, die das Arbeiten mit einer hohen Zentrifugationskraft ermöglicht, um eine höhere Rückgewinnungsrate zu erreichen.
Das Schwimmen der Spermien während der Zentrifugation auf einer weichen, kissenähnlichen Flüssigkeit mit hoher Dichte mindert das Ausmaß physikalischer Schäden durch Gravitationskräfte und Pelletierung. KNOP (2006) bestätigten den positiven Einfluss hoher Zentrifugalkräfte und langer Zentrifugationszeiten in Kombination mit klaren Verdünnermedien auf die Rückgewinnungsrate. Darüber hinaus stellten sie durch ihre Untersuchungen den vorteilhaften Effekt der Kissenzentrifugationsmethode auf den Anteil akrosomreagierter bzw.
membranintakter Samenzellen heraus. WAITE et al. (2008) untersuchten den Einfluss verschiedener Zentrifugationsglasformen, Zentrifugationsverdünner und Zentrifugationskräfte und unterschiedlicher „Cushion“-Medien (Eqcellsire® Component B (Fa. IMV, L’Aigle, Frankreich), Cushion Fluid™ (Fa. Minitüb, Tiefenbach) oder OptiPrep™ (Fa. Greiner Bio-One, Axis-Shield, Oslo, Norwegen) auf die Rückgewinnungsrate und Spermienqualität nach der Zentrifugation. Sie beobachteten eine höhere Spermienmotilität nach Zentrifugation in speziell entwickelten Nipplegläsern, stellten jedoch im Vergleich zu herkömmlichen
konusförmigen Plastikzentrifugationsgefäßen eine niedrigere Rückgewinnungsrate fest (p< 0,05). Die Kissenzentrifugation mit INRA 96 (Fa. IMV, L’Aigle, Frankreich) erbrachte sowohl hinsichtlich der Rückgewinnungsrate als auch im Hinblick auf die Spermienqualität bessere Ergebnisse als die Verdünnung in einem optisch klaren Verdünner (HGLL), während die Zentrifugationskraft (400 x g vs 600 x g) und die Art des Cushion-Mediums keinen Einfluss auf diese Parameter besaßen.
2.4.1.1 Einfluss des Seminalplasmas auf die Spermienmotilität
Das Seminalplasma im Hengstejakulat hat sowohl einen positiven als auch einen negativen Einfluss auf die Spermienmotilität (PICKETT et al. 1975). Um die negativen Effekte des Seminalplasmas auf die Spermien während des Tiefgefrierens zu vermindern, muss das Ejakulat zentrifugiert und das Seminalplasma im Überstand verworfen werden (CORTEEL 1980; JASKO et al. 1991; SAMPER und MORRIS 1998). Dass die Entfernung des Seminalplasmas sich positiv auf die Überlebensrate der Spermien auswirkt, vermuteten bereits SMITH und POLGE (1950). GÖTZE (1949) fand heraus, dass die Spermien im Ejakulat mit Seminalplasma bei Zimmertemperatur nur eine Überlebenszeit von acht bis zwölf Stunden besitzen.
Auch PICKETT et al. (1975) kamen zu dem Ergebnis, dass die Lagerung von Hengstsperma ohne Seminalplasma über einen längeren Zeitraum möglich ist. Die Motilität der Spermien bleibt trotz Entfernung des Seminalplasmas erhalten (JASKO et al. 1991). MARDEN und WERTHESSEN (1956) zeigten, dass das Seminalplasma einen hemmenden Einfluss auf die Motilität von Hengstsamenzellen hat.
Hengstsperma, das ohne Seminalplasma eingefroren wurde, hat nach dem Auftauen eine höhere Motilitätsrate, als solches mit Seminalplasma (RAJAMANNAN et al.
1968). Im Unterschied hierzu ergaben die Untersuchungen von PICKETT et al.
(1975), dass ein 10%iger Anteil an Seminalplasma in der Endverdünnung zu den besten Resultaten führt. JASKO et al. (1992) bestätigten dieses Ergebnis, indem sie die Motilitäten von Hengstsperma verglichen, die kein bzw. 5-10 % Seminalplasma enthielten. Die Spermien ohne Seminalplasma zeigten nach 24-stündiger Lagerung bei + 5°C eine geringere Motilität als jene mit 5-1 0%igem Anteil. MOORE et al.
(2005) kamen zu dem Ergebnis, dass es bei 6-stündiger Lagerung vor dem
Einfrieren mit Seminalplasmakonzentrationen von 5-20% bei 20°C zu schlechteren Motilitäten (35%) kommt, als bei einer Lagerung bei 5°C (42%).
BEDFORD et al. (1994a, b) fanden heraus, dass es ohne Entfernung des Seminalplasmas und bei Zugabe von Eigelb zum Verdünner zu einer Motilitätsdepression kommt, die möglicherweise auf eine schädigende Wechselwirkung zwischen Seminalplasma und Eigelb zurückzuführen ist. Eine zweimalige Zentrifugation zur Entfernung des gesamten Seminalplasmas wirkte sich stark negativ auf die Kopfkappenintegrität und die Auftaumotilität aus (PICKETT et al.
1975).
MOORE et al. (2005) stellten ebenfalls fest, dass es bei der Rückführung des Seminalplasmas, unabhängig von der Konzentration (5- 80%), 15 Minuten vor der Verdünnung mit dem Tiefgefriersamenverdünner nach dem Auftauen zu gleichen Motilitätsergebnissen kommt wie bei eingefrorenen Spermaproben ohne Seminalplasma.
Während von verschiedenen Autoren durch die in den Nebenhodensekreten und im Seminalplasma enthaltenden Dekapazitationsfaktoren ein hemmender Einfluss auf die Kapazitation der Spermien beschrieben wurde, erläuterten SOSTARIC et al.
(2008) unterschiedliche Wirkungen der epididymalen und seminalen Sekrete auf die Fertilität der Spermien. Sie beobachteten eine geringe in vitro-Induzierbarkeit der Akrosomreaktion bei Spermien, die aus dem Nebenhodenkopf, -körper oder - schwanz entnommen wurden und sahen eine physiologische Aktivierung der Spermien nach Kontakt mit dem Seminalplasma während der Ejakulation. Dies führten sie auf einen „Wascheffekt“ der Seminalplasmakomponenten zurück, die die Spermien von den Dekapazitationsfaktoren befreien, die sich während der Lagerung im Nebenhoden um die Spermien legen. Alternativ diskutierten sie eine Spermienaktivierung durch Prostasome.
KARESKOSKI und KATILA (2008) beobachteten in der spermienreichen Fraktion niedrigere DFI-Werte als in der spermienarmen Fraktion. Sie stellten einen negativen
Effekt des Seminalplasmas (Seminalplasma: Verdünner-Verhältnis 1:2) auf die Lagerungsfähigkeit des Spermas fest. Dies bestätigte die Ergebnisse von LOVE et al. (2005), die in einer Studie mit drei fertilen Hengsten keine signifikante Reduktion der Spermienmotilität, jedoch eine signifikante Erhöhung des DFI-Wertes mit zunehmender Seminalplasma-Konzentration (0, 10, 20 % Seminalplasma) in der Samenprobe feststellten.
2.4.1.2 Auswirkungen der Zentrifugation auf die Motilität und Fertilität
Während der Zentrifugation des Hengstejakulates kommt es einerseits - bedingt durch die Zentrifugalkräfte - zu Membranschäden an der Samenzelle (BLACH et al.
1989; WATSON 2000). Auf der anderen Seite ist die Zentrifugation notwendig, um eine für die Tiefgefrierung ausreichende Konzentration des Hengstsamens zu erreichen (McLEOD und McGEE 1950).
Unterschiede bei der Zentrifugation von unverdünntem und verdünntem Pferdesamen zeigten MARTIN und KLUG (1979). Sie verwendeten zur Verdünnung eine hypertone Glucose-EDTA-Lösung und eine Zentrifugationsdauer von fünf Minuten bei 1000 g. Der vorher verdünnte Samen zeigte wesentlich bessere Auftaumotilitäten als der unverdünnte Samen.
Bei der Zentrifugation von verdünntem sowie unverdünntem Samen kommt es zu einem deutlichen Anstieg der Akrosomenschädigungen. Dies stellte BAUMGARTL (1980) mit Hilfe elektronenmikroskopischer Untersuchungen fest. Auch OETJEN (1988) und HEFFE (1993) kamen bei ihren Untersuchungen zu ähnlichen Ergebnissen.
COCHRAN et al. (1984) setzten als Zentrifugationsverdünner ein Citrat-EDTA- Medium ein. Sie unterschichteten den auf 50 Millionen Samenzellen/ml verdünnten Samen mit 0,25 ml der hypertonen Glucose-EDTA-Lösung nach MARTIN und KLUG (1979) und setzten die Zentrifugationsstärke auf 400 g herab. Die Zentrifugationsdauer betrug fünfzehn Minuten. Die Auftaumotilität der in dieser Weise
behandelten Proben übertraf die mit Glucose-EDTA und höherer Kraft zentrifugierten Ejakulate. VOLKMANN (1987) vereinfachte das Verfahren von COCHRAN et al.
(1984), indem er auf die Unterschichtung der Spermien mit dem Glucose-EDTA- Medium verzichtete. Beim Vergleich beider Methoden wurden keine Unterschiede hinsichtlich der Vorwärtsmotilität nach dem Auftauen, wohl aber ein geringerer Anteil an geschädigten Kopfkappen bei Verwendung der hypertonen Glukose-EDTA- Lösung festgestellt.
PICKETT et al. (1975) erkannten, dass der Einfluss der Zentrifugation auf die Veränderung der Spermien in Verbindung mit der Gravitationskraft und der Zentrifugationszeit steht. So wirken sich, eine ausreichende Abtrennung des Seminalplasmas vorausgesetzt, Zentrifugalkräfte unterhalb von 400 g nicht negativ auf die Hengstspermien aus.
HEITLAND et al. (1996) stellten beim Vergleich von zehn verschiedenen Zentrifugationszeiten fest, dass mit Verlängerung der Zentrifugationszeit eine höhere Rückgewinnungsrate erzielt werden kann. Bei einer Zentrifugationsdauer von mehr als 20 Minuten stellten sie nur eine geringe Motilitätsdepression fest.
WEISS (2004) verglich in einer Studie drei unterschiedliche Zentrifugationsmethoden (600g 10 min, 1000g 2 min und 2000g 2min). Sie fand, dass die funktionelle Membranintegrität im aufgetauten Samen von der Zentrifugationsmethode beeinflusst wird. Bei einer Herabsetzung der Zentrifugationsdauer sollte die Beschleunigung erhöht werden, da es sonst zu einem erhöhten Spermienverlust kommt. Bei einer Erhöhung der Beschleunigung treten jedoch vermehrt Membranschäden auf. Ihre Ergebnisse zeigten, dass es zu einem geringen Spermienverlust und zu weniger Membranschäden der Hengstsamenzellen kommt, wenn vor der Tiefgefrierung eine zehnminütige Zentrifugation des Spermas mit einer Geschwindigkeit von 600g stattfindet.
2.4.2 Konfektionierung
Die Verpackungsform sollte so gewählt werden, dass ein homogenes Einfrieren und Auftauen des gesamten Inhaltes gewährleistet ist. Optimalerweise handelt es sich dabei um eine Konfektionierungsform, die über eine große Oberfläche, bei kleinem Volumen verfügt.
Zur Gewährleistung optimaler Auftaumotilitäten wurden verschiedene Konfektionierungsformen untersucht. Glasampullen mit Volumina von 1 bis 10 Millilitern können bis zu einer Temperatur von -79°C tiefgefroren werden (SZUMOWSKI 1954; ILJINSKAJA 1956). Die ersten Kunststoffpailletten wurden von NISHIKAWA et al. (1968) eingeführt. Diese verfügen über ein Volumen von 1ml und können in flüssigem Stickstoff bei -196°C gelagert werden.
KNEIßL (1993) verwendete verschiedene Konfektionierungsformen (Makrotüb 5 ml, Flachtüb 5 ml, 0,25 ml Pailletten und 0,5 ml Pailletten) bei der Anwendung zweier Einfrierverfahren (Styroporbox und computergesteuertes Einfrierverfahren). Proben aus den 0,5 ml Pailletten zeigten im Vergleich zu den anderen Konfektionierungsformen anhand des computergesteuerten Einfrierverfahrens bessere Auftaumotilitäten sowie geringere Akrosom- und Membranschädigungen.
Im Gegensatz dazu stellte SAMPER (1995) beim Vergleich der Pailletten mit den Volumina 0,5 ml, 2,5 ml und 5 ml keine Motilitätsunterschiede nach dem Auftauen fest. CROCKETT et al. (2000) bestätigten dieses Ergebnis durch einen Vergleich der Auftaumotilitäten von 0,5 ml und 2,5 ml Pailletten.
2.4.3 Einfrierverfahren
Für den Erfolg der Kryokonservierung ist eine optimale Einfriergeschwindigkeit entscheidend.
Bei der Tiefgefrierung nach MARTIN und KLUG (1979) werden die Pailletten für eine definierte Zeit auf einem Metallrost horizontal über einem Stickstoffspiegel in einer abgedichteten Styroporbox gelagert. Die Kühlrate lässt sich durch den Abstand der Pailletten zum Stickstoffspiegel variieren. Je größer die Distanz zum Stickstoffspiegel, desto niedriger ist die Kühlrate und die Endtemperatur. Bei einem Abstand von 5 cm zum Stickstoffspiegel kühlt die Paillette mit einer Geschwindigkeit von ca. 60°C pro Minute ab (HEITLAND et al. 1996).
Eine weltweit verbreitete Methode ist die computergesteuerte Stickstoffdampftechnik.
Dabei handelt es sich um ein schnelles Einfrierverfahren mit anschließender Lagerung in flüssigem Stickstoff bei -196°C
Mitte der 80er Jahre wurde erstmals Pferdesamen in computergesteuerten Automaten eingefroren (COCHRAN et al. 1984; CHRISTANELLI et al. 1984; DELIUS 1985). Die Pailletten werden dazu auf Metallroste gelegt, die horizontal übereinander im Tiefgefrierautomaten gestapelt werden. Der flüssige Stickstoff wird aus einem Druckbehälter in die Gefrierkammer geleitet. Über einen Turbinenventilator wird der zerstäubte Stickstoff gleichmäßig in der Gefrierkammer verteilt. Die Kristallisation läuft spontan in Form eines Massenseedings ab. Nach dem Erreichen der Endtemperatur werden die Pailletten in flüssigem Stickstoff bis zum Auftauen gelagert.
Bei einem Vergleich der Stickstoffdampfmethode mit dem Tiefgefrierautomaten an humanen Spermatozoen wurde ein Teil der Proben 10 Minuten über Stickstoffdampf eingefroren. Der andere Teil der Proben wurde im Tiefgefrierautomaten schrittweise mit einer Kühlrate von -1°C/ min von +20°C auf +5°C , dann mit einer Gefrierrate von -10°C/ min von +5 °C bis -80°C und danach mit -25°C / min bis -130°C gefroren und anschließend in flüssigen Stickstoff transferiert und gelagert. Darauf erfolgte eine
zweimonatige Lagerung aller Proben in flüssigem Stickstoff. Bei der Beurteilung der Morphologie der Spermien per Ausstrich zeigte sich, dass sich die Menge morphologischer Spermienschäden zwischen den Einfriermethoden nicht signifikant voneinander unterscheidet (HAMMADEH et al. 2000).
DELIUS (1985) konnte hingegen einen wesentlichen Vorteil des computergesteuerten Einfrierverfahrens feststellen, da eine schnelle Kühlrate von 25°C/ min bei Hengstspermien zu besseren Auftauresu ltaten führte als eine Tiefgefriergeschwindigkeit von 5°C/ min (RÖBBELEN 1 993). Im Allgemeinen werden Spermien mit relativ hohen Einfriergeschwindigkeiten, die in der Größenordnung von 15 bis 60°C/ min liegen, tiefgefroren (COCHRAN et a l. 1984; PALMER und MAGISTRINI 1992; WÖCKENER et al. 1992). Mit diesen empirisch ermittelten Einfriergeschwindigkeiten lassen sich die besten Überlebensraten von Samenzellen nach Kryokonservierung erzielen.
Bei der direktionalen Gefrierung („directional soldification“), einer speziellen Methode des computergestützten Einfrierens, wird das biologische Material kontrolliert mit vorher eingestellter Geschwindigkeit heruntergekühlt. Diese Technik wurde 1985 von RUBINSKY und IKEDA entwickelt, die die ersten Versuche mit Erythrozyten in 0,9
%-iger Kochsalzlösung durchführten. RUBINSKY et al. (1991) froren experimentell Oozyten von Schweinen mit der direktionalen Gefrierung ein. Wesentliche Unterschiede der direktionalen Gefriermethode im Vergleich zur etablierten Tiefgefrierung im Tiefgefrierautomaten sind die deutlich höheren Einfriergeschwindigkeiten und die Art der Gefrierung. Während das Gefriergut bei der Tiefgefrierung in einem Tiefgefrierautomaten in Form eines Massenseedings ungesteuert und inhomogen tiefgefroren wird, erfolgt bei der direktionalen Gefrierung eine gesteuerte, partiell fortschreitende Gefrierung (RUBINSKY und IKEDA 1985).
Die Einfrierapparatur (Harmony CryoCare -Multi Thermal Gradient 516®, MTG 516®, Fa. IMT, International Ltd, Chester, GB) besteht aus zwei Kupferblöcken, die durch einen Spalt getrennt sind. In den Blöcken sind zur Aufnahme der Gefrierröhrchen Aussparungen eingeschliffen. Die Röhrchen werden in den ersten Kupferblock bei einer Temperatur von +5°C eingelegt. Die Auslösung eines initialen Seedings geschieht, wenn die Röhrchenspitze in den zweiten Block (-50°C) vorgetrieben wird.
Danach erfolgen der weitere Vortrieb und die direktionale Gefrierung bei konstanter Geschwindigkeit. Abschließend werden die Röhrchen manuelle in flüssigen Stickstoff überführt (RUBEI et al. 2004). Durch spezielle Glasröhrchen, die sog. Hollow Tubes®, ist es möglich, eine Menge von 10 ml einzufrieren. Experimentell wurden Volumina von 12ml eingefroren. Bei Bullenspermatozoen wurden dabei Auftaumotilitäten von 75 % erreicht (ARAV et al. 2002).
Auch ZIRKLER (2005) zeigten die Möglichkeit, Pferdespermien mittels direktionaler Gefriertechnik in Hollow-Tubes® zu kryokonservieren. Sie verglichen die Kryokonservierung mittels konventioneller Gefrierung in 0,5 ml Pailletten mit der direktionalen Gefriertechnik in Hollow-Tubes®. Die Auftauqualitäten der in den beiden Konfektionierungsformen tiefgefrorenen Spermaproben unterschieden sich hinsichtlich des Anteils vorwärtsmotiler Spermien, der kurvolinearen Geschwindigkeit, der linearen Geschwindigkeit, der mittleren Geschwindigkeit der Spermien und des prozentualen Anteils an DFI-Spermien nicht signifikant voneinander.
SARAGUSTY et al. (2007) erzielten hingegen bei der Kryokonservierung von Pferdespermien in Glas-Tubes mittels direktionaler Gefriertechnik bessere Ergebnisse als in 0,5 ml Pailletten mit der konventionellen Gefrierung. Die Unterschiede waren folgende: 12,8 % bessere Spermienmotilität, 14,4% besserer akrosomaler Status der Spermien und 9,7% bessere Spermienmembranintegrität.
2.5 Effekte multipler Einfrier- und Auftauzyklen auf die Spermienstruktur
Die Möglichkeit des erneuten Einfrierens von zuvor aufgetautem Tiefgefriersperma ermöglicht einen effizienten Einsatz bei im begrenzten Umfang zur Verfügung stehenden Besamungsportionen.
Eine Studie an humanen Spermien zeigte, dass sich die Motilität bei mehrmaligem Einfrieren mit der konventionellen Gefriermethode kontinuierlich verringert. Bis zum dritten Einfrierprozess nimmt die Motilität stetig (48%, 22%, 8%) ab. Danach bleibt die Motilität bei drei weiteren Einfrierzyklen konstant bei zwei Prozent (VERZA et al.
2005). GILBERT et al. (2000) beobachteten, dass das Überleben und die Motilität humaner Spermien signifikant bei jedem Einfrier- und Auftauprozess abnimmt. Sie sahen eine lineare Abnahme der Motilität von 8,7 % nach langsamem und 6,7 % nach schnellem Einfrieren bei jedem Zyklus und führten die reduzierte Spermienqualität nach mehrmaligen Einfrier- und Auftauprozessen auf eine Schädigung der Plasmamembran durch freie Radikale und Superoxide, osmotische Veränderungen und intra- und extrazelluläre Eisformationen zurück.
SI et al. (2006) sahen nach zweimaligem Tiefgefrieren von Hasenspermatozoen eine Abnahme der Spermienmotilität nach dem zweiten Einfrieren im Vergleich zum ersten Einfrier- und Auftauzyklus von 36,3 % auf 16,3 % und eine Verdopplung des Anteils akrosomreagierter Spermien.
Eine Untersuchung mit Bullensperma zeigte, dass es mit geringerem Motilitätsverlust (81,8 % auf 68,8 %) zweimal eingefroren werden kann. Es wurde jedoch ein signifikanter Abfall des durchflusszytometrisch ermittelten Anteils plasmamembranintakter und akrosomintakter Bullenspermien nach dem zweiten Einfrieren festgestellt. In dieser Studie verwendeten die Autoren die PureSperm®- Lösung zur Dichtegradientenzentrifugation vor dem ersten Einfriervorgang. Die Lösung selektiert lebende und morphologisch intakte von den geschädigten, agglutinierten und toten Spermien (MAXWELL et al. 2007).
ARAV et al. (2002 a, b) verwendeten in ihrer Studie verschiedene Volumina an Bullensperma. Die Spermaproben wurden mit der direktionalen Gefriermethode eingefroren. Dabei betrug die Motilität nach dem ersten Einfrieren in 12 ml Testtubes 75 % und nach dem zweiten Einfriergang in 0,5 ml Pailletten 50 %.
Bei Pferdesperma fanden CHOI et al. (2006) heraus, dass die Motilität nach zweimaligem Einfrieren von 36 % auf 16 % abnimmt. Bei subfertilen Hengsten reduzierte sich die Motilität sogar von 19 % auf 3 %.
In einer Studie mit 6 Hengsten von McCUE et al. (2004), in der die Spermienkonzentration von ursprünglich 400 x 106/ml auf bis zu 4 x 104/ml vor dem
zweiten Einfriervorgang verdünnt wurde, reduzierte sich die Gesamtmotilität von 64,2% nach dem ersten Auftauen auf 45,7% nach dem zweiten Auftauen.
Mehrmalige Einfrierzyklen scheinen jedoch keinen Einfluss auf die Chromatinintegrität zu haben, da die Spermatiefgefrierung nicht zu einer vermehrten Denaturierung des im Spermienkopf enthaltenden Chromatins führt (VARNER et al.
2006).
2.6 Fertilitätsergebnisse nach Besamung mit kryokonserviertem Hengstsperma Die Trächtigkeitsergebnisse nach Besamung mit tiefgefrorenem Hengstsperma hängen u.a. von der Konfektionierung, der Spermiendosis, dem Besamungs- zeitpunkt, -intervall und der -frequenz ab. Die Trächtigkeitsraten mit verschiedenen Besamungsregimen sind in der Tabelle 1 dargestellt.
Tab.1: Einfluss des Besamungsregimes bei der Tiefgefrierspermaübertragung auf die Fruchtbarkeit bei der Stute (Literaturübersicht).
Referenz Ver- packung
Spermien- Dosis (x 106 )
Volumen (ml)/
Zeitpunkt/ KB- Intervall
Anzahl KB Trächtigkeits- rate (+/n)
(%)
Pace u.
Sullvian (1975)
Ampulle Pellet
40 motil 80 motil 160 motil
12-h-Intervall 24-h-Intervall 12-h-Intervall 24-h-Intervall 24-h-Intervall
>1 2/20 1/19 7/20 5/20 5/18
10 5 35 25 28 Klug et al.
(1975)
Pellet 100 - >1 58/228 25
Müller (1982)
Alutuben 320-1 104 motil
15 ml
24-h-Intervall
>1 91/246 37
Müller (1987)
Alutuben 300 motil 15 >1 537/959 56
Kloppe et al. (1988)
Makrotüb 600 48-h-Intervall 0-6 h post ov.
2,7 1
12/20 11/20
60 55 Vidament
et
al.(1997)
0,5 Pailletten
300 150 300 150
<24 h prä ov.
<24 h prä ov.
24-h-Intervall 24-h-Intervall
1 1
≥2
≥2
508 71 187 207
26 21 41 34 Leipold et
al. (1998) 0,5
Pailletten 800 motil 800 motil 320 motil 320 motil
x 106 vor TG 1 600/ml 400/ml 1 600/ml 400/ml
>1 24-h- Intervall
8/24 7/25 10/25 4/26
33 28 40 15 Vidament
et
al.(1999)
0,5 Pailletten
400 24-h-Intervall >1 4 190 49
Barbacani et
al.(1999)
- - -6 bis 0h prä ov.
0 bis 6h post ov.
güst Maiden Fohlenstute
1 -/363
-/677 180♀
155♀
224♀
41 41 28 39 60 Katila
(2003)
- - - 1 237/716 33
Sieme et al.
(2003b)
0,5 Pailletten
800 24-12h prä ov.
-12 bis 0h prä ov.
0 bis 12h post ov.
24-h-Intervall 24-h-Intervall
1 1 1 2 3
8/26 31/75 24/48 31/62 3/9
30 41 50 50 33
Crowe et al. (2008)
0,5 Pailletten
>300 motil 2-4 ml
36h + 48h post
2 114/193 59
3 Material und Methoden
3.1 Allgemeine Angaben
3.1.1 Probanden
Für die Untersuchungen standen insgesamt 22 Zuchthengste des Niedersächsischen Landgestüts Celle zur Verfügung. Die zwischen 5 und 21 Jahre alten Warmbluthengste nahmen größtenteils von Oktober bis Februar am standardisierten, kommerziellen Einfrierprogramm des Landgestüts teil. Bei Hengsten, die nicht am Einfrierprogramm teilnahmen, wurden vor Versuchsbeginn dreimal wöchentlich (Montag, Mittwoch, Freitag) Samenentnahmen durchgeführt. Die für die Versuche verwendeten Ejakulate wurden im Januar und Februar gewonnen.
Für den Hauptversuch wurden die Probanden in zwei Gruppen (n=5) aufgeteilt. In der Gruppe 1 befanden sich die Hengste mit vorberichtlich guter Samentiefgefriereignung (Anteil vorwärtsbeweglicher Spermien unmittelbar nach der Samengewinnung >50%, Anteil vorwärtsbeweglicher Spermien nach dem Auftauen
≥35%), in der Gruppe 2 die Hengste, die diese Auftaueigenschaften (<35% bis 10%) nicht erfüllten.
1.) Gruppe 1: Hengste mit guter Tiefgefriereignung (n = 5) 2.) Gruppe 2: Hengste mit schlechter Tiefgefriereignung (n = 5)
Die weiteren 12 Hengste wurden in den Vorversuchen eingesetzt.
3.1.2 Ejakulatgewinnung
Die Samenentnahme erfolgte mittels künstlicher Scheide (Modell „Hannover“, KLUG 1993)) an einem Phantom (Modell „Celle“, (KLUG 1993)) in Anwesenheit einer rossigen Stute. Für jede Samenentnahme wurde eine Einmalschlauchfolie (Fa.
Minitüb®, Tiefenbach) in die künstliche Scheide eingezogen. Als Auffanggefäße dienten sterile, skalierte Glasflaschen, die mit einem Gazefilter (Fa. Minitüb®, Tiefenbach) versehen waren, um grobe Verunreinigungen und die Schleimfraktion vom Rest des Ejakulates abzutrennen.
3.1.3 Ejakulatbeurteilung
Im direkten Anschluss an die Gewinnung des Ejakulates wurden im Rahmen der makroskopischen Beurteilung das Volumen, die Farbe und die Konsistenz bestimmt sowie das Vorhandensein von Beimengungen überprüft. Die Dichtebestimmung erfolgte mit Hilfe eines Photometers („SpermaCue“, Fa. Minitüb®, Landshut). Durch Multiplikation von Volumen und Dichte wurde die Gesamtspermienzahl errechnet.
Die Motilität des Nativsamens sowie der verdünnten Frischspermaprobe wurde durch visuell-mikroskopische Schätzung mit Hilfe eines Phasenkontrastmikroskops (BX 60, Fa. Olympus, Hamburg) bei 200-facher Vergrößerung beurteilt, wobei der Objekttisch (HAT 400, Fa. Minitüb, Tiefenbach) konstant bei einer Temperatur von 37°C gehalten wurde. Die Spermien wurden anteilig in vorwärts-, orts- und unbewegliche Spermatozoen eingeteilt.
Vor der weiteren Bearbeitung der Proben wurden von jedem Ejakulat 2 ml des Nativspermas in ein verschraubbares Plastikgefäß (Fa. Eppendorf, Hamburg) gefüllt und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die weitere Lagerung bis zur Analyse der Spermachromatinstruktur (SCSA™) erfolgte in flüssigem Stickstoff bei -196°C.
Die Ejakulate wurden nun mit dem modifizierten Magermilchverdünner INRA 82 (MAGISTRINI et al. 1992, Zusammensetzung s. Anhang) 1:1 verdünnt, wobei jeweils
1-2 ml des Ejakulates separat auf eine Dichte von 50 Mio. Spermien/ml verdünnt wurden und die Motilität des frischen Spermas ermittelt werden konnte.
3.1.4 Aufbereitung der einzelnen Ejakulate
Das mit modifiziertem Magermilchverdünner 1:1 verdünnte Ejakulat wurde in Zentrifugengläser gefüllt und zehn Minuten bei 600 x g zentrifugiert (Labofuge Heraeus, Osterode). Nach Zentrifugation und Dekantieren des Überstandes erfolgte die Resuspension des Pellets mit 1-2 ml TG-Verdünner (+22°C) (Zusammensetzung s. Anhang).
Um die Dichte des Pellets zu bestimmen, wurden die Spermien in der Thomazählkammer („THOMA neu“®, Fa. Hecht, Sontheim) ausgezählt.
Die Endverdünnung der Spermiensuspensionen wurde durch tropfenweise Zugabe von TG-Verdünner (2,5 % Glycerol-Anteil am Endvolumen) erreicht. Im ersten Einfrierprozess des Hauptversuchs wurde eine Konzentration von 400 x 106 Spermien/ml eingestellt. In den Vorversuchen betrug die Konzentration 100 x 106 Spermien/ml. Bis hierher erfolgte die Aufbereitung bei Raumtemperatur (+22°C).
3.1.5 Kühlung
Nach Zugabe des TG-Verdünners wurde die in 50 ml in Sarstedtröhrchen befindliche Spermiensuspension in einen 300 ml Plastikbecher gestellt, der bis zur Höhe der Spermiensuspension mit +22°C warmen Leitungswasser gefüllt war. Der Becher wurde in eine Kühlvitrine (+5°C) gestellt, so dass die Spermiensuspension innerhalb von 120 Min. langsam auf +5°C herunterkühlen konnte . Das umgebende Wasser verhinderte Temperaturschwankungen und ermöglichte eine langsamere Kühlrate.
3.1.6 Konfektionierung der Proben
Die Spermiensuspension wurde mit Hilfe eines Abfüllautomaten (MRS-1, Fa. IMV, L´Aigle, Frankreich) in vorgekühlte 0,5 ml Kunststoffpailletten (Fa. Minitüb®, Landshut) abgefüllt und verschweißt. Der gesamte Abfüllvorgang wurde in der Kühlvitrine bei +5°C durchgeführt.
3.2 Durchführung des Vorversuches
Der Vorversuch diente der Bestimmung verschiedener äußerer Einflüsse auf den Einfriervorgang. Es wurden der Zeitfaktor während des Pailletten-Abfüllvorgangs und die unterschiedliche Positionierung im Einfrierautomaten untersucht.
3.2.1 Probanden
Für die Proben standen 12 Hengste des Niedersächsischen Landgestüts Celle zur Verfügung.
Die Gewinnung und Aufbereitung des Samens erfolgte wie unter 3.1.1- 3.1.5 beschrieben.
3.2.2 Abfüllung und Konfektionierung
Nach dem Herunterkühlen der Probe in der Kühlvitrine wurden die Spermiensuspensionen mit Hilfe eines Abfüllautomaten (MRS-1, Fa. IMV, L´Aigle, Frankreich) in die 0,5 ml fassenden Kunststoffpailletten nacheinander abgefüllt und verschweißt. Um einen Einfluss des Abfüllzeitpunktes auf den Einfriervorgang zu untersuchen, wurden zunächst von jedem aufbereiteten Ejakulat (100 ml) 14 ml abgenommen und wiederum auf 27 Pailletten verteilt (27 x 0,5 = 14 ml Endvolumen).
Die Pailletten wurden entsprechend dem zeitlichen Abschnitt des Abfüllvorganges unterteilt. So entsprachen die ersten neun Pailletten (n=9) der ersten Abfüllfraktion des aufbereiteten Ejakulates und wurden entsprechend mit dem Buchstaben A gekennzeichnet. Die mittlere Fraktion der Abfüllung (n=9) wurde mit B und die Schlussabfüllung des Ejakulates mit C gekennzeichnet (s. Abb. 1).
Abb.1: Abfüllautomat MRS-1 (Fa. IMV, L´Aigle, Frankreich) mit den drei Abfüllfraktionen (A: rote Pailletten, Anfang; B: grüne Pailletten, Mitte; C:
orange Pailletten, Ende). Im roten Behälter befindet sich die abzufüllende Spermiensuspension.
3.2.3 Aufteilung im Tiefgefrierautomaten
Um den Einfluss der unterschiedlichen Positionierung der Pailletten im Einfrierautomaten zu untersuchen, wurden die Pailletten während des Einfrierprozesses an neun verschiedenen Positionen gelagert. Drei im Abstand von 5 cm vertikal aufeinander gestapelte Racks wurden in drei horizontale Abschnitte aufgeteilt (links, Mitte, rechts). Jede dieser neun Einfrierpositionen (drei vertikale x drei horizontale Positionen) wurde mit je einer Paillette der zeitlich versetzten Abfüllfraktionen (A, B, C) bestückt (s. Abb. 2 und s. Abb. 3).
Abb.2: Aufteilung der 0,5 ml Kunststoffpailletten (Fa. Minitüb®, Landshut) auf den Racks in drei Ebenen auf neun verschiedenen Positionen mit je einer Paillette von jeder Abfüllfraktion.
Abb.3: Lagerung im Einfrierautomaten (Minidigitcool®, Fa. IMV, L´Aigle, Frankreich) mit der Aufteilung der 0,5 ml Kunststoffpailletten (Fa.
Minitüb®, Landshut) auf den Racks an neun verschiedenen Positionen mit je einer Paillette von jeder Abfüllfraktion.
Die Pailletten wurden auf Racks in horizontaler Lage in einen Tiefgefrierautomaten mit einer Einfriergeschwindigkeit von 60°C pro Minu te von +5°C auf -140°C heruntergekühlt und ca. 15 Minuten bei -140°C gehal ten. Anschließend folgte eine manuelle Überführung in eine mit flüssigem Stickstoff gefüllte Styroporbox. Bis zur Auswertung der Proben wurden die Pailletten in einem Lagerungscontainer mit flüssigem Stickstoff bei -196°C aufbewahrt.
3.3 Durchführung der multiplen Einfrier- und Auftauzyklen 3.3.1 Aufbereitung der Proben nach den Einfrier- und Auftauzyklen
Nach dem ersten Tiefgefrierungsprozess und einer 24-stündigen Aufbewahrung im Lagerungscontainer wurden die Pailletten in einem 37°C warmen Wasserbad für 30 Sekunden aufgetaut. Es folgte die Motilitätsbestimmung (MIKA Motion Analyser Windows Version 1.1 Stroemberg. Mika, Montreux, Schweiz) und durchflusszytometrische Untersuchungen wie in Kapitel 3.5.1 und 3.5.2 beschrieben.
Die aufgetaute Spermiensuspension wurde in zwei gleich große Volumina geteilt und mit dem Merk-Laktose-Verdünner (Zusammensetzung s. Anhang) und Glycerol bzw.
INRA-82 und Glycerol auf eine Konzentration von 40 x 106 Spermien/Paillette verdünnt. Die beiden Spermiensuspensionen wurden jeweils auf einen Glycerolgehalt von 2,5% in der Endverdünnung eingestellt.
3.3.2 Kühlung und Konfektionierung
Die Kühlung und Konfektionierung erfolgte wie in Kapitel 3.1.5 und 3.1.6 beschrieben.
3.3.3 Erneute Kryokonservierung und Lagerung
Die Kryokonservierung wurde wie in Kapitel 3.1.7 durchgeführt. Die Aufbewahrung erfolgte im Lagerungscontainer mit flüssigem Stickstoff für 24 Stunden.
3.3.4 Aufbereitung der Proben nach dem zweiten Einfrier- und Auftauzyklus
Das erneute Auftauen erfolgte in einem 37°C warmen Wasserbad für 30 Sekunden.
Bei einem Teil der jeweiligen Proben wurden die Motilität analysiert (MIKA Motion Analyser) und durchflusszytometrische Untersuchungen (Kapitel 3.5.1. und 3.5.2) durchgeführt.
