Schon 1950 verfolgten McLEOD und McGEE die Idee, die Zentrifugationskraft für die Konzentration von Hengstspermien auszunutzen. Der Einfluss der Zentrifugation auf die Qualität des Hengstspermas ist abhängig von der Kombination aus Gravitationskraft und Zentrifugationsdauer (PICKETT et al. 1975 b). Je niedriger die Zentrifugalkräfte, desto geringer die Schadwirkung auf die Samenzellen. Selbst
durch geringe Zentrifugalkräfte (400 x g) ist eine ausreichende Abtrennung des Seminalplasmas zu erreichen, um die Lagerungszeit der Samenzellen entscheidend zu verlängern. Diesen positiven Einfluss der Zentrifugation auf die partielle Reduktion des Seminalplasmas von Hengstsperma mit schlechter Kühl – und Lagerungstoleranz fanden BRINSKO et al (2000) heraus.
BLACH et al. (1989) und WATSON (2000) hoben wiederum Spermienverluste und Membranschädigungen der Samenzellen als Nachteile der Zentrifugation hervor. Um das Ausmaß dieser negativen Auswirkungen abzuklären, verglich WEISS (2004) in einer Studie drei verschiedene Zentrifugationsmethoden mit unterschiedlicher Zentrifugalbeschleunigung und Zentrifugationsdauer. Laut ihm zufolge ist der Spermienverlust am geringsten und die Samenqualität nach dem Auftauen am besten, wenn der Samen vor der Kryokonservierung bei 600 x g 10 min zentrifugiert wird. Das Resultat verdeutlicht die signifikante Beeinflussung von Spermienverlust und funktioneller Membranintegrität durch die Zentrifugationsmethode. MAKLER et al. (1984) und REVELL et al. (1997) beschrieben die Kissenzentrifugationsmethode („cushion-centrifugation“) als eine Technik, die das Arbeiten mit einer hohen Zentrifugationskraft ermöglicht, um eine höhere Rückgewinnungsrate zu erreichen.
Das Schwimmen der Spermien während der Zentrifugation auf einer weichen, kissenähnlichen Flüssigkeit mit hoher Dichte mindert das Ausmaß physikalischer Schäden durch Gravitationskräfte und Pelletierung. KNOP (2006) bestätigten den positiven Einfluss hoher Zentrifugalkräfte und langer Zentrifugationszeiten in Kombination mit klaren Verdünnermedien auf die Rückgewinnungsrate. Darüber hinaus stellten sie durch ihre Untersuchungen den vorteilhaften Effekt der Kissenzentrifugationsmethode auf den Anteil akrosomreagierter bzw.
membranintakter Samenzellen heraus. WAITE et al. (2008) untersuchten den Einfluss verschiedener Zentrifugationsglasformen, Zentrifugationsverdünner und Zentrifugationskräfte und unterschiedlicher „Cushion“-Medien (Eqcellsire® Component B (Fa. IMV, L’Aigle, Frankreich), Cushion Fluid™ (Fa. Minitüb, Tiefenbach) oder OptiPrep™ (Fa. Greiner Bio-One, Axis-Shield, Oslo, Norwegen) auf die Rückgewinnungsrate und Spermienqualität nach der Zentrifugation. Sie beobachteten eine höhere Spermienmotilität nach Zentrifugation in speziell entwickelten Nipplegläsern, stellten jedoch im Vergleich zu herkömmlichen
konusförmigen Plastikzentrifugationsgefäßen eine niedrigere Rückgewinnungsrate fest (p< 0,05). Die Kissenzentrifugation mit INRA 96 (Fa. IMV, L’Aigle, Frankreich) erbrachte sowohl hinsichtlich der Rückgewinnungsrate als auch im Hinblick auf die Spermienqualität bessere Ergebnisse als die Verdünnung in einem optisch klaren Verdünner (HGLL), während die Zentrifugationskraft (400 x g vs 600 x g) und die Art des Cushion-Mediums keinen Einfluss auf diese Parameter besaßen.
2.4.1.1 Einfluss des Seminalplasmas auf die Spermienmotilität
Das Seminalplasma im Hengstejakulat hat sowohl einen positiven als auch einen negativen Einfluss auf die Spermienmotilität (PICKETT et al. 1975). Um die negativen Effekte des Seminalplasmas auf die Spermien während des Tiefgefrierens zu vermindern, muss das Ejakulat zentrifugiert und das Seminalplasma im Überstand verworfen werden (CORTEEL 1980; JASKO et al. 1991; SAMPER und MORRIS 1998). Dass die Entfernung des Seminalplasmas sich positiv auf die Überlebensrate der Spermien auswirkt, vermuteten bereits SMITH und POLGE (1950). GÖTZE (1949) fand heraus, dass die Spermien im Ejakulat mit Seminalplasma bei Zimmertemperatur nur eine Überlebenszeit von acht bis zwölf Stunden besitzen.
Auch PICKETT et al. (1975) kamen zu dem Ergebnis, dass die Lagerung von Hengstsperma ohne Seminalplasma über einen längeren Zeitraum möglich ist. Die Motilität der Spermien bleibt trotz Entfernung des Seminalplasmas erhalten (JASKO et al. 1991). MARDEN und WERTHESSEN (1956) zeigten, dass das Seminalplasma einen hemmenden Einfluss auf die Motilität von Hengstsamenzellen hat.
Hengstsperma, das ohne Seminalplasma eingefroren wurde, hat nach dem Auftauen eine höhere Motilitätsrate, als solches mit Seminalplasma (RAJAMANNAN et al.
1968). Im Unterschied hierzu ergaben die Untersuchungen von PICKETT et al.
(1975), dass ein 10%iger Anteil an Seminalplasma in der Endverdünnung zu den besten Resultaten führt. JASKO et al. (1992) bestätigten dieses Ergebnis, indem sie die Motilitäten von Hengstsperma verglichen, die kein bzw. 5-10 % Seminalplasma enthielten. Die Spermien ohne Seminalplasma zeigten nach 24-stündiger Lagerung bei + 5°C eine geringere Motilität als jene mit 5-1 0%igem Anteil. MOORE et al.
(2005) kamen zu dem Ergebnis, dass es bei 6-stündiger Lagerung vor dem
Einfrieren mit Seminalplasmakonzentrationen von 5-20% bei 20°C zu schlechteren Motilitäten (35%) kommt, als bei einer Lagerung bei 5°C (42%).
BEDFORD et al. (1994a, b) fanden heraus, dass es ohne Entfernung des Seminalplasmas und bei Zugabe von Eigelb zum Verdünner zu einer Motilitätsdepression kommt, die möglicherweise auf eine schädigende Wechselwirkung zwischen Seminalplasma und Eigelb zurückzuführen ist. Eine zweimalige Zentrifugation zur Entfernung des gesamten Seminalplasmas wirkte sich stark negativ auf die Kopfkappenintegrität und die Auftaumotilität aus (PICKETT et al.
1975).
MOORE et al. (2005) stellten ebenfalls fest, dass es bei der Rückführung des Seminalplasmas, unabhängig von der Konzentration (5- 80%), 15 Minuten vor der Verdünnung mit dem Tiefgefriersamenverdünner nach dem Auftauen zu gleichen Motilitätsergebnissen kommt wie bei eingefrorenen Spermaproben ohne Seminalplasma.
Während von verschiedenen Autoren durch die in den Nebenhodensekreten und im Seminalplasma enthaltenden Dekapazitationsfaktoren ein hemmender Einfluss auf die Kapazitation der Spermien beschrieben wurde, erläuterten SOSTARIC et al.
(2008) unterschiedliche Wirkungen der epididymalen und seminalen Sekrete auf die Fertilität der Spermien. Sie beobachteten eine geringe in vitro-Induzierbarkeit der Akrosomreaktion bei Spermien, die aus dem Nebenhodenkopf, körper oder -schwanz entnommen wurden und sahen eine physiologische Aktivierung der Spermien nach Kontakt mit dem Seminalplasma während der Ejakulation. Dies führten sie auf einen „Wascheffekt“ der Seminalplasmakomponenten zurück, die die Spermien von den Dekapazitationsfaktoren befreien, die sich während der Lagerung im Nebenhoden um die Spermien legen. Alternativ diskutierten sie eine Spermienaktivierung durch Prostasome.
KARESKOSKI und KATILA (2008) beobachteten in der spermienreichen Fraktion niedrigere DFI-Werte als in der spermienarmen Fraktion. Sie stellten einen negativen
Effekt des Seminalplasmas (Seminalplasma: Verdünner-Verhältnis 1:2) auf die Lagerungsfähigkeit des Spermas fest. Dies bestätigte die Ergebnisse von LOVE et al. (2005), die in einer Studie mit drei fertilen Hengsten keine signifikante Reduktion der Spermienmotilität, jedoch eine signifikante Erhöhung des DFI-Wertes mit zunehmender Seminalplasma-Konzentration (0, 10, 20 % Seminalplasma) in der Samenprobe feststellten.
2.4.1.2 Auswirkungen der Zentrifugation auf die Motilität und Fertilität
Während der Zentrifugation des Hengstejakulates kommt es einerseits - bedingt durch die Zentrifugalkräfte - zu Membranschäden an der Samenzelle (BLACH et al.
1989; WATSON 2000). Auf der anderen Seite ist die Zentrifugation notwendig, um eine für die Tiefgefrierung ausreichende Konzentration des Hengstsamens zu erreichen (McLEOD und McGEE 1950).
Unterschiede bei der Zentrifugation von unverdünntem und verdünntem Pferdesamen zeigten MARTIN und KLUG (1979). Sie verwendeten zur Verdünnung eine hypertone Glucose-EDTA-Lösung und eine Zentrifugationsdauer von fünf Minuten bei 1000 g. Der vorher verdünnte Samen zeigte wesentlich bessere Auftaumotilitäten als der unverdünnte Samen.
Bei der Zentrifugation von verdünntem sowie unverdünntem Samen kommt es zu einem deutlichen Anstieg der Akrosomenschädigungen. Dies stellte BAUMGARTL (1980) mit Hilfe elektronenmikroskopischer Untersuchungen fest. Auch OETJEN (1988) und HEFFE (1993) kamen bei ihren Untersuchungen zu ähnlichen Ergebnissen.
COCHRAN et al. (1984) setzten als Zentrifugationsverdünner ein Citrat-EDTA-Medium ein. Sie unterschichteten den auf 50 Millionen Samenzellen/ml verdünnten Samen mit 0,25 ml der hypertonen Glucose-EDTA-Lösung nach MARTIN und KLUG (1979) und setzten die Zentrifugationsstärke auf 400 g herab. Die Zentrifugationsdauer betrug fünfzehn Minuten. Die Auftaumotilität der in dieser Weise
behandelten Proben übertraf die mit Glucose-EDTA und höherer Kraft zentrifugierten Ejakulate. VOLKMANN (1987) vereinfachte das Verfahren von COCHRAN et al.
(1984), indem er auf die Unterschichtung der Spermien mit dem Glucose-EDTA-Medium verzichtete. Beim Vergleich beider Methoden wurden keine Unterschiede hinsichtlich der Vorwärtsmotilität nach dem Auftauen, wohl aber ein geringerer Anteil an geschädigten Kopfkappen bei Verwendung der hypertonen Glukose-EDTA-Lösung festgestellt.
PICKETT et al. (1975) erkannten, dass der Einfluss der Zentrifugation auf die Veränderung der Spermien in Verbindung mit der Gravitationskraft und der Zentrifugationszeit steht. So wirken sich, eine ausreichende Abtrennung des Seminalplasmas vorausgesetzt, Zentrifugalkräfte unterhalb von 400 g nicht negativ auf die Hengstspermien aus.
HEITLAND et al. (1996) stellten beim Vergleich von zehn verschiedenen Zentrifugationszeiten fest, dass mit Verlängerung der Zentrifugationszeit eine höhere Rückgewinnungsrate erzielt werden kann. Bei einer Zentrifugationsdauer von mehr als 20 Minuten stellten sie nur eine geringe Motilitätsdepression fest.
WEISS (2004) verglich in einer Studie drei unterschiedliche Zentrifugationsmethoden (600g 10 min, 1000g 2 min und 2000g 2min). Sie fand, dass die funktionelle Membranintegrität im aufgetauten Samen von der Zentrifugationsmethode beeinflusst wird. Bei einer Herabsetzung der Zentrifugationsdauer sollte die Beschleunigung erhöht werden, da es sonst zu einem erhöhten Spermienverlust kommt. Bei einer Erhöhung der Beschleunigung treten jedoch vermehrt Membranschäden auf. Ihre Ergebnisse zeigten, dass es zu einem geringen Spermienverlust und zu weniger Membranschäden der Hengstsamenzellen kommt, wenn vor der Tiefgefrierung eine zehnminütige Zentrifugation des Spermas mit einer Geschwindigkeit von 600g stattfindet.
2.4.2 Konfektionierung
Die Verpackungsform sollte so gewählt werden, dass ein homogenes Einfrieren und Auftauen des gesamten Inhaltes gewährleistet ist. Optimalerweise handelt es sich dabei um eine Konfektionierungsform, die über eine große Oberfläche, bei kleinem Volumen verfügt.
Zur Gewährleistung optimaler Auftaumotilitäten wurden verschiedene Konfektionierungsformen untersucht. Glasampullen mit Volumina von 1 bis 10 Millilitern können bis zu einer Temperatur von -79°C tiefgefroren werden (SZUMOWSKI 1954; ILJINSKAJA 1956). Die ersten Kunststoffpailletten wurden von NISHIKAWA et al. (1968) eingeführt. Diese verfügen über ein Volumen von 1ml und können in flüssigem Stickstoff bei -196°C gelagert werden.
KNEIßL (1993) verwendete verschiedene Konfektionierungsformen (Makrotüb 5 ml, Flachtüb 5 ml, 0,25 ml Pailletten und 0,5 ml Pailletten) bei der Anwendung zweier Einfrierverfahren (Styroporbox und computergesteuertes Einfrierverfahren). Proben aus den 0,5 ml Pailletten zeigten im Vergleich zu den anderen Konfektionierungsformen anhand des computergesteuerten Einfrierverfahrens bessere Auftaumotilitäten sowie geringere Akrosom- und Membranschädigungen.
Im Gegensatz dazu stellte SAMPER (1995) beim Vergleich der Pailletten mit den Volumina 0,5 ml, 2,5 ml und 5 ml keine Motilitätsunterschiede nach dem Auftauen fest. CROCKETT et al. (2000) bestätigten dieses Ergebnis durch einen Vergleich der Auftaumotilitäten von 0,5 ml und 2,5 ml Pailletten.
2.4.3 Einfrierverfahren
Für den Erfolg der Kryokonservierung ist eine optimale Einfriergeschwindigkeit entscheidend.
Bei der Tiefgefrierung nach MARTIN und KLUG (1979) werden die Pailletten für eine definierte Zeit auf einem Metallrost horizontal über einem Stickstoffspiegel in einer abgedichteten Styroporbox gelagert. Die Kühlrate lässt sich durch den Abstand der Pailletten zum Stickstoffspiegel variieren. Je größer die Distanz zum Stickstoffspiegel, desto niedriger ist die Kühlrate und die Endtemperatur. Bei einem Abstand von 5 cm zum Stickstoffspiegel kühlt die Paillette mit einer Geschwindigkeit von ca. 60°C pro Minute ab (HEITLAND et al. 1996).
Eine weltweit verbreitete Methode ist die computergesteuerte Stickstoffdampftechnik.
Dabei handelt es sich um ein schnelles Einfrierverfahren mit anschließender Lagerung in flüssigem Stickstoff bei -196°C
Mitte der 80er Jahre wurde erstmals Pferdesamen in computergesteuerten Automaten eingefroren (COCHRAN et al. 1984; CHRISTANELLI et al. 1984; DELIUS 1985). Die Pailletten werden dazu auf Metallroste gelegt, die horizontal übereinander im Tiefgefrierautomaten gestapelt werden. Der flüssige Stickstoff wird aus einem Druckbehälter in die Gefrierkammer geleitet. Über einen Turbinenventilator wird der zerstäubte Stickstoff gleichmäßig in der Gefrierkammer verteilt. Die Kristallisation läuft spontan in Form eines Massenseedings ab. Nach dem Erreichen der Endtemperatur werden die Pailletten in flüssigem Stickstoff bis zum Auftauen gelagert.
Bei einem Vergleich der Stickstoffdampfmethode mit dem Tiefgefrierautomaten an humanen Spermatozoen wurde ein Teil der Proben 10 Minuten über Stickstoffdampf eingefroren. Der andere Teil der Proben wurde im Tiefgefrierautomaten schrittweise mit einer Kühlrate von -1°C/ min von +20°C auf +5°C , dann mit einer Gefrierrate von -10°C/ min von +5 °C bis -80°C und danach mit -25°C / min bis -130°C gefroren und anschließend in flüssigen Stickstoff transferiert und gelagert. Darauf erfolgte eine
zweimonatige Lagerung aller Proben in flüssigem Stickstoff. Bei der Beurteilung der Morphologie der Spermien per Ausstrich zeigte sich, dass sich die Menge morphologischer Spermienschäden zwischen den Einfriermethoden nicht signifikant voneinander unterscheidet (HAMMADEH et al. 2000).
DELIUS (1985) konnte hingegen einen wesentlichen Vorteil des computergesteuerten Einfrierverfahrens feststellen, da eine schnelle Kühlrate von 25°C/ min bei Hengstspermien zu besseren Auftauresu ltaten führte als eine Tiefgefriergeschwindigkeit von 5°C/ min (RÖBBELEN 1 993). Im Allgemeinen werden Spermien mit relativ hohen Einfriergeschwindigkeiten, die in der Größenordnung von 15 bis 60°C/ min liegen, tiefgefroren (COCHRAN et a l. 1984; PALMER und MAGISTRINI 1992; WÖCKENER et al. 1992). Mit diesen empirisch ermittelten Einfriergeschwindigkeiten lassen sich die besten Überlebensraten von Samenzellen nach Kryokonservierung erzielen.
Bei der direktionalen Gefrierung („directional soldification“), einer speziellen Methode des computergestützten Einfrierens, wird das biologische Material kontrolliert mit vorher eingestellter Geschwindigkeit heruntergekühlt. Diese Technik wurde 1985 von RUBINSKY und IKEDA entwickelt, die die ersten Versuche mit Erythrozyten in 0,9
%-iger Kochsalzlösung durchführten. RUBINSKY et al. (1991) froren experimentell Oozyten von Schweinen mit der direktionalen Gefrierung ein. Wesentliche Unterschiede der direktionalen Gefriermethode im Vergleich zur etablierten Tiefgefrierung im Tiefgefrierautomaten sind die deutlich höheren Einfriergeschwindigkeiten und die Art der Gefrierung. Während das Gefriergut bei der Tiefgefrierung in einem Tiefgefrierautomaten in Form eines Massenseedings ungesteuert und inhomogen tiefgefroren wird, erfolgt bei der direktionalen Gefrierung eine gesteuerte, partiell fortschreitende Gefrierung (RUBINSKY und IKEDA 1985).
Die Einfrierapparatur (Harmony CryoCare -Multi Thermal Gradient 516®, MTG 516®, Fa. IMT, International Ltd, Chester, GB) besteht aus zwei Kupferblöcken, die durch einen Spalt getrennt sind. In den Blöcken sind zur Aufnahme der Gefrierröhrchen Aussparungen eingeschliffen. Die Röhrchen werden in den ersten Kupferblock bei einer Temperatur von +5°C eingelegt. Die Auslösung eines initialen Seedings geschieht, wenn die Röhrchenspitze in den zweiten Block (-50°C) vorgetrieben wird.
Danach erfolgen der weitere Vortrieb und die direktionale Gefrierung bei konstanter Geschwindigkeit. Abschließend werden die Röhrchen manuelle in flüssigen Stickstoff überführt (RUBEI et al. 2004). Durch spezielle Glasröhrchen, die sog. Hollow Tubes®, ist es möglich, eine Menge von 10 ml einzufrieren. Experimentell wurden Volumina von 12ml eingefroren. Bei Bullenspermatozoen wurden dabei Auftaumotilitäten von 75 % erreicht (ARAV et al. 2002).
Auch ZIRKLER (2005) zeigten die Möglichkeit, Pferdespermien mittels direktionaler Gefriertechnik in Hollow-Tubes® zu kryokonservieren. Sie verglichen die Kryokonservierung mittels konventioneller Gefrierung in 0,5 ml Pailletten mit der direktionalen Gefriertechnik in Hollow-Tubes®. Die Auftauqualitäten der in den beiden Konfektionierungsformen tiefgefrorenen Spermaproben unterschieden sich hinsichtlich des Anteils vorwärtsmotiler Spermien, der kurvolinearen Geschwindigkeit, der linearen Geschwindigkeit, der mittleren Geschwindigkeit der Spermien und des prozentualen Anteils an DFI-Spermien nicht signifikant voneinander.
SARAGUSTY et al. (2007) erzielten hingegen bei der Kryokonservierung von Pferdespermien in Glas-Tubes mittels direktionaler Gefriertechnik bessere Ergebnisse als in 0,5 ml Pailletten mit der konventionellen Gefrierung. Die Unterschiede waren folgende: 12,8 % bessere Spermienmotilität, 14,4% besserer akrosomaler Status der Spermien und 9,7% bessere Spermienmembranintegrität.