Enzymgekoppelter Immunoassay (ELISA)

Allgemeines

Es gibt zahllose Methoden, die auf der Antigen-Antikörper-Bindung beruhen. Als erster Immunoassay gilt der von Yalow und Berson [226] beschriebene Radio-immunoassay. Daraus wurden viele verschiedene Arten von quantitativen Immu-noassays abgeleitet, die meisten zunächst mit einem medizinischen Hintergrund [227]. Der wahrscheinlich prominenteste Vertreter unter den Immunoassays ist der enzymgekoppelte Immnoassay (ELISA, enzyme-linked immunosorbent

as-say). Er spielt nicht nur bei klinischen und biochemischen Untersuchungen eine Rolle, wie bei der oben bereits geschilderten Gewinnung von Antikörpern (Ab-schnitt 2.2.3) [228], sondern hat als schnelle und kostengünstige Methode auch Einzug in die Umweltanalytik gefunden (z. B. [170, 229-231]).

ELISA haben gegenüber den Radioimmunoassays den Vorteil, dass hier an-stelle von radioaktiven Isotopen (meist ¹²⁵I oder ³H [232]) Enzyme zur Markierung des Analyten oder des (sekundären) Antikörpers verwendet werden. Daneben führt der Einsatz von Enzymen durch Ausnutzen der von ihnen katalysierten Re-aktion zu einer Amplifikation des Signals, was die Grundlage für die hohe Emp-findlichkeit des ELISA ist. Immunoassays können theoretisch eine Empfindlich-keit von bis zu 10^-15 bis 10^-16 mol L^-1 bzw. in der kompetitiven Variante bis zu 10^-14 mol L^-1 erreichen [233]. Die ersten ELISA sind parallel etwa 1971 entstan-den. Engvall und Perlmann [234] setzten Alkalische Phosphatase und als chro-mogenes Substrat p-Nitrophenylphosphat für ihren Assay ein. Avrameas und Guilbert [235] verwendeten Meerrettich-Peroxidase (HRP) mit H₂O₂/o-Dianisidin (3,3′-Dimethoxybenzidin) als chromogenes Substrat. Diese beiden Enzyme sind bis heute üblich als Marker, seltener werden -Galactosidase, Glucoseoxidase und andere eingesetzt. Daneben stehen diverse Chromogene, wie z. B. das be-reits in Abschnitt 2.1.2 erwähnte ABTS, zur Verfügung, wobei die höchste Emp-findlichkeit mit H₂O₂/3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin (TMB) für HRP erreicht wird [232, 233], das auch in dieser Arbeit verwendet wird [236]. Mit fluorimetrisch nachweisbaren Substraten wie H₂O₂/3-(4-Hydroxyphenyl)propionsäure für HRP oder 4-Methylumbelliferylphosphat lässt sich die Testempfindlichkeit um das Zwei- bis Zehnfache erhöhen [232, 233].

In dieser Arbeit verwendete ELISA-Formate

In der vorliegenden Arbeit werden zwei Formate des heterogenen, kompetitiven ELISA angewandt: der direkte und der indirekte. Der Ablauf beider ist in Abbil-dung 2.4 dargestellt, wobei die Größenverhältnisse nicht der Realität entspre-chen. Nach allen Schritten (außer dem Entwicklungsschritt) folgen Waschschritte.

Die hier gewählte Bezeichnung des direkten und indirekten Immunoassays ist keineswegs allgemeingültig. Nicht selten werden Immunoassays über die Art und Weise der Detektion mittels der Antikörper definiert [176, 232].

ELISA sind Festphasenassays und werden in Mikrotiterplatten aus Polystyrol durchgeführt, welches eine hohe Bindekapazität für Proteine hat. Die Adsorption der Proteine beruht hauptsächlich auf hydrophoben Wechselwirkungen [232]. Im direkten Fall werden die Analyt-spezifischen Antikörper, vermittelt durch sekun-däre Antikörper (-IgG), auf dem Träger immobilisiert (Beschichtung und Serum-inkubation). Es wird außerdem ein Enzym-markierter Analyt, auch Tracer ge-nannt, benötigt. Dieses HRP-Konjugat wird, ebenso wie das für den indirekten ELISA notwendige Analyt-Protein-Konjugat (hier: OVA), durch kovalente Kopp-lung des entsprechenden Haptens an die Proteine analog zur Synthese des Im-munogens (Abschnitt 2.2.1) hergestellt. Das Analyt-OVA-Konjugat wird beim indi-rekten Assay als erstes in der Mikrotiterplatte immobilisiert. Nach dieser

Be-schichtung folgt ein Blockierungsschritt mit preisgünstigen und gut verfügbaren Proteinen wie Casein, durch welche unspezifische Bindungen der Antikörper an noch freie Stellen der Plattenoberfläche in den nachfolgenden Schritten verhin-dert werden.

Wegen dieses zusätzlichen Schritts dauert die Durchführung des indirekten ELISA auch länger als die des direkten. Ein Vorteil des indirekten Assays kann aber sein, dass die Probe nicht in Kontakt mit dem empfindlichen Enzym kommt.

Während beim direkten ELISA der Analyt markiert ist, wird im indirekten der se-kundäre Antikörper (-IgG-HRP) markiert. Das bedeutet, dass im entscheiden-den Kompetitionsschritt im direkten Testformat der freie Analyt aus der Probe mit dem HRP-Konjugat um die begrenzte Zahl der selektiven Bindungsstellen der immobilisierten Antikörper konkurriert. Das gebundene HRP-Konjugat dient schließlich der Detektion. Im indirekten ELISA erfolgt die Konkurrenzreaktion zwischen dem freien Analyten und dem immobilisierten OVA-Konjugat um die Antigenbindungsstellen der ebenfalls frei in Lösung befindlichen Antikörper aus der Serumverdünnung. Detektiert wird dann der an das OVA-Konjugat gebunde-ne Antikörper mit Hilfe des -IgG-HRP.

Der letzte Schritt, die Entwicklung des Assays, sowie seine Auswertung sind für beide ELISA-Formate identisch. Die photometrische Endpunktbestimmung des gebildeten gelben Farbstoffs erfolgt nach Absenkung des pH-Wertes, wodurch einerseits die Enzymreaktion gestoppt wird und andererseits der in An-wesenheit von HRP und Wasserstoffperoxid aus TMB entstandene, zunächst blaue Farbkomplex zerfällt [237]. Hohe Extinktionen entsprechen in den kompeti-tiven Assays niedrigen Analytkonzentrationen und geringere Extinktionswerte höheren Konzentrationen des Analyten. Die Auswertung über eine 4-Parametergleichung (Gleichung 4, Abschnitt 3.3.5) [238], die einen sigmoidalen Kurvenverlauf beschreibt, gilt schon lange als allgemein anerkannt [239]. Sie ist vergleichbar mit Dosis-Wirkungs-Kurven aus der Pharmakologie [47], weswegen die Konzentration im Wendepunkt der Kurve (Parameter C oder C-Wert in Glei-chung 4), auch als mittlere inhibitorische Konzentration (IC₅₀) angegeben werden kann. Dieser Testmittelpunkt kann direkt zur Abschätzung der Affinität der Anti-körper (Gleichung 5) [240, 241] sowie zur Bestimmung der Kreuzreaktivität (Glei-chung 7) [242] herangezogen werden. Die Werte der 4-Parameterglei(Glei-chung hel-fen außerdem bei der Beurteilung des Messbereichs durch die Erstellung eines Präzisionsprofils nach Ekins (Gleichung 6) [243], da durch den sigmoidalen Kur-venverlauf die Werte mit den höchsten Steigungen (um den Testmittelpunkt her-um) die höchste Genauigkeit aufweisen und die Messunsicherheit zu höheren und niedrigeren Konzentration hin teils drastisch zunimmt. Zur Bestimmung der Nachweisgrenze der ELISA wird verbreitet das Signal des Nullwerts (blank), das auch dem A-Wert der 4-Parametergleichung gleichgesetzt werden kann, abzüg-lich seiner dreifachen Standardabweichung betrachtet [244, 245].

direkt indirekt Beschichtung

18-25 h Blockierung

1 h —

Seruminkubation 1 h

—

Kompetition 30 min

-IgG-HRP 30 min

—

Entwicklung bis zur Blaufär-bung, dann Stop-pen

Mikrotiterplattenoberfläche -IgG TATP-OVA-Konjugat Blockpuffer

polyklonale TATP-Antikörper TATP-HRP-Konjugat

-IgG-HRP

TATP Entwicklung

Abbildung 2.4: Schema des direkten und indirekten TATP-ELISA.