3 Experimenteller Teil
4.7 BSA-Zusatz und andere Optimierungen
Verwendung von BSA
Die Optimierung der TATP-ELISA beschränkte sich vor allem auf die verwende-ten Proteine wie BSA als Pufferzusatz oder die Auswahl der in Abschnitt 3.3.3 synthetisierten TATP-Proteinkonjugate. Als Puffer für die Proteinlösungen diente stets PBS, der verbreitetste und wahrscheinlich meist verwandte Puffer bei bio-chemischen Methoden. Schon in vorangegangenen Abschnitten, wie in Abschnitt 4.4 bei der Verfolgung der Immunisierungsverläufe durch Optimierung der Se-rum- und HRP-Konjugat-1-Verdünnungen oder bei der Betrachtung des Einflus-ses von Lösungsmitteln in Abschnitt 4.6, standen die Parameter A und C der 4-Parameteranpassung (Gleichung 4) im Mittelpunkt. Auch nachfolgend wurden diese zur Bewertung der Signalintensität (maximale Extinktion) und der Test-empfindlichkeit anhand des Testmittelpunkts herangezogen. Dazu wurden fast ausschließlich direkte ELISA mit Kaninchenserum durchgeführt.
Zunächst wurde der Einfluss von BSA in Verdünnungen des HRP-Konjugat 1 auf den ELISA untersucht. Da die HRP-Konjugate üblicherweise in Guardian ge-lagert (und 1:100 vorverdünnt) wurden und dieser HRP-Stabilisator sehr
wahr-scheinlich auch BSA oder andere Proteine enthält, wurde die Guardian-freie Rückstellprobe verwendet (Abschnitt 3.3.3), um auch die Auswirkung komplett ohne zusätzliche Proteine zu sehen. Tabelle 4.12 zeigt für die Seren beider Ka-ninchen (Boost 7) ähnliche Resultate und macht deutlich, dass schon ein gerin-ger Proteinanteil aus dem Guardian in PBS (ein Tausendstel aus der 1:100-Vorverdünnung; HRP-Konjugat-1-Endkonzentration: 1:100 000) zu einer signifi-kanten Signalerhöhung (Parameter A) führt. Mit 0.1% (w/v) BSA in den HRP-Konjugat-1-Verdünnungen wurden die höchsten Signalintensitäten erreicht, wo-bei sie ohne die Lagerung und Vorverdünnung des Konjugats in Guardian noch etwas höher lagen. Ein Grund dafür kann nicht angegeben werden. Da aber der größte Teil der hergestellten HRP-Konjugate in Guardian gelagert wurde und der Unterschied nicht sehr groß ist, wurde dennoch weiterhin damit gearbeitet. Es ist jedoch fraglich, wie sinnvoll der Einsatz von Guardian ist, dessen Zusammenset-zung nicht bekannt ist. Offensichtlich scheint die Stabilität der sowohl mit als auch ohne Guardian aufbewahrten HRP-Konjugate seit über zwei Jahren ge-währleistet. Ein Effekt auf den Testmittelpunkt (IC50) konnte hier nicht festgestellt werden.
Tabelle 4.12: Einfluss von BSA und Guardian-Stabilisator in HRP-Konjugat-1-Verdünnungen auf den TATP-ELISA.
Lagerung des HRP-Konjugat 1
HRP-Konjugat-1-Verdünnung in Parameter A IC50 [µg L-1] Kaninchen 1
ohne Guardian PBS 0.563 ± 0.009 0.47 ± 0.07
Guardian PBS 0.758 ± 0.003 0.53 ± 0.02
ohne Guardian 0.1% BSA/PBS 1.178 ± 0.029 0.58 ± 0.13 Guardian 0.1% BSA/PBS 0.001 ± 0.012 0.55 ± 0.06
Kaninchen 2
ohne Guardian PBS 0.629 ± 0.019 0.43 ± 0.11
Guardian PBS 0.707 ± 0.015 0.48 ± 0.08
ohne Guardian 0.1% BSA/PBS 1.057 ± 0.021 0.36 ± 0.06 Guardian 0.1% BSA/PBS 0.001 ± 0.034 0.41 ± 0.11
Parameter A wurde normiert, indem der Wert aus der Kalibrierkurve mit in 0.1% BSA/PBS verdünntem und ohne Guardian gelagertem HRP-Konjugat 1 auf eins gesetzt und die anderen Werte entsprechend angepasst wurden.
Da eine BSA-Zugabe den TATP-ELISA bezüglich der Signalhöhe erheblich ver-besserte, sollte nun auch geprüft werden, welchen Einfluss die Menge des zu der HRP-Konjugat-1-Verdünnung (mit Guardian aus Lagerung und 1:100-Vorverdünnung) zugegebenen BSA hat. Anhand von Tests mit Kaninchen 2, Boost-7-Serum konnte mit zunehmender BSA-Konzentration in den HRP-Konjugat-1-Verdünnungen ein Anstieg der Signalintensität gemessen werden.
Außerdem zeigt Tabelle 4.13 eine leichte Verbesserung des IC50, was in den obigen Ergebnissen aus Tabelle 4.12 nicht beobachtet werden konnte.
Tabelle 4.13: Einfluss der BSA-Menge in HRP-Konjugat-1-Verdünnungen auf den TATP-ELISA.
% BSA/PBS zur
HRP-Konjugat-1-Verdünnung Parameter A IC50
[µg L-1]
0 0.634 ± 0.012 0.81 ± 0.12
0.001 0.793 ± 0.016 0.78 ± 0.12
0.01 0.881 ± 0.021 0.70 ± 0.13
0.1 0.001 ± 0.026 0.56 ± 0.10
Parameter A wurde normiert, indem der Wert aus der Kalibrierkurve mit in 0.1% BSA/PBS verdünntem HRP-Konjugat 1 auf eins gesetzt und die ande-ren Werte entsprechend angepasst wurden.
Kaum anders verhält es sich mit BSA in den Serumverdünnungen, präsentiert für Boost-7-Serum von Kaninchen 1 in Tabelle 4.14. Während der IC50 wenig darauf reagierte, konnte die Signalintensität durch nur 0.005% (w/v) BSA in der Serum-verdünnung nahezu verdoppelt werden. Der Einfluss des BSA in der Serumver-dünnung ist so beträchtlich, dass der Effekt des BSA in der HRP-Konjugat-1-Verdünnung nicht hervortritt. In den vorangegangenen Versuchen enthielten die Serumverdünnungen bereits 0.005% (w/v) BSA.
Aus unbekannten Gründen führte BSA in den Verdünnungen, sowohl in denen für die Seren als auch für das HRP-Konjugat 1, zu einer beachtlichen Zunahme der Signalintensität und damit Verbesserung des TATP-ELISA. Auch wenn der Einfluss auf die Testempfindlichkeit, wenn überhaupt vorhanden, eher marginal ist, so lohnt sich der Einsatz von BSA dennoch. Es ermöglicht, dass die wertvol-len Seren stärker verdünnt werden können, u. a. auch, weil es die Antikörper vor dem Aggregieren schützt [322], was auch aus wirtschaftlichen Gründen günstig ist.
Tabelle 4.14: Einfluss von BSA in Serum- und HRP-Konjugat-1-Verdünnungen auf den TATP-ELISA.
Serum-Verdünnung in
HRP-Konjugat-1-Verdünnung in Parameter A IC50
[µg L-1]
PBS PBS 0.579 ± 0.008 0.56 ± 0.07
PBS 0.1% BSA/PBS 0.551 ± 0.011 0.57 ± 0.11 0.005% BSA/PBS PBS 1.049 ± 0.017 0.48 ± 0.07 0.005% BSA/PBS 0.1% BSA/PBS 0.001 ± 0.020 0.44 ± 0.08
Parameter A wurde normiert, indem der Wert aus der Kalibrierkurve mit in 0.005% BSA/PBS verdünntem Serum und in 0.1% BSA/PBS verdünntem HRP-Konjugat 1 auf eins gesetzt und die anderen Werte entsprechend angepasst wurden.
Es zeigte sich, dass BSA sich stabilisierend auf den TATP-ELISA insgesamt auswirkte. Für den Assay mit Mausserum sowie im indirekten Format mit Seren beider Spezies wurden ebenfalls dieselben Verbesserungen beim Einsatz von BSA in den Verdünnungen von Serum und HRP-Konjugat 1 bzw. -IgG-HRP festgestellt. Generell ist es nicht selbstverständlich, dass BSA sich positiv auf einen Assay auswirkt, wie u. a. bei Baermann [306] zum Ochratoxin-A-ELISA zu lesen. Dort wurde festgestellt, dass BSA in den HRP-Verdünnungen den
Kompe-titionsschritt empfindlich stört, da BSA zwei hochaffine Bindungsstellen für Ochratoxin A besitzt. Aufgrund der Untersuchungsergebnisse kann hier davon ausgegangen werden, dass TATP nicht signifikant von BSA gebunden wird.
Dennoch wurde auf eine weitere Erhöhung des BSA-Gehalts über die ausgewie-senen BSA-Anteile in Lösungen hinaus verzichtet, denn wegen der starken Schaumbildung schon bei geringen BSA-Gehalten wird das Pipettieren der Lö-sungen schwer kontrollierbar. Bei einem Füllvolumen von 200 µL für die Serum-verdünnungen waren nicht über 0.005% (w/v) BSA handhabbar. Aufgrund des kleineren Pipettiervolumens von 50 µL für die HRP-Konjugat-1-Verdünnungen konnten trotz der Schaumbildung 0.1% (w/v) BSA eingesetzt werden, ohne nega-tive Folgen für den TATP-ELISA durch Pipettierfehler zu provozieren.
HRP-Konjugate
Ähnlich den Versuchen zur Kreuzreaktivität und Lösungsmitteltoleranz wurden auch die ungekoppelten Proteine HRP und OVA auf etwaige Beeinflussung des ELISA untersucht (Abschnitt 3.3.5). Die Ergebnisse (n = 4) der Tests mit Kanin-chen-1-Serum (Boost 11) sind in Abbildung 4.15 grafisch dargestellt, wobei die Kurven von TATP und OVA schon vor der Normierung auf eins auf demselben Niveau verliefen und nur die von HRP diesbezüglich angepasst wurde, weil hier bereits nach 3 min (statt nach 20 min) die Entwicklungsreaktion gestoppt werden musste.
Abbildung 4.15: Einfluss von HRP und OVA auf den ELISA.
Für die Verdünnungsreihe mit OVA anstelle mit TATP konnte dabei kaum ein Effekt beobachtet werden. Erst bei 1 000 000 µg L-1 fiel die ansonsten horizontal verlaufende Extinktion im Vergleich zu reinem Wasser bzw. dem Wert des Para-meter A einer TATP-Kurve (in der Abbildung 4.15 stark gestaucht) leicht ab. HRP verursachte hingegen ab 1 000 µg L-1 eine starke Signalerhöhung mit einer dem
3E-5 0.001 0.01 0.1 1 10 100 1000 1E4
0 2 4 6 8 10
HRP OVA TATP
Extinktion ( = 450 nm) (normiert)
[µg L-1] 0
TATP gegenläufigen, sigmoidalen Kurve, begünstigt durch seine eigentliche Funktion als Signal-verstärkendes Element des Assays. Da dieser Anstieg erst bei höheren HRP-Konzentrationen auftrat, kann davon ausgegangen werden, dass HRP nicht direkt an die Mikrotiterplattenoberfläche bindet, die ohnehin durch die Beschichtung mit -Kaninchen-IgG und der Inkubation der Serumver-dünnung mit BSA-Anteil blockiert sein sollte. Vielmehr wird HRP mit den bereits an der Platte gebundenen Proteinen unspezifisch interagiert haben. Negative Auswirkungen auf den TATP-ELISA sind dennoch nicht zu erwarten, wenn die maximale HRP-Konzentration von 1 000 µg L-1 bei der Verwendung der HRP-Konjugate unterschritten bleibt. Selbst bei den Tests mit Mausserum, bei denen das HRP-Konjugat 1 lediglich 1:10 000 verdünnt werden konnte, wurde mit 210 µg L-1 nur ein Fünftel dieser Konzentration benötigt. Bei TATP-ELISA mit Kaninchenseren (Boost 11: 1:300 000, Boost 7: 1:100 000) wurden nur 7-21 µg L-1 HRP-Konjugat 1 benötigt, was bis zu 150-mal unterhalb der maxima-len HRP-Konzentration liegt. Zwar wurde nur der direkte ELISA untersucht, aber es ist zu vermuten, dass es sich im indirekten ähnlich verhält, da auch hier HRP als Markierung von -IgG zur Detektion eingesetzt wurde und eine Überlagerung des Signals von unspezifisch gebundenen HRP kritisch wäre.
Insgesamt wurden im Rahmen dieser Arbeit fünf HRP-Konjugate für den TATP-ELISA hergestellt (Abschnitt 3.3.3). Bis auf HRP-Konjugat 5, welches mit-tels der Methode der gemischten Anhydride [168] entstand, wurden alle Konjuga-te über die Aktivierung des HapKonjuga-tens als NHS-EsKonjuga-ter [165, 166] synthetisiert (Tabelle 3.1). Schon in den per MALDI-TOF-MS bestimmten Kopplungsdichten des TATP-Haptens an HRP (Tabelle 4.1) spiegelten sich nicht die in den Reakti-onen eingesetzten Verhältnisse (Tabelle 3.2) wieder und sie ließen vor allem auch keine Aussage über die tatsächliche Qualität eines Konjugats für den ELISA zu (Abschnitt 4.3). Daher wurden alle Konjugate, auch HRP-Konjugat 4, welches im ELISA mit Mausserum versagte, entsprechend ihrer er-mittelten Konzentration (Tabelle 4.1) auf das Niveau von 1:200 000 verdünntem HRP-Konjugat 1 (10.5 µg L-1) gebracht und im ELISA mit Kaninchen-1-Serum (Boost 11) verglichen. Tabelle 4.15 zeigt die Ergebnisse des HRP-Konjugat-Vergleichs anhand des Parameter A und des IC50 (Gleichung 4). Wie auch erste einfache Tests mit Mausserum ergaben, wurden mit dem deshalb später aus-schließlich verwendeten HRP-Konjugat 1 die besten Ergebnisse erzielt, sowohl was die Signalhöhe als auch die Empfindlichkeit des Immunoassays betraf. HRP-Konjugat 2 war nur wenig schlechter bezüglich der Signalintensität und wurde außerdem aus demselben NHS-Ester-Reaktionsansatz angefertigt. Obwohl diese beiden Konjugate nur jeweils ein Hapten pro HRP aufwiesen, war ihre Leistungs-fähigkeit im ELISA besser als die des HRP-Konjugat 3 mit zwei TATP-Haptenen je HRP. Die geringste Extinktion erreichte HRP-Konjugat 4, was auch erklärt, warum es im schlechter funktionierenden ELISA mit Mausserum gar kein Signal hervorbrachte. Daher wurde es auch nicht mittels MALDI-TOF-MS vermessen.
Trotz einer zu HRP-Konjugat 2 identischen Signalhöhe schnitt HRP-Konjugat 5 hinsichtlich der Testempfindlichkeit am schlechtesten ab. Aufgrund der für Prote-ine drastischen Reaktionsbedingungen mit eProte-inem etwa 2.5-fachen Überschuss an DMF gegenüber Wasser während der Synthese wäre auch ein Einbruch der
Signalintensität durch einen (Teil-)Verlust der Enzymaktivität oder wegen der geringen Kopplungsdichte (< 1) nicht auszuschließen gewesen.
Tabelle 4.15: Vergleich der hergestellten HRP-Konjugate im TATP-ELISA.
TATP-Proteinkonjugat Protein:TATP-Hapten
(Kopplungsdichte) Parameter A IC50 [µg L-1] HRP-Konjugat 1 < 1:1 0.001 ± 0.017 0.47 ± 0.06 HRP-Konjugat 2 < 1:1 0.886 ± 0.019 0.36 ± 0.06 HRP-Konjugat 3 < 2:1 0.557 ± 0.008 0.81 ± 0.10
HRP-Konjugat 4 < — 0.287 ± 0.004 0.96 ± 0.10
HRP-Konjugat 5 < 1:1 0.882 ± 0.012 01.1 ± 0.10
Parameter A wurde normiert, indem der Wert aus der Kalibrierkurve mit HRP-Konjugat 1 auf eins gesetzt und die anderen Werte entsprechend angepasst wurden.
Prinzipiell ließen sich mit allen fünf HRP-Konjugaten ELISA mit Kaninchenserum durchführen, wenn auch die Konjugate 3-5 nur etwa halb so empfindliche ELISA ermöglichten wie die Konjugate 1 und 2. Insbesondere HRP-Konjugat 4 schnitt bei dieser Untersuchung schlecht ab und es soll noch einmal betont werden, dass das Verarbeiten der aktivierten NHS-Ester möglichst kurzfristig nach ihrer Herstellung erfolgen sollte und nicht erst Tage später. Obwohl die HRP-Konjugate 1 und 2 mit einem Hapten/HRP-Kopplungsverhältnis von 1:1 am effizi-entesten im TATP-ELISA arbeiteten, lässt sich aus den wenigen Daten hier keine generelle Schlussfolgerung ziehen, zumal die Kopplungsdichten allesamt mit
< 1-2 recht niedrig waren. Des Weiteren wäre zusätzlich auch eine vergleichende Betrachtung der Enzymaktivitäten der HRP-Konjugate zur umfassenden Beurtei-lung dienlich, auf die hier verzichtet wurde.
Auch die drei OVA-Konjugate (Abschnitte 3.3.3. und 4.3) können kurz anhand der Erfahrungen, die während des praktischen Arbeitens gewonnen wurden, ver-glichen werden. Genauer untersucht wurden sie jedoch nicht, da der indirekte ELISA in dieser Arbeit nur eine untergeordnete Rolle spielte. Zwischen OVA-Konjugat 1 und 2 konnte dabei kein Unterschied in der Signalintensität oder Test-empfindlichkeit festgestellt werden, wobei OVA-Konjugat 2 sehr selten benutzt wurde. OVA-Konjugat 3 unterscheidet sich durch die mehr als doppelt so hohe Proteinkonzentration sowie der Kopplungsdichte erheblich von OVA-Konjugat 1.
Durch verschieden starke Verdünnungen wurden im ELISA Konzentrationen von ca. 1.2 mg L-1 des zweifach mit Hapten gekoppelten OVA-Konjugat 1 und etwa 0.3 mg L-1 des vierfach gekoppelten OVA-Konjugat 3 eingesetzt, so dass unter Berücksichtigung der unterschiedlichen Kopplungsdichten scheinbar fast ein Ausgleich zu Stande kam und auch keine Veränderungen des IC50 bei der Ver-wendung der OVA-Konjugate bemerkt werden konnten.
Haltbarkeit der Arbeitslösungen
Bereits oben im Abschnitt zur Verwendung von BSA wurde erwähnt, dass die synthetisierten HRP-Konjugate bei 4 °C mindestens zwei Jahre stabil bleiben, unabhängig davon, ob sie in Guardian–Stabilisator oder ohne aufbewahrt
wur-den. Wegen der hohen Endverdünnungen wurden zusätzlich 1:100-Vorverdünnungen in Guardian notwendig (Abschnitt 3.3.5), die anfangs wöchent-lich erneuert wurden. Diese HRP-Konjugat-1-Vorverdünnungen erwiesen sich ebenfalls als haltbar und zeigten über einen Untersuchungszeitraum von 4.5 Monaten nicht die geringsten Veränderungen beim Einsatz im ELISA mit Ka-ninchen-2-Serum (Boost 11), weder in Bezug auf die Signalintensität noch den Testmittelpunkt (Daten nicht gezeigt).
Auch mit Kaninchenseren, die an sich wie die meisten konzentrierten Antikör-perlösungen lange (mit Natriumazid) stabil sind, wurden Versuche mit Vorver-dünnungen von Boost-5-Serum von Kaninchen 1 und 1:30 000 verdünntem HRP-Konjugat 1 unternommen. Die 1:1 000-Serumvorverdünnungen wurden in 0.1%
BSA/PBS, PBS, Reinstwasser und Pferdeserum angefertigt und an den jeweili-gen Versuchstajeweili-gen weiter auf eine 1:40 000-Endverdünnung in PBS gebracht.
ELISA mit in 0.1% BSA/PBS vorverdünntem Serum ergaben die höchsten Werte für Parameter A und die (tendenziell) niedrigsten IC50. Wie oben beschrieben wirkt sich BSA sehr günstig auf den ELISA-Verlauf aus, so dass die Immunoas-says mit Serumvorverdünnungen in PBS und Reinstwasser, die sich nahezu identisch verhielten, geringfügig schlechtere Ergebnisse als die mit BSA ergaben.
Der Einsatz von Pferdeserum, einer trüben, undefinierten Lösung, führte zu einer Verringerung des Wertes von Parameter A um ca. 40%, dafür blieb der IC50 fast unverändert im Vergleich zu in 0.1% BSA/PBS vorverdünntem Serum. Trotz die-ser Auswirkungen der zu Serumvorverdünnungen verwendeten Medien auf den ELISA traten über einen Zeitraum von drei Monaten weder Empfindlichkeits- noch Signalverluste bei der Gegenüberstellung mit dem Ergebnis des ersten Ta-ges des jeweils benutzten Vorverdünnungsmediums auf. Obwohl diese Ergeb-nisse vielversprechend waren, wurde jedoch nie eine Vorverdünnung für die Se-ren angewendet. Zum einen wechselten die SeSe-ren zunächst von Boost zu Boost, zum anderen waren die benötigten Mengen für eine komplette ELISA-Platte groß genug, um nicht zwangsläufig vorverdünnen zu müssen. Für andere Anwendun-gen, routinemäßige oder solche mit kleineren MenAnwendun-gen, kann die Möglichkeit einer Vorverdünnung oder Lagerung der Seren in diversen Medien jedoch durchaus interessant werden. Im nächsten Abschnitt über die Plattenbeschichtung und -konservierung wird auf diesen Versuch unter einem anderen Aspekt (Abbildung 4.16) nochmals eingegangen.
Eine dritte Gruppe von Lösungen, deren Langzeitstabilität für den TATP-ELISA von Bedeutung ist, stellen die Stamm- und Kalibrierlösungen von TATP dar. Bei methanolischen Stammlösungen konnten selbst nach mehr als 1.5 Jahren und bei wässrigen Kalibrierlösungen nach über sieben Monaten kein Unterschied zu frisch hergestellten TATP-Lösungen im ELISA, egal ob mit Maus- oder Kanin-chenserum, entdeckt werden. Die aufgenommenen Kurven verliefen so parallel, dass sie vollständig übereinander lagen und fast nicht unterscheidbar waren (oh-ne Abbildung). Die Stabilität von TATP-Lösungen wird auch von Pachman und Matyas [323] per HPLC bestätigt, wenn die Lösungen mit umkristallisiertem TATP angefertigt und dunkel gelagert wurden. Entscheidend ist, dass die Be-fürchtungen aus Abschnitt 4.1 nicht eingetroffen sind. Obwohl dort eindeutig
be-wiesen werden konnte, dass TATP aus dem Gasraum über wässrigen TATP-Lösungen per GC-MS nachweisbar ist und somit aus den TATP-Lösungen entweicht, scheint das keine merklichen Folgen für die Konzentrationen der TATP-Lösung und den ELISA zu haben. Plausible Gründe dafür gibt es einige: Zunächst wur-den die TATP-Lösungen weitestgehend bei 4 °C gehalten, was wur-den Dampfdruck erheblich senkt (schon bei 12 °C auf etwa ein Siebentel des Wertes von 25 °C [79]). Außerdem war der Gasraum über den Stamm- und Kalibrierlösungen er-heblich kleiner (im ungünstigsten Fall ~ 75%, eher ~ 50%) als in den Gaspha-senexperimenten (98%), so dass auch weniger TATP entweichen konnte. Insbe-sondere wurden meist sehr viel kleinere Konzentrationen für die wässrigen Kalib-rierlösungen verwendet als für die GC-MS-Untersuchungen nötig waren. Schon über der 0.5 mg L-1 TATP-Lösung konnte in der Gasphase kein TATP mehr nachgewiesen werden.
Alle Reagenzien, die speziell für den TATP-ELISA (und eventuelle andere Im-munoassayformate) notwendig sind, also die TATP-HRP-Konjugate, die polyklo-nalen TATP-Antikörper sowie die TATP-Lösungen, sind auch in Verdünnungen über viele Monate bis Jahre halt- und verwendbar. Insbesondere für eine etwaige kommerzielle Nutzung ist dies ein maßgebliches Kriterium bei der Vermarktung eines Assays, wobei Untersuchungen zur Stabilität der Komponenten bei Raum-temperatur dabei auch interessant wären. Tests dazu stehen noch aus, sind aber bei Immunoassays auch nicht gebräuchlich, da Proteine, vor allem in Lösung, generell kalt gelagert werden.
Plattenbeschichtung und -konservierung
Viele Festphasenimmunoassays bedienen sich einer Beschichtung mit polyklona-len, Spezies-spezifischen -IgG (sekundären Antikörpern). Diese ermöglichen wiederum aus einer Vielzahl von Proteinen in einem Serum oder anderen Pro-teingemischen nur den Antikörpern (IgG) die Bindung an den mit -IgG beschich-teten Oberflächen. Dadurch können mehr der gewünschten, durch die Immuni-sierung gebildeten Antikörper binden. Abbildung 4.16 präsentiert ELISA-Kurven, die ohne die erste Beschichtung der Platte mit -Kaninchen-IgG und stattdessen nur mit Kaninchen-1-Serum (Boost 5) aus den (14 Tage alten) Vorverdünnungen des vorangegangen Abschnitts erzeugt wurden. Ausgehend von diesen 1:1 Vorverdünnungen wurden durch eine 1:40-Verdünnung in PBS die 1:40 000-Endverdünnungen der Seren erreicht, so dass beim Aufgeben in die Platte zwei der Serumverdünnungen noch 0.0025% BSA (25 mg L-1) bzw. 2.5% Pferdeserum enthielten. Mit diesen brachen die Kurven des normalerweise gut funktionieren-den TATP-ELISA ein, da die sonst durch die -Kaninchen-IgG vorgenommene Antikörper-Selektion ausblieb und so alle Proteine an die Platte binden konnten.
Die Proteine (BSA oder andere Serumproteine) lagen außerdem im Verhältnis zu den Antikörpern in hohem Überschuss vor, dass letztere fast vollständig von die-sen bei der Bindung an der Mikrotiterplattenoberfläche „verdrängt“ wurden und somit die Extinktionen sehr klein blieben. Die IC50 waren aber noch bestimmbar und kaum verändert gegenüber den Kurven mit
Sekundärantikörper-Beschichtung und tendenziell auch immer noch etwas besser als die Kurven, die aus Serumvorverdünnungen in PBS oder Reinstwasser entstanden.
Abbildung 4.16: TATP-ELISA mit Kaninchenserum ohne -Kaninchen-IgG-Beschichtung und mit Serumvorverdünnungen in unterschiedlichen Medien.
Auch die Kurven mit Serumvorverdünnungen in Reinstwasser und PBS wiesen ohne vorherige Beschichtung der Platten mit -Kaninchen-IgG kaum einen Un-terschied der Testempfindlichkeit im Vergleich zu Messungen mit beschichteten Platten auf. Jedoch nahm auch hier die Signalintensität merklich, allerdings bei weitem nicht so drastisch, ab. Die durchgeführten Versuche reichen nicht aus, um die Beobachtungen zu quantifizieren, aber mit einer Verdopplung der Zeit für die Substratentwicklung konnten fast die Signalhöhen der Versuche mit Sekun-därantikörper-Beschichtung erreicht werden. Damit konnte gezeigt werden, dass die Beschichtung der Mikrotiterplatten mit -Kaninchen-IgG für den ELISA mit polyklonalen TATP-Antikörpern aus Kaninchen nicht erforderlich ist, wenn auf eine Zugabe von Proteinen zu den Serumverdünnungen verzichtet wird. Für den optimalen Verlauf des TATP-ELISA ist jedoch eine -IgG-Beschichtung zur se-lektiven Bindung von Kaninchen-Antikörpern zu empfehlen, da die Zugabe von BSA zu besseren Resultaten führt, wie oben bereits ausführlich erläutert wurde.
Bereits in Abschnitt 4.5 wurde auf die Unterschiede der sekundären Antikörper
Bereits in Abschnitt 4.5 wurde auf die Unterschiede der sekundären Antikörper