Die MTSSL-markierten SurA-Proteine wurden EPR-spektroskopisch in Gegenwart der Peptide 46 und 71 untersucht. Zunächst wurde freies MTSSL vermessen, um ein Referenz-Spektrum zu erhalten (3.5.2.2; Abb. 31).
Das in Lösung befindliche MTSSL zeigt die charakteristischen drei peaks des freien Elektrons der Nitroxid-Gruppe. Indikativ für den mobilen Zustand sind die Abstände, die peak to peak Distanzen zwischen den mittleren und äußeren peaks sowie die Höhe der äußeren peaks im Vergleich zum mittleren peak (Atkins, 1990).
Eine Vergrößerung des peak to peak Abstandes (Abstand mittlerer peak zu äußeren peaks) in Verbindung mit einer geminderten peak-Höhe, lässt auf eine verringerte Mobilität des Elektrons schließen (Steinhoff, 1988). Anschließend wurde der Erfolg der MTSSL-Markierung der SurA-Cys-Proteine (Q78C, Q106C, Q223C, N227C) mittels EPR-Spektroskopie untersucht. Die markierten SurA-Cys-Proteine wurden in Konzentrationen von 50 bis 150 µM bei 9,118 GHz mit 5 bis max. 20 mW Mikrowellen Leistung bei Raumtemperatur bestrahlt (3.5.2.2). Zur Aufnahme des EPR-Spektrums wurde ein Magnetfeld von 3195 bis 3295 Gauß (G) angelegt und die erhaltenen Kurven auf Verbreiterung bzw. Abflachen der peaks untersucht. Der Grad der Mobilität der Radikalsonde konnte durch Vergleich mit dem Referenz-Spektrum des freien Moleküls ermittelt werden.
Für alle SurA-Cys-Proteine, außer für SurAQ223C (Abb. 32C), konnte eine deutliche
Abb. 31: Typisches Triplett-Spektrum des ungepaarten Elektrons am Stickstoff der Nitroxid-Gruppe in freier Lösung in Puffer A, pH 6,7. Verstärkungsfaktor 2000, Zentrum des Spektrums 3240, Magnetfeld 3195 bis 3295 G.
Magnetfeld [G]
Amplitude
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Immobilisierung der Radikalsonde beobachtet werden. Die SurAQ223C Variante lieferte in mehreren Versuchen kein EPR-Spektrum, sondern nur unspezifisches Rauschen, welches selbst bei höchster Verstärkung nicht auf ein MTSSL-Signal schließen lies. Dies deutet darauf hin, dass die Variante SurAQ223C nicht MTSSL-markiert war. Vermutlich war die Seitenkette zu verborgen, um eine Kopplung mit MTSSL zu erlauben. Die Spektren der SurA-Cys-Proteine Q78C, Q106C und N227C (Abb. 32) zeigten eine Verbreiterung und ein Abflachen der äußeren peaks, was auf eine verminderte Mobilität der Radikalsonde hindeutet (Hoppe et al., 1982;
Hammarström et al., 2001; Steinhoff, 2004).
Abb. 32: Ortspezifische Immobilisierung der Radikalsonde MTSSL an unter-schiedlichen SurA-Cys-Mutanten, gezeigt am EPR-Spektrum des freien Radikals der Nitrxoid-Gruppe. Die SurA-Cys-Mutanten, SurAQ78C (A), SurAQ106C (A), SurAQ223C (C) und SurAN227C (D) wurden mit 1mM MTSSL in Puffer A (pH 6,7) für 1h bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend gereinigt. Alle Mutanten außer SurAQ223C weisen ein starkes EPR-Signal auf, ersichtlich aus dem Mittel-peak bei ca.
3245 G und den nach außen verbreiterten Seiten-peaks. Selbst bei maximaler Verstärkung um den Faktor 100.000 konnte kein Signal für SurAQ223C erreicht werden. Das Zentrum des Spektrums lag bei 3240, das Magnetfeld reichte von 3195 bis 3295 G. Die Messungen wurden mind. dreimal durchgeführt, gezeigt ist das Resultat einer repräsentativen Messung.
Ähnlich dem Spektrum des freien Radikals, war der Mittel-peak bei allen Mutanten außer Q223C noch vorhanden. Jedoch waren, im Vergleich zur Kontrolle, die äußeren beiden peaks deutlich niedriger und der Abstand von der Mittel-peak zu den rudimentären äußeren peaks vergrößert.
Es konnte daher davon ausgegangen werden, dass die genannten Cystein-Reste mit MTSSL gekoppelt waren und eine ortspezifische Radikalsonde an der entsprechenden Position auf der
Magnetfeld [G] Magnetfeld [G]
A B
C D
Amplitude
Amplitude Amplitude Amplitude
Magnetfeld [G] Magnetfeld [G]
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Oberfläche vorlag.
Im Fall von SurAQ78C ist eine relativ starke Immobilisierung aufgetreten, wie aus dem verbreiterten und in der Höhe geminderten Verlauf der Seiten-peaks ersichtlich ist. Der Rest 78C ist in der SurA-Struktur am Boden der Spalte lokalisiert und von Resten des unmittelbaren Umfeldes teilweise verdeckt. Das Spektrum von SurAQ106C weist einen etwas anderen Verlauf auf, was aufgrund der Struktur und der damit einhergehenden Immobilisierung zu erwarten ist.
Die Seiten-peaks sind weniger abgeflacht und näher an den Mittel-peaks gelegen, woraus auf eine höhere Mobilität der Sonde geschlossen werden kann. Im Gegensatz zum SurAQ78C-Spektrum ist der Mittel-peak im SurAQ106C Spektrum schärfer und zu gleichen Teilen ober- und unterhalb der Basislinie verteilt.
Seiten- und Mittel-peak des Spektrums von SurAN227C sind deutlich in Form und Höhe verändert. Die Seiten-peaks im Gegensatz zu denen von SurAQ106C-Spektren verbreitert und flacher. Die Mittel-peaks liegen überwiegend oberhalb der Basislinie, wie auch bei dem Spektrum von SurAQ78C. Für die Radikalsonde an der Position SurAN227C würde man ein Immobilitätszustand zwischen dem von SurAQ78C und SurAQ106C annehmen, was aus der Lage der Seiten-peaks mit einem Hochpunkt bei ca. 3220 G ersichtlich ist, während die Hochpunkte der Seiten-peaks für SurAQ78C und SurAQ106C bei 3215 G und 3230 G zu finden sind. Die Mobilität des MTSSL-markierten SurA227C ist, gemäß der Struktur, eingeschränkt, da umliegende Reste recht engen Kontakt zu der Sonde aufweisen. Diese Resultate zeigen, dass in SurA die jeweiligen Cysteinreste außer Q223C für MTSSL zugänglich waren und dass an den ausgewählten Stellen der Immobilisierungsgrad von MTSSL, der ummittelbar auf die Umgebung der Sonde schließen lässt, mit der Kristallstruktur von SurA übereinstimmt.
Die auf MTSSL-Markierung geprüften SurA-Proteine SurAQ78C, SurAQ106C und SurAN227C wurden für Experimente mit löslichen Peptiden eingesetzt. Die Proteine wurden mit einem zweifach molaren Überschuss an Peptid 46 und 71 für 2h bei Raumtemperatur bei pH 6,7 inkubiert und anschließend EPR-spektroskopisch vermessen (3.5.2.2). Die resultierenden Spektren wurden mit der Software IGOR bearbeitet und dabei mit dem Spektrum ohne Peptide vergleichen (Abb. 33 und 34).
4 Ergebnisse 99
Abb. 33: Einfluss von Peptid 46 auf EPR-Spektren von unterschiedlichen SurA-Cys-Mutanten. Die mit MTSSL markierten SurA-Cys-Mutanten wurden mit zweifach molarem Überschuß an Peptid 46 in Puffer A (pH 6,7) für 2h bei Raumtemperatur inkubiert. SurAQ78C (Oben), SurAQ106C (Mitte), SurAN227C (Unten). Gezeigt ist das jeweilige Spektrum mit (grün) und ohne Peptid 46 (schwarze Kurve).
Magnetfeld [G]
Magnetfeld [G]
Magnetfeld [G]
Amplitude Amplitude Amplitude
N227C Q78C
Q106C
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Abb. 34: Einfluss von Peptid 71 auf EPR-Spektren von unterschiedlichen SurA-Cys-Mutanten. Die mit MTSSL markierten SurA-Cys-Mutanten wurden mit zweifach molarem Überschuß an Peptid 71 in Puffer A (pH 6,7) für 2h bei Raumtemperatur inkubiert. SurAQ78C (Oben), SurAQ106C (Mitte), SurAN227C (Unten). Gezeigt ist das jeweilige Spektrum mit (rot) und ohne Peptid 71 (schwarze Kurve).
N227C Q78C
Q106C
Amplitude Amplitude Amplitude
Magnetfeld [G] Magnetfeld [G]
Magnetfeld [G]
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Es zeigte sich bei allen Messungen mit Peptid ein dem Spektrum ohne Peptid ähnlicher Kurvenverlauf. Die Abweichungen sind selbst in Gegenwart von Peptid 46, für das eine spezifische Interaktion mit SurA gezeigt wurde, nicht drastisch. Auch das Verwenden eines Puffers mit pH 8.0 als Lösungsmittel für SurA zeigte keine veränderten Kurvenverläufe. Die Spektren von mit MTSSL markiertem SurAQ78C, SurAQ106C und SurAN227C wiesen generell ein geringes Signal-zu-Rausch Verhältnis (Hammerström et al., 2001) auf. Geringe Proteinkonzentrationen sind hierfür ausschlaggebend und die verwendeten Konzentrationen scheinen am unteren Messbereich zu liegen. Aufgrund dieses Befundes sind komparative Analysen der EPR-Spektren, speziell bei geringen Abweichungen der Spektren mit Peptid, nicht immer sehr aussagekräftig. Bei einer Bindung des Peptides im Einflussbereich der ortsspezifischen Sonde wäre eine Änderung der Mobilität zu erwarten. Die Empfindlichkeit, mit der eine Sonde auf Einflüsse aus der Umgebung reagiert, ist direkt vom Immobilisationsgrad abhängig. Daher wäre es möglich, dass eine Interaktion mit dem Peptid nicht detektierbar ist, weil die Sonde bereits zu stark immobilisiert ist.
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