Die bisherigen Daten (4.1.3 und 4.1.4) zeigen eine Anreicherung von aromatischen Aminosäuren in von SurA gebundenen Peptiden. Bei genauerer Betrachtung dieser Peptide zeigte sich, dass die aromatischen Aminosäuren häufig in bestimmten Mustern der Form Ar-x-Ar und Ar-x-Ar-Ar-x-Ar, wobei „Ar-x-Ar“ den aromatischen Aminosäuren (F,Y,W oder H) und „x“ jeder
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Aminosäure entsprechen, auftraten. Aufgrund des geringen Datenumfangs konnte hier jedoch kein Konsensus-Bindesequenz ermittelt werden. Die Ar-x-Ar und Ar-Ar Motive waren bei 73 % der Klasse I- und 62 % der Klasse II-Peptide vorhanden, jedoch wurde in vielen Fällen neben dem Ar-x-Ar/Ar-Ar-Basismotiv noch eine zusätzliche aromatische Aminosäure in einem Abstand von 1 – 7 Resten beobachtet. Diese komplexeren Abfolgen aromatischer Aminosäuren werden hier, im Gegensatz zu dem Ar-x-Ar und Ar-Ar Motiven, als Muster bezeichnet. Es wurden vier Muster mit unterschiedlicher Anordnung von aromatischen Aminosäuren beobachtet:
Diese Muster sind schematisch auch in Abb. 21 dargestellt. Das Arn Muster 1 beinhaltet drei bis vier aufeinander folgende aromatische Aminosäuren, während in Muster 2 (Ar-x-Ar-x-Ar) aromatische Aminosäuren mit beliebigen Aminosäuren alternieren. In Mustern des Typs 2 wurde kein His gefunden. Die Muster 3 und 4, die im Prinzip eine Erweiterung der Muster 1 und 2 darstellen, wurden auch in reverser Anordnung gefunden. Aus den beobachteten Abständen der ein Motiv flankierenden aromatischen Aminosäure von maximal sieben Aminosäuren, lässt sich schließen, dass ein vollständiges Muster bis zu 11 Aminosäuren umfassen kann.
Abb. 21: Muster aromatischer Aminosäuren in SurA-bindenden Peptiden. Die C-terminal über einen Linker an Zellulose verankterten Peptide (13mere) sind schematisch linear dargestellt. Die zwei Motive mit der Sequenz Ar-Ar (a) oder Ar-x-Ar (b), mit Ar = F,Y,W oder H, x = jede Aminosäure, können Anordnungen aromatischer Aminosäuren in einer Reihe (c), in jeder zweiten Position (d, kein H ist beteiligt) oder mit einer flankierenden aromatischen Aminosäure bilden (e und f). Der Abstand zwischen einem Motiv und flankierenden aromatischen Aminosäuren kann zwei bis sieben Aminosäuren umfassen, wobei für (f) nur ungeradzahlige Abstände beobachtet wurden
Arn mit n= 3-4 Ar-x-Ar-x-Ar
Ar-Ar-xn-Ar mit n = 2 - 7 Ar-x-Ar-xn-Ar mit n = 3, 5, 7
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Weiterhin interessant ist die Anordnung der aromatischen Seitenketten im Ar-x-Ar-xn-Ar Motiv.
Mit einer flankierenden aromatischen Aminosäure, fast ausnahmslos in der Position (n) 3, 5 oder 7 bezüglich des Ar-x-Ar Motives, liegt eine ungeradzahlige Positionierung vor, die auf eine bevorzugte Orientierung der Seitenketten hinweist.
Im Vergleich zum Ar-x-Ar Motiv, kommt das Ar-Ar Motiv mit etwa der gleichen Häufigkeit in Klasse I-Peptiden vor, ist jedoch in Klasse II-Peptiden weniger zu finden (Tabelle 7). Dieser Befund könnte darauf hindeuten, dass das Ar-Ar Motiv von SurA weniger bevorzugt wird. Es ist jedoch auch möglich, dass das Ar-Ar Motiv präferentiell eher von SurA gebunden wird und daher vorwiegend in Klasse I-Peptiden zu finden ist.
Tabelle 7: Häufigkeiten von Ar-x-Ar- und Ar-Ar-Motiven in Peptiden der Bibliotheken
Aus Tabelle 7 wird weiterhin ersichtlich, dass auch einige Peptide in Klasse III ein Ar-x-Ar oder Ar-Ar Motiv tragen. Diese 51 Peptide weisen eine der nachfolgenden Eigenschaften auf, durch die die schwache oder nichtvorhandene Affinität zu SurA erklärt werden könnte. Zunächst sind fünf dieser Peptide durch die Klassifizierung gerade unter die gesetzte Grenze von 40 % gefallen. Diese Peptide hatten spot-Intensitäten zwischen 35 und 39 % und könnten daher durchaus mit SurA interagieren.
Aufgrund der terminalen Verankerung der Peptide ist es denkbar, dass Motive am C-Terminus eines Peptides für SurA nicht oder nur begrenzt zugänglich waren. Die Peptide sind über einen (ß-Ala)2 Linker auf Zellulose verankert, sodass die Nähe zur Zellulosemembran möglicherweise ein sterisches Hindernis darstellt. Dies könnte für 12 Peptide mit einem C-terminalen Ar-x-Ar oder Ar-Ar Motiv, darunter auch die C-C-terminalen Motive von LamB und OmpF, zutreffen. Für ein dem C-terminalen OmpF-Peptid ähnlichen Peptid (DNRDGNVYQF, hervorgehobene Aminosäuren sind mit dem C-terminalen Peptid von OmpF identisch), wurde allerdings auch in Lösung nur eine schwache Interaktion mit SurA nachgewiesen (Bitto und McKay, 2003). In vier Fällen wurde jedoch eine Bindung von SurA an die in den Bibliotheken benachbarten Peptiden beobachtet, so dass in diesen Fällen eine mögliche Erklärung für die geringe Affinität gegeben ist.
Des Weiteren sind 16 Klasse III-Peptide mit einem Ar-x-Ar oder Ar-Ar Motiv vorhanden, die jedoch keine zusätzliche, flankierende aromatische Aminosäure aufweisen. Ebenso gibt es aber auch 6 Peptide unter Klasse I- und II-Peptiden, fünf davon mit einem Ar-x-Ar Motiv, bei denen
Anzahl Ar-x-Ar Ar-x-Ar pro Peptid Anzahl Ar-Ar Ar-Ar pro Peptid
Gesamtbibliotheken 78 0,21 71 0,19
Klasse I-Peptide 29 0,71 35 0,85
Klasse II-Peptide 21 0,57 13 0,22 Klasse III-Peptide 28 0,09 23 0,08
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dieses auch der Fall ist. Daraus lässt sich auf eine weitere für die Bindung durch SurA relevante Eigenschaft schließen, die die Klasse I- und II-Peptide, im Vergleich zu den Klasse III-Peptiden neben dem aromatischen Motiv offensichtlich aufweisen. Es wurden weiterhin 15 Peptide gefunden, die trotz eines vollständigen Musters an aromatischen Aminosäuren, nicht unter Klasse I- und II-Peptiden gefunden wurden. Diese Peptide weisen einen erhöhten Anteil von negativ geladenen Aminosäuren im Verhältnis zu aromatischen Aminosäuren auf (≥ 0,67), was ebenfalls auf eine, die Bindung negativ beeinflussende Rolle negativer Ladung schließen lässt (vgl. Abb. 18, 4.1.3).
Es wurde von Bitto und McKay ein im Vergleich zu peri- und cytoplasmatischen Proteinen erhöhtes Auftreten des Ar-x-Ar Motivs in OMPs beobachtet und dieses Motiv als Charakteristikum der OMPs eingestuft (Bitto und McKay, 2003). Um zu überprüfen, ob auch das Ar-Ar Motiv eine erhöhte Häufigkeit in OMPs aufweist, wurde ermittelt, wie oft das Ar-Ar- oder Ar-x Ar Motiv in OMPs und in periplasmatischen Proteinen auftreten (3.6.5; Tabelle 8).
Tabelle 8: Häufigkeiten aromatischer Motive in Proteinen der Zelloberfläche von E.coli Die Proteine (35 OMPs und 118 periplasmatische Proteine) wurden von Annotationen der E. coli Cell Envelope Protein Data Collection (ECCE; http://www.cf.ac.uk/biosi/staff/ehrmann/tools/ecce/ecce.html) entnommen.
Ar-x-Ar pro 100 Aminosäuren Ar-Ar pro 100 Aminosäuren Proteine Häufigkeit von Ar [%]
Beobachtet Erwartet Varianz P-Wert Beobachtet Erwartet Varianz P-Wert Integrale OM 12,12 1,70 1,44 0,908 0,105 1,11 1,45 0,365 0,0006 Periplasmatische 7,89 0,545 0,61 0,252 0,13 0,72 0,62 0,301 0,048
MalE 10,1 1,77 1,00 - - 1,01 1,01 - -
Tatsächlich wurde, wie bereits in der Literatur beschrieben, eine leichte Erhöhung der Häufigkeit des Ar-x-Ar Motivs bei OMPs im Vergleich zu periplasmatischen Proteinen gefunden, (Bitto und McKay, 2003). Das Ar-Ar Motiv tritt in OMPs mit unerwartet niedriger Frequenz auf, und ist im Vergleich zu periplasmatischen Proteinen weniger deutlich angereichert. Somit ist das Ar-Ar Motiv nicht charakteristisch für OMPs. Das periplasmatische Protein MalE, für das bereits gezeigt wurde, dass es kein Substrat für SurA ist (Behrens et al., 2001), weist genauso viele Ar-x-Ar Motive auf 100 Aminosäuren wie OMPs auf (1,77 für MalE zu 1,70 für OMPs). Die erwartete Frequenz (1,00) ist zudem unter dem beobachteten Wert (1,77), somit kommt das Ar-x-Ar Motiv in MalE mit einer höheren als der zufälligen Frequenz vor. Dies deutet neben aromatischen Motiven auf eine zweite, bindungsentscheidende Determinante hin.