Um die Aminosäuren, die für die Interaktion mit SurA ausschlaggebend sind, identifizieren zu können, wurde die relative Häufigkeit jeder Aminosäure in den drei Klassen ermittelt und gegen ihre Häufigkeit in der Gesamtbibliothek (= 100 %) normiert (3.6.2; Abb. 17A). Eine statistische Signifikanz der Unterschiede zwischen Klasse I+II- und Klasse III-Peptide war für Ile, Leu, Val, Met, Gly, Pro, Asn, Ser, Thr, Lys, Arg und Asp mit P > 0,05 nicht gegeben. Hingegen unterschieden sich in Klasse I+II-Peptiden und Klasse III-Peptiden die Häufigkeiten für Ala, Asn, Glu, Phe, Trp, Tyr und His signifikant auf dem 1 % Niveau (P ≤ 0,01). Cys war ebenfalls in Klasse I+II-Peptiden und Klasse III-Peptiden unterschiedlich verteilt, da hier die Differenz auf dem 5 % Niveau (P = 0,041) statistisch signifikant war. Die Beobachtung, dass Pro in Klasse I-Peptiden nicht angereichert sondern eher, wenn auch nicht statistisch signifikant, abgereichert ist, bestätigt die bisherigen Befunde, nach denen ein Modell-Peptid ohne Pro von SurA als Substrat erkannt wurde (Webb et al., 2001). In den Klassen I+II liegt der Anteil Pro-haltiger-Peptide bei nur 22 %, was ebenfalls die Unabhängigkeit von Pro bei der Substraterkennung untermauert. Schließlich kann aufgrund der Abreicherung von Ala und einer fehlenden Anreicherung von Ile, Leu, und Val relativ sicher ausschlossen werden, dass allein hydrophobe Interaktionen für die Bindung der Peptide verantwortlich sind.
Keines der 16 Cysteine aus der Gesamtbibliothek wurde in Klasse I+II-Peptiden gefunden, was darauf hinweist, dass Cys nicht zur Interaktion mit SurA mit Peptiden beiträgt. Anders bei den aromatischen Aminosäuren, die in den Klasse I+II-Peptiden deutlich häufiger vorkommen als in Klasse III-Peptiden. An dieser Stelle wird darauf hingewiesen, dass His aufgrund seines aromatischen Ringes mit delokalisierten π-Elektronen hier als aromatische Aminosäure betrachtet wurde. Zur Überprüfung, ob bestimmte aromatische Aminosäuren bevorzugt in Kombination mit anderen aromatischen Aminosäuren auftreten, wurde eine statistische Analyse durchgeführt. Unter den Peptiden der Bibliotheken waren Phe, Trp und Tyr zueinander statistisch verteilt und somit nicht gekoppelt. Ebenso waren weder Trp noch Tyr mit His gekoppelt. Allerdings war His in Phe-haltigen Peptiden überdurchschnittlich oft vertreten, was auf eine Kopplung des Auftretens von His mit Phe hindeutet (P = 0,004). Trotz dieses Befundes wurde His mit in die weiteren Analysen einbezogen, da trotz der beobachteten Kopplung ein Beitrag von His zur Bindung von Peptide an SurA nicht auszuschließen ist.
Zudem enthielt nur ein geringer Anteil an Klasse I+II Peptiden (8,4 %) bzw. an Gesamtbibliotheks-Peptiden (8,5 %) beide Aminosäuren.
Die Gruppierung der Peptide der Klassen I, II und III gemäß ihrem Gehalt an aromatischen Aminosäuren (Abb. 17B) zeigt, dass der Anteil an Klasse I-+II-Peptiden mit zunehmender Zahl aromatischer Aminosäuren in den Peptiden steigt. Alle Peptide ohne aromatische Aminosäuren und alle, bis auf eins, der 111 Peptide mit einem aromatischen Rest waren in der Klasse III zu
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finden. Der Anteil von Klasse III-Peptiden sinkt jedoch bei ansteigender Zahl an aromatischen Aminosäuren, so dass letztendlich die Gruppe von Peptiden mit 5 und 6 aromatischen Aminosäuren nur noch von Klasse I-Peptiden gestellt wird. Allerdings ist zu berücksichtigen, dass eine recht große Gruppe von Peptiden mit zwei, drei oder vier aromatischen Aminosäuren sowohl Vertreter der Klasse III als auch der Klassen I+II enthält. Hier liegen also bei gleicher Anzahl an aromatischen Aminosäuren Peptide aus Klassen vor, die unterschiedliche Affinitäten zu SurA repräsentieren. Daraus kann neben den aromatischen Aminosäuren auf eine zusätzliche bindungsrelevante Determinante geschlossen werden, die zur Unterscheidung von Klasse I+II-Peptiden und Klasse III-I+II-Peptiden beiträgt.
Die relative Häufigkeit aromatischer Aminosäuren pro Peptid steigt von 1,7 bei Klasse III-Peptiden auf 2,9 bzw. 3,3 bei Klasse II bzw. Klasse I-III-Peptiden (Abb. 17C), was die Präferenz von SurA für diese Aminosäurereste unterstreicht.
Abb. 17: Analyse der Aminosäurezusammensetzung von Peptiden der Peptid-Bibliotheken von LamB, OmpF und OmpA. (A) Relative Aminosäure-Häufigkeiten in Peptiden der drei Peptidaffinitäts-Klassen: Klasse I (schwarze Balken), Klasse II (graue Balken) Klasse III (weiße Balken). Die Werte wurden gegen die Gesamthäufigkeiten der Bibliothek normiert (= 100 %). (B) Relative Häufigkeit der Peptide der Klassen I, II und III in Abhängigkeit der Anzahl aromatischer Aminosäuren in den Peptiden (Farbgebung wie oben). Die Anzahl der Peptide ist über den Balken angegeben.
C
Relative Häufigktet [%]
A
Relative Häufigktet [%]
B
Gruppenmitglieder [%]
Anzahl aromatischer Aminosäuren Anzahl aromatischer Aminosäuren
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(C) Verteilung der Peptide der Klassen I, II und III über die Anzahl aromatischer Aminosäuren in den Peptiden. Klasse I-Peptide als schwarze Kreise, Klasse II-Peptide als graue Kreise und Klasse III-Peptide als weiße Kreise dargestellt.
Die beobachtete Abreicherung von Glu (Abb. 17A) könnte darauf hindeuten, dass Ladung eine Rolle bei der Bindung spielen kann. Um dieses zu untersuchen, wurde die Nettoladung der Peptide der Klassen I-+II bzw. Klasse III mit der Anzahl der aromatischen Aminosäuren verglichen (Abb. 18). Aufgrund der geringen Datenmenge streuen die Werte für Klasse I-+II-Peptide jedoch stark und der resultierende R2-Wert für die Regressionsgerade ist mit 0,71 deutlich schlechter, als der R2-Wert (0,98) für die Regressionsgerade der Klasse III-Peptide.
Obwohl die auf Basis dieser Daten beobachteten Nettoladungsdifferenzen zwischen beiden Peptidklassen (I+II gegenüber III) daher möglicherweise nicht statistisch signifikant ist, ist es dennoch auffällig, dass die durchschnittliche Nettoladung SurA-bindender Peptide (Klasse I+II) in allen Peptidgruppen mit identischer Anzahl aromatischer Aminosäuren höher ist, als die der Nichtbindenden Peptide (Klasse III).
4.1.4 Ermittlung eines theoretisch besten Binders für SurA in den Porin Peptid-Bibliotheken
Ein weiterer Ansatz zur Auswertung der Peptid-Bibliotheken war die Berechnung der Aminosäurezusammensetzung nach Kluck et al. (2002), bei der ein „virtuell“ bester Binder, der in seiner Zusammensetzung die Charakteristika der Bibliothek berücksichtigt, ermittelt wird (Kluck et al., 2002). Dadurch wird der Beitrag jeder einzelnen Aminosäure zur Bindungsaffinität ersichtlich. Die Peptide wurden nach abnehmender relativer Affinität zu SurA geordnet und die kumulative Häufigkeit jeder Aminosäure aus der Summe der Häufigkeit einer Aminosäure in einem Peptid, geteilt durch die Summe relativer Häufigkeit einer Aminosäure in einer Bibliothek berechnet (3.6.4.). Die daraus erhaltene kumulative Häufigkeit jeder Aminosäure wurden gegen
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Abb. 18: Durchschnittliche Nettoladung der Klasse I-+II-Peptide sowie der Klasse III-Peptide in Abhängigkeit der Anzahl aromatischer Aminosäuren in den Peptiden.
Die Regressionsgerade der Klasse III-Peptide ist als rote Linie, die der Klasse I- und II-Peptide als grüne Linie dargestellt.
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die nach Affinität geordneten Peptide der drei Bibliotheken aufgetragen (Abb. 19, nur das Diagramm der LamB-Bibliothek gezeigt). Bereits in dieser Darstellung ist ein erhöhter Anteil aromatischer Aminosäuren in Peptiden hoher Affinität zu SurA zu erkennen.
Abb. 19: Kumulative Häufigkeiten von Aminosäuren der LamB- Bibliothek. Die Peptide wurden nach Affinität zu SurA sortiert, Position 1 enthält den Binder mit höchster, Position 146 den Binder mit geringster Affinität. Die kumulative Häufigkeit aromatischer Aminosäuren ist in Bindern deutlich erhöht.
Die kumulativen Häufigkeiten wurden dann mittels linearer Regression zur Ermittlung eines virtuellen Binders mit bester Affinität zu SurA herangezogen. Es wurde gemäß Kluck et al.
(2002) vorgegangen, indem die kumulativen Häufigkeiten der Peptide 26 – 104 der LamB-, 21 – 85 der OmpF- und 20 – 80 der OmpA-Bibliothek zu einer Regressionsanalyse herangezogen wurden. Der Schnittpunkt der resultierenden Trendlinie mit der Ordinate gibt die relative Häufigkeit jeder Aminosäure in einem virtuellen, theoretisch besten Binder unter Berücksichtigung der Charakteristika der jeweiligen Bibliothek wieder (Abb. 20). Es wird deutlich, dass die relative Häufigkeit der aromatischen Aminosäuren in dem theoretisch besten Binder aller drei Peptid-Bibliotheken deutlich erhöht ist (mit Ausnahme von Trp in der OmpF-Bibliothek). Die relativen Häufigkeiten der Aminosäuren eines besten Binders der Gesamtbibliothek (Abb. 20D) entsprechen qualitativ den bereits in Abb. 17A dargestellten Tendenzen, die durch Klassifizierung der Peptide auf Basis ihrer relativen Bindungsaffinitäten zu SurA erstellt wurde. Damit wurde ein Beitrag aromatischer Aminosäuren zur Bindung der Peptide durch SurA mit zwei alternativen Analyseverfahren bestätigt.
Aus Abb. 20 ist ferner die Individualität jeder Porin-Peptid-Bibliothek ersichtlich. So sind Phe in der LamB- und His in der OmpA-Bibliothek nur schwach angereichert und Trp ist in der
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OmpF-Bibliothek sogar leicht abgereichert. Die bereits in Abschnitt 4.1.3 beschriebene Abeicherung von Glu findet sich in allen drei theoretisch besten Bindern wieder, während Pro in den theoretischen OmpF- und OmpA-Peptiden deutlich abgereichert, in dem LamB-Peptid aber angereichert ist.
Abb. 20: Relative Häufigkeiten von Aminosäuren eines theoretischen Peptides mit höchster Affinität zu SurA unter Berücksichtigung der individuellen Komposition der jeweiligen Bibliothek: LamB (A), OmpF (B), OmpA (C) und der Durchschnitt aus A bis C (D).
Bei der Auswertung der Peptidklassen (4.1.3) ist Pro in den Klassen I und II leicht, wenn auch nicht signifikant abgereichert, was im Einklang mit der relativen Häufigkeit von Pro im theoretisch besten Binder der Gesamtbibliothek (Abb. 20D) steht. Met ist in allen drei Peptiden, die nach Kluck et al. (2002) ermittelt wurden, mit Werten von 1,5, 1,3, und 2,2 angereichert. Die gleiche Tendenz ist bei Klasse I- und II-Peptiden erkennbar (Abb. 17A, 4.1.3). Auch die Abreicherung von Cys in den theoretisch besten Bindern von SurA ist in Klasse I- und II-Peptiden wiederzufinden.