3.3.1 Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen
Plasmid-DNA wurde mit Restriktionsendonukleasen unter den vom jeweiligen Hersteller des Enzyms empfohlenen Temperatur- und Pufferbedingungen gespalten. Gleichzeitige Spaltungen mit mehreren Enzymen wurden unter den Pufferbedingungen durchgeführt, bei denen laut Hersteller die Endonukleasen mindestens 50 % bis 100 % Spaltaktivität besaßen. War eine Doppelspaltung wegen Inkompatibilität der Enzyme in den mitgelieferten Puffern nicht möglich, wurde die DNA nach der ersten Spaltung mit Ethanol gefällt. In der Regel wurden pro µg DNA 2 – 3 Units Enzym eingesetzt und der Ansatz für 1 – 3 h inkubiert. Wurde über Nacht inkubiert, so wurden entsprechend der Herstellerangaben entsprechend geringere Mengen an Enzym verwendet.
3.3.2 Ligation von DNA-Fragmenten
Die Ligation von DNA-Fragmenten zu einem Ligationsprodukt wurde mit einem bis zu fünffachen molaren Überschuß an DNA-Insert-Fragment gegenüber dem DNA-Vektor-Fragment durchgeführt. Verwendet wurde der T4 DNA-Ligase-Puffer unter Zusatz von BSA und ca. 2 Units T4 DNA-Ligase in einem Endvolumen von 20 µl. Die Reaktion erfolgte in der Regel über Nacht bei ca. 12 °C. Der Ligationsansatz wurde vor einer Transformation von elektrokompetenten E. coli-Zellen mit Phenol/Chloroform und mit Chloroform extrahiert (optional zur Erhöhung der Transformationseffizienz, 3.2.3.2.) und mit Ethanol gefällt (3.2.2.1) und in 20 µl Wasser aufgenommen.
3.3.3 Polymerasekettenreaktion (PCR)
Mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion steht eine potente in vitro Methode zur enzymatischen Amplifikation spezifischer DNA-Fragmente zur Verfügung (Mullis und Faloona, 1987; Saiki et al., 1988). Mit ihr ist es möglich, aus einem komplexen DNA-Gemisch heraus selektiv eine DNA-Matrize zu vervielfachen. Im ersten Schritt wird die doppelsträngige DNA-Vorlage durch Erhitzen in einzelsträngige DNA überführt (Denaturierung). Beim Absenken der Temperatur lagern sich zwei Oligonukleotid-Primer an die Matritzen-DNA an (Primer-Annealing) und flankieren die zu amplifizierenden komplementären Zielregionen. Die Primer werden mit Hilfe
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einer thermostabilen Polymerase komplementär zur ursprünglichen Duplex-DNA bei hoher Temperatur verlängert (Primer-Extension), um unspezifische Hybridisierung der Primer an die Matritze zu verhindern. Es wird eine bestimmte Anzahl an Amplifikationszyklen durchgeführt, wodurch sich die durch die beiden Primer flankierte DNA-Region akkumuliert.
Die PCR-Bedingungen mußten je nach Länge der zu amplifizierenden Sequenz sowie der Länge und des G/C-Gehaltes der verwendeten spezifischen Primer angepaßt werden. Die Reaktionen wurden in einem Gesamtvolumen von 50 µl durchgeführt. Als Matrize wurden ca. 5 – 10 ng DNA eingesetzt, in Einzelfällen war die DNA-Menge höher (bis 100 ng).
In die PCR-Reaktionsgefäße wurden 25 µl Taq-Puffer (1×) und Template DNA gegeben.
Als Mastermix wurden in einem Eppendorf Reaktionsgefäß zusammenpipettiert:
2,5 µl Puffer (10×) 1 µl 10 mM dNTP
je 1 µl Primer (10 pMol/µl) ad 25 µl Wasser
Je 25 µl des Mastermix wurden in die Reaktionsgefäße gegeben. Zur Vermeidung von Primer-Fehlpaarungen wurde der Mastermix erst nach der initialen zweiminütigen Denaturierungsphase bei 98 °C zu der Matrizen-DNA gegeben. Diese Abwandlung der PCR wird als Hot Start-PCR bezeichnet. Im Allgemeinen wurde dieser der Vorzug gegenüber der konventionellen PCR gegeben. Die Reaktionsgefäße wurden vor Plazierung in dem PCR-Cycler mit PCR-Wachs (Chill-out 14, MJ Research) oder Mineralöl überschichtet.
Die Länge und die Temperatur der einzelnen Reaktionsschritte der PCR-Zyklen, sowie deren Anzahl wurde durch die Wahl der Matrize, die Basenzusammensetzung, Länge der Primer und durch die Länge der zu amplifizierenden Sequenz bestimmt. Die Elongationsreaktion (Primer-Extension) wurde bei 72 °C durchgeführt. Die Elongationsrate von Taq-Polymerase wurde bei 1000 bp pro Minute angenommen. Die Anzahl der Zyklen betrug zwischen 20 und 30. Die Schmelztemperatur TM eines Oligonukleotids wurde nach folgender empirischer Formel (1) berechnet, welche sowohl den relativen G/C-Gehalt (% G/C) als auch die Länge der Oligonukleotide berücksichtigt:
Die errechnete Temperatur lag in der Regel zwischen 45 °C und 60 °C. Die optimale Annealing-Temperatur TA für eine Polymerasekettenreaktion wurde nach (2) bestimmt:
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C
TA = −3°
2 ) T + T
( M1 M2
(2) TM1 und TM2 stehen dabei für die Schmelztemperaturen der beiden verwendeten Primer.
Die einzelnen Zyklen für die PCR waren:
98 °C für 2 min
85 °C bis der Mastermix zugegeben war 94 °C 30s
annealing Temperatur (TA) 30 s 30 × 72 °C 1 min pro kb Produkt (Minimum 30 s)
3.3.4 Kolonie-Durchmusterung mittels PCR
Um Klonierungen auf korrekte inserts zu überprüfen, wurde teilweise eine Sonderform der PCR, die Kolonie-PCR (Hofmann und Brian, 1991) angewandt. Dabei amplifiziert man das betreffende Produkt direkt aus den Bakterien. Dadurch entfällt die vorherige Präparation der Plasmid-DNA, was eine deutliche Arbeitsersparnis mit sich bringt.
Kolonie-PCR wurde mit im Institut isolierter Taq-Polymerase oder kommerziell erhältlicher Taq-Polymerase von Invitek durchgeführt. Bei der Prozedur wurden einzelne Kolonien mit einem sterilen Zahnstocher von der Platte gepickt und separat auf eine Replikaplatte ausgestrichen. Die an dem Zahnstocher verbleibenden Bakterien wurden in einem PCR-Reaktionsgefäß in 25 µl vorgelegtem 1× Taq-Puffer resuspendiert. Die Zusammensetzung der PCR und die Bedingungen waren wie in 3.3.3 beschrieben. Durch Agarosegelelektrophorese (3.2.4) der PCR Produkte wurden dann die Plasmide der Klone, die ein insert der richtigen Länge trugen, identifiziert.
3.3.5 Quick change mutagenesis PCR (Stratagene)
Für diese Form der PCR (Nelson und McClelland, 1992; Wang und Malcolm, 1999) wurden spezielle Oligonukleotide eingesetzt, die den Austausch von Nukleotiden ermöglichen. Die Oligonukleotide, mindestens 24–28 Basen, wurden so definiert, dass an der entsprechenden Position in der DNA-Sequenz ein gewünschtes Nukleotid gegen ein beliebiges anderes ersetzt wird. Die flankierenden Bereiche um das auszutauschende Nukleotid sollten mindestens 10 Basen umfassen, damit das Oligonukleotid trotz einer möglichen Fehlpaarung mit dem auszutauschenden Nukleotid anhybridisiert.
Es wurden je 100 ng des Template, 2 pmol/µl der entsprechenden Oligonukleotide, 0,2 pmol/µl dNTP, 2,5 Units Pfu-Turbo Polymerase und Pfu-Puffer mit MgSO4 eingesetzt. Das
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Reaktionsvolumen betrug 50 µl.
PCR-Cycler Programm:
95 °C, 5’
95 °C, 30’’
55 · °C, 1’ 20 × 68 °C, 14’
68 °C, 10’
Die annealing Temperatur TA hängt von der Zusammensetzung der Oligonukleotide ab und wurde jeweils individuell angepasst (siehe 3.3.3).
3.3.6 Auffüllen von überhängenden Enden mit T4-DNA-Polymerase
Zur Erzeugung von glatten DNA-Enden wurde T4-DNA-Polymerase (MBI, Fermentas) benutzt. Die Reaktion erfolgte in einem Gesamtvolumen von 20 µl in T4-DNA-Polymerase-Puffer (MBI, Fermentas) mit 0,5 mM dNTPs und 1 Einheit (u) Enzym für 20 min im Kühlraum. Anschließend wurde die aufgefüllte DNA mittels Phenol/Chloroform Extraktion (3.2.3.2.) gereinigt und mit Ethanol gefällt (3.2.2.1).