Sowohl eosinophile Granulozyten als auch das Interleukin 31 spielen eine Rolle in der Pathogenese atopischer Erkrankungen. Daher war es Ziel der vorliegenden Promotionsarbeit, zu untersuchen, ob eosinophile Granulozyten eine Quelle für IL-31 darstellen und welchen funktionellen Einfluss das Zytokin IL-31 auf eosinophile Granulozyten hat. Aus dem Formenkreis der atopischen Erkrankungen sollte beispielhaft auf die atopische Dermatitis eingegangen werden.
4.1 Eosinophile als Quelle von IL-31
Intrazelluläres IL-31 wurde mit Hilfe der FACS Analyse und Fluoreszenzmikroskopie in Eosinophilen nachgewiesen und auf mRNA- und Proteinlevel durch PCR und Western Blot bestätigt. Zusätzlich wurde mittels ELISA gezeigt, dass Eosinophile IL-31 freisetzen. Somit wird der eosinophile Granulozyt als Quelle für IL-31 präsentiert. Außerdem konnte gezeigt werden, dass Eosinophile von Patienten mit atopischer Dermatitis signifikant höhere Konzentrationen von IL-31 freisetzen.
Durch diese Freisetzung von IL-31 können Eosinophile Nachbarzellen inklusive T-Zellen, Leukozyten, Mastzellen und epitheliale Zellen in inflammatorischen Infiltraten aktivieren.
Diese Aktivierung löst weitere Kaskaden zur Aufrechterhaltung entzündlicher Prozesse aus.
IL-31-stimulierte T-Zellen zum Beispiel produzieren vermehrt CCL2 und GM-CSF[98], wodurch die Inflammation verstärkt wird. Keratinozyten, die durch IL-31 aktiviert wurden, produzieren eine Reihe von Chemokinen, wie GRO1α (CXCL1), I-309 (CCL1), MIP-3β (CCL19), MDC (CCL22) und MIP-3 (CCL23)[73, 81], die wiederum an verschiedenen immunologischen und inflammatorischen Prozessen beteiligt sind. Basophile Granulozyten setzen nach Kontakt mit IL-31 unter anderem IL-4 und IL-13 frei[75].
In einem vergleichenden Versuch konnte außerdem gezeigt werden, dass eosinophile Granulozyten signifikant höhere Konzentrationen an IL-31 freisetzen als andere Zellen. Sie stellen somit als stärkste Quelle für dieses prurigene Zytokin einen interessanten therapeutischen Ansatz dar.
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4.2 Überleben und Zelltod
Es konnte nachgewiesen werden, dass IL-31 die Apoptose der Eosinophilen hemmt und ihre Lebenszeit deutlich verlängert. Daraus lässt sich folgern, dass IL-31 eine wichtige Rolle in der Akkumulation der Eosinophilen im Gewebe und dadurch auch in der Aufrechterhaltung des Entzündungsgeschehens spielt.
Über welchen Mechanismus IL-31 die Apoptose der Eosinophilen hemmt, wurde jedoch nicht untersucht. Ob IL-31 ähnlich wirkt wie die bekannten apoptoseinhibierenden Zytokine IL-5 oder IL-4[38], könnte z.B. über die Messung der intrazellulären Konzentration von morrbid vor und nach Stimulation untersucht werden. Hier müsste sich eine deutliche Steigerung der Konzentration der long non-coding RNA zeigen[39].
Eine Regulation der Apoptose auf dem zellspezifischen Weg durch IL-31 über das spezifische Oberflächenmolekül CD69[32] und den Fas-Liganden CD95[33] könnte durch die Untersuchung der Expression dieser Marker vor und nach Stimulation der Eosinophilen mit IL-31 untersucht werden.
Der intrazelluläre Weg der Apoptose wird beispielsweise durch die Freisetzung von intrazellulärem Wasserstoffperoxid und reaktiven Sauerstoffverbindungen induziert. Da aufgrund der vorliegenden Ergebnisse von einem antiapoptotischen Effekt von IL-31 auf eosinophile Granulozyten ausgegangen werden kann, sollte weiter untersucht werden, ob die intrazelluläre Freisetzung dieser toxischen Moleküle durch IL-31 gehemmt wird. Dazu könnte eine Kostimulation mit einem bekannten Induktor der Radikalfreisetzung durchgeführt werden.
Ob IL-31 in der Lage ist, den bekannten starken apoptoseinduzierenden Effekt von Kortison zu antagonisieren, könnte ebenfalls therapeutisch von Interesse sein und müsste in einer Kostimulation untersucht werden.
Es wurden ausschließlich Zellen nicht atopischer Probanden untersucht. Es wäre außerdem interessant zu untersuchen, welchen Effekt IL-31 auf die Apoptose von Eosinophilen atopischer Probanden hat, da bereits bekannt ist, dass die Apoptose in diesen Zellen im Vergleich zu nicht atopischen Probanden generell signifikant gehemmt ist[38].
4.3 IL-31-induzierte Chemotaxis
Da Eosinophile Gewebezellen sind, spielt ihre Rekrutierung durch Chemotaxis eine wichtige Rolle in der Aufrechterhaltung inflammatorischer Infiltrate[2].
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Erstmals konnte mit diesen Daten gezeigt werden, dass IL-31 die Chemotaxis von peripheren Eosinophilen nicht nur induziert, sondern signifikant erhöht, was wiederum durch einen neutralisierenden IL-31 Antikörper verhindert werden konnte.
Diese Erkenntnis gibt einen Hinweis darauf, dass IL-31 möglicherweise in die Rekrutierung von Eosinophilen involviert ist. Der Nachweis, dass IL-31 die Expression des Adhäsionsmoleküls CD18 an der Zelloberfläche des Eosinophilen induziert und damit die Adhäsion der Zelle am Endothel ermöglicht[99], unterstützt diese Annahme.
Chemokine, besonders CCL11, CCL24 und CCL26, gelten als verantwortlich für die Anlockung von Eosinophilen zu einem Entzündungsgeschehen[5] und darüber hinaus für die Gewebsschädigung durch die Freisetzung von reaktiven Sauerstoffspezies. Es wurde die Freisetzung von CCL26 als einen bekannten autokrinen Mechanismus zur Chemotaxisinduktion unter dem Einfluss von IL-31 untersucht. Dass eine signifikante Steigerung der CCL26 Freisetzung in Abhängigkeit von der IL-31 Konzentration gezeigt werden konnte, belegt eine wichtige Rolle des IL-31 bei der Rekrutierung von Eosinophilen.
Wie bereits in vorangegangenen Studien gezeigt, induziert IL-31 zusätzlich die Freisetzung proinflammatorischer Zytokine wie IL-1β, IL-6, IL-8, CXCL1, CXCL8, CCL2 und CCL18 aus Eosinophilen[77, 99].
IL-31 könnte durch die starke Induktion der Calciummobilisation in eosinophilen Granulozyten einen zusätzlichen, indirekten Effekt auf die Chemotaxis ausüben. Wie in der Literatur beschrieben, ist die Mobilisation von Calcium an der Chemotaxis von Eosinophilen beteiligt.
Um diesen Effekt genauer betrachten zu können, müsste eine Untersuchung der chemotaktischen Wirkung von IL-31 unter Hinzunahme eines Calciumblockers durchgeführt werden.
Es wurde bei den Versuchen zur Chemotaxis nicht zwischen atopischen und nichtatopischen Probanden unterschieden. Ob die chemotaktische Wirkung von IL-31 auf Eosinophile von Patienten mit einer Erkrankung aus dem atopischen Formenkreis stärker ist und somit für eine stärkere Akkumulation der Zellen im Gewebe sorgt, könnte bei einer differenzierten Versuchsreihe geklärt werden.
4.4 Calciummobilisation durch IL-31
Bei Aktivierung von eosinophilen Granulozyten wird intrazelluläres Calcium mobilisiert und die Konzentration an zytoplasmatischem Calcium steigt. Dieser Effekt ist unter anderem gut bekannt für C5a, CCL11 und CCL26[97].
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Die Stimulation von Eosinophilen mit IL-31 in verschiedenen Konzentrationen führte zu einer deutlichen Mobilisation von Ca2+, ähnlich wie bei CCL11 und CCL26.
Aufgrund der auf Eosinophilen nachgewiesenen Rezeptoren IL-31 RA und OSMR[77] wurde ein Anti-IL-31 RA Antikörper genutzt, um die Spezifität des Effektes von IL-31 für diesen Rezeptor zu verifizieren. Im Gegensatz zum Anti-OSMR Antikörper, der lediglich zu einer Reduktion der Calciummobilisation führte, blieb unter Anwendung des Anti-IL-31RA Antikörper der mobilisierende Effekt des IL-31 aus. Somit weisen die erhobenen Daten auf eine biologische Funktion von IL-31 in Eosinophilen hin, die über IL-31 RA vermittelt wird.
Über diesen intrazellulären Signalweg könnte IL-31 an verschiedenen Aktivitäten der Eosinophilen beteiligt sein. Die intrazelluläre Freisetzung von Calcium beeinflusst bekanntlich die Degranulation der Zellen, die Initiierung des respiratory burst und die Induktion von Chemotaxis. Der Nachweis, dass IL-31 die Chemotaxis von Eosinophilen induziert und die Freisetzung von reaktiven Sauerstoffspezies steigert, konnte bereits erbracht werden[76].
Weiterführende Untersuchungen könnten klären, ob IL-31 die Sekretion von EDN, ECP und EPO induziert.
4.5 Freisetzung zytotoxischer Eosinophilenprodukte
Es ist bekannt, dass eine der Hauptfunktionen von Eosinophilen die Gewebsschädigung durch die Freisetzung von toxischen Granulaproteinen und reaktiven Sauerstoffspezies ist[55]. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass IL-31 die Freisetzung von ROS in einem ähnlichen Maß beeinflusst wie C5a. Dadurch wird die Annahme gestützt, dass IL-31 eine Aktivierung des eosinophilen Granulozyten auslöst. Der Effekt von reaktiven Sauerstoffspezies ist von ihrer Konzentration abhängig[100]. In hoher Konzentration führen sie zu Zellschädigung. Bei niedriger Konzentration hingegen übernehmen sie eine komplexe Signalfunktion. Es wäre interessant zu untersuchen, in welchen zellulären Prozess die IL-31-induzierten ROS aus Eosinophilen involviert sind.
4.6 Limitationen der Arbeit
Aufgrund der geringen Blutkonzentration von eosinophilen Granulozyten, besonders bei nicht atopischen Probanden, war die Ausbeute an Zellen nach der Isolation sehr gering, sodass nur wenige Versuchsansätze parallel durchgeführt werden konnten.
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In den Versuchsreihen wurden Konzentrationen von IL-31 im Bereich von 1, 10, 50 und 100 ng/ml angewendet. Die Ergebnisse zeigen freigesetzte Konzentrationen von IL-31 bis maximal knapp über 125 pg/ml unter zusätzlicher Stimulation mit IL-3 über einen Zeitraum von 48 Stunden. Wie hoch die Blutplasma- oder Gewebekonzentration von IL-31 in vivo ist, wurde bislang nicht untersucht. Daher ist fraglich, ob die angewendeten Konzentrationen zu hoch sind, um eine eindeutige Aussage über die Übertragbarkeit der in vitro gemessenen Ergebnisse auf den Effekt in vivo zu treffen.
Eine nähere Untersuchung der Unterschiede zwischen atopischen und nicht atopischen Eosinophilen war aufgrund der zeitlichen Begrenzung des Projektes leider nicht mehr möglich.
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