Chromatographische Verfahren

Unter den chromatographischen Methoden werden Dünnschicht-, Flüssig- und Gaschromatographie unterschieden. Das Prinzip der chromatographischen Analyse beruht auf der Auftrennung eines Stoffgemisches durch Wechselwirkungen zwischen der stationären und der mobilen Phase. Bei allen Arten der Chromatographie wird der Trennvorgang nach der Polarität der stationären Phase in Normalphasentrennung (polare stationäre Phase) und Umkehrphasen(Reversed phase)trennung (unpolare stationäre Phase) unterteilt. Da die SC-Lipide eine große Bandbreite verschiedener Lipidklassen mit zahlreichen Subspecies unterschiedlicher Kettenlängen enthalten, ist die Umkehrphasentrennung zur chromatographischen Analyse von SC-Proben weniger geeignet, da die Kettenlänge der einzelnen Moleküle hier einen starken Einfluss auf die Auftrennung hätte (RAITH et al. 2004).

Mittels Normalphasentrennung lassen sich die Lipidgemische nach Zugehörigkeit zu ihren jeweiligen Klassen separieren (MYHER u. KUKSIS 1995), was vor allem im Hinblick auf die Ceramide von Vorteil ist, da die Ceramidklassen nach Anzahl und Position der enthaltenen Hydroxylgruppen aufgetrennt werden (RAITH et al. 2004).

Gaschromatographische Methoden werden in der epidermalen Lipidanalytik vor allem zur näheren Charakterisierung der freien Fettsäuren bzw. nach Hydrolyse auch der gebundenen Fettsäuren aus anderen Lipidklassen eingesetzt (WEERHEIM u.

PONEC 2001). Auf diese Weise können die Ceramide hinsichtlich ihrer Sphingoidbasen und gebundenen Fettsäuren näher charakterisiert werden (MOTTA

et al. 1993; YOSHIKAWA et al. 1994; ROGERS et al. 1996; RAITH et al. 2004;

POPA et al. 2010).

Die einfachste Methode zur chromatographischen Auftrennung eines SC-Lipidgemisches stellt die Dünnschichtchromatographie dar (MYHER u. KUKSIS 1995). Diese Methode ist sehr robust und wird nicht so leicht durch co-extrahierte Kontaminanten beeinträchtigt wie z. B. die Flüssigchromatographie (POOLE 1999;

RAITH et al. 2004). Weitere Vorteile liegen in der Möglichkeit der gleichzeitigen Auftrennung mehrerer Proben und der Verfügbarkeit universeller Nachweismethoden, wie z. B. das Färben der Platte mit einer Kupfersulfat- und Phosphorsäure-haltigen Lösung und anschließendem Veraschen der Lipidbanden bei großer Hitze (POOLE 1999; RAITH et al. 2004). Die Identifikation der Lipidbanden in einer Probe erfolgt über die Zuordnung zu co-migrierten Standards.

Eine Quantifizierung der Probenlipide kann durch Standardkurven erfolgen, die durch Messungen aufsteigender Konzentrationen der jeweiligen Standards berechnet werden. Um Messfehler durch experimentelle Abweichungen zu reduzieren, sollten Proben und Standards immer auf der gleichen Platte entwickelt werden (RAITH et al.

2004).

Da die stationäre Phase bei Normalphasentrennung polar ist, sollte die mobile Phase eher unpolar sein. Auf diese Weise werden die Lipidklassen nach ihrer Polarität aufgetrennt, indem polarere Lipide stärkere Wechselbindungen mit der stationären Phase eingehen und daher weniger weit auf der Platte transportiert werden als unpolarere Lipide (MYHER u. KUKSIS 1995). Die Zusammensetzung und Laufstrecke der mobilen Phase muss sich also danach richten, welche Lipidklassen analysiert werden sollen. Früher wurden die verschiedenen Lipidklassen meist getrennt entwickelt (SCHMITZ et al. 1984), wofür die Lipidfraktionen oft mittels Festphasenextraktion voneinander getrennt wurden, um bessere Ergebnisse zu erhalten (MYHER u. KUKSIS 1995). MELNIK et al. (1989) entwickelten ein HPTLC-System, mit dem alle Haupt-SC-Lipide auf einer Platte getrennt werden konnten.

Dafür wurde die Platte (20x10 cm) in drei aufeinanderfolgenden Lösungsmittelsystemen entwickelt: 1) Methanol/Chloroform/Wasser 20:95:1 (v/v/v)

über eine Länge von 6 cm, 2) n-Hexan/Diethylether/Eisessig 80:20:10 (v/v/v) über eine Länge von 8,5 cm, 3) Petroleumbenzin über eine Länge von 10 cm. Mit dieser Methode konnten allerdings nur vier Ceramidbanden identifiziert werden (MELNIK et al. 1989). Durch die Methode von IMOKAWA et al. (1991) (2x Chloroform/Methanol/Essigsäure 190:9:1 [v/v/v]) konnten die Ceramide zwar sehr gut in ihre Klassen aufgetrennt werden, jedoch war die Auftrennung der restlichen Lipidfraktionen nicht zufriedenstellend. Diese Methode wurde ursprünglich von WERTZ et al. (1985) zur Auftrennung der Ceramidklassen entwickelt und kam später in vielen Entwicklungssystemen zum Einsatz (RAITH et al. 2004).

Ein wichtiger Schritt für die Dünnschichtchromatographie war die Entwicklung der automatisierten Mehrfachentwicklung (AMD = automated multiple development), wodurch manuelle experimentelle Einflüsse, wie die Auftragung der Proben, das Mischen der mobilen Phase, die Entwicklung und Trocknung der Platten, minimiert werden konnten (RAITH et al. 2004). Die erste AMD-HPTLC-Methode für Lipide war in der Lage, alle SC-Lipidklassen auf einer Platte aufzutrennen, wobei die Ceramidklassen allerdings sehr eng benachbart lagen (BONTE et al. 1995). Ein modifiziertes AMD-HPTLC-Verfahren wurde von FARWANAH et al. (2002) beschrieben, mit dem nicht nur alle Lipidfraktionen, sondern auch alle Ceramidklassen des menschlichen SC auf einer Platte darstellbar waren.

BLECK et al. (1999) fanden durch den Vergleich zweier verschiedener HPTLC-Entwicklungsverfahren (2x Chloroform/Methanol/Essigsäure 190:9:1,5 [v/v/v] versus 1x Chloroform/Methanol/Essigsäure 190:9:1 [v/v/v] und anschließend Diethylether/Hexan/Essigsäure 80:20:1,5 [v/v/v]) heraus, dass die Entwicklungsprozedur einen Einfluss auf die Trennschärfe der Ceramidbanden hat.

Es kam zu signifikanten Unterschieden im erhaltenen Ceramidprofil gesunder Haut zwischen den beiden Entwicklungsverfahren, mit signifikant höheren Werten für CER[NS] und signifikant niedrigeren Werten für CER[EOS] und CER[AS] nach dem zweiten Lösungsmittelsystem gegenüber dem ersten System (BLECK et al. 1999).

In den bisherigen Studien zur epidermalen Lipidanalyse des Hundes wurden recht unterschiedliche Lösungsmittelsysteme zur HPTLC-Entwicklung eingesetzt. POPA et al. (2011b) trennten die Lipidgemische vor der HPTLC-Analyse durch

Festphasenextraktion mit Hilfe von Ammonium-Silica-Säulen auf. Anschließend wurden die neutralen Lipide und freien Fettsäuren mittels Hexan/Diethylether/Essigsäure 70:30:1 (v/v/v), die Ceramide mittels Chloroform/Methanol 50:3 (v/v/v) und die Gluco- und Phospholipide mittels Chloroform/Methanol/Wasser 65:25:4 (v/v/v) aufgetrennt. SHIMADA et al. (2009) und YOON et al. (2011 und 2013) trennten die SC-Lipide jeweils mittels Chloroform/Methanol/Essigsäure 190:9:1 (v/v/v) auf. REITER et al. (2009) nutzten dieses Lösungsmittelsystem innerhalb einer Dreifachentwicklung als zweite Stufe, wobei Chloroform/Methanol/Wasser 40:10:1 (v/v/v) die erste und Hexan/Ethylether/Essigsäure 70:30:1 (v/v/v) die dritte Stufe darstellten. Eine Dreifachentwicklung wurde auch von STAHL et al. (2009 und 2012) durchgeführt: 1) Chloroform/Ethanol/Essigsäure 80:18:2 (v/v/v), 2) Chloroform/Methanol/Essigsäure 91,4:4,3:4,3 (v/v/v) und 3) Hexan/Diethylether/Essigsäure 72,7:18,2:9,1 (v/v/v).

Auch flüssigchromatographische Verfahren wurden zur Analyse der SC-Lipide beschrieben, bedürfen allerdings einer aufwendigeren Probenvorbereitung (POOLE 1999). Da die Säulen im Gegensatz zur Dünnschichtchromatographie wieder verwendet werden, können in der Probe gelöste Kontaminanten die Analyse empfindlich stören (POOLE 1999). Auch die Möglichkeiten zur Detektion sind eingeschränkter als bei Dünnschichtchromatographie, sodass die Lipide entweder vor der Analyse derivatisiert werden müssen oder die Empfindlichkeit oft nicht ausreichend ist (RAITH et al. 2004).

Eine präparative Methode zur Auftrennung der einzelnen Ceramidklassen mittels HPLC wurde von GILDENAST und LASCH (1997) beschrieben. Hierbei wurden die Ceramide zunächst durch Flüssigchromatographie angereichert, indem sie von den anderen Lipidfraktionen getrennt wurden. Dann wurden die einzelnen Ceramidklassen durch HPLC aufgetrennt, welche wiederum mittels HPTLC quantifiziert wurden. Durch die HPTLC-Entwicklung fiel auf, dass viele der HPLC-Peaks mehr als eine Ceramidklasse enthielten und damit die HPLC-Auftrennung der Ceramidklassen nicht ausreichend war (GILDENAST u. LASCH 1997). Eine bessere Auftrennung der Ceramidklassen erreichten FARWANAH et al. (2003), indem

Gradienten von Chloroform und Chloroform/n-Propanol/Essigsäure 80:20:2 (v/v/v) benutzt wurden. Eine Detektion mittels Lichtstreuung war ausreichend sensitiv, wobei die Kopplung des HPLC-Systems an ein Massenspektrometer bessere Ergebnisse und zusätzlich mehr Informationen über die strukturellen Eigenschaften der Ceramide lieferte (FARWANAH et al. 2003). Diese Kombination von Flüssigchromatographie und Massenspektrometrie ermöglichte die Identifizierung bis dahin unbekannter Lipide und ist aus der heutigen Lipidanalytik nicht mehr wegzudenken (RAITH et al. 2004).