Beurteilung des Wachstums bei Überexpression von MDM33

Die galaktoseinduzierte Überexpression von MDM33 führt in Wildtypzellen zu einem Wachstumsarrest (Messerschmitt et al., 2003; siehe auch Abb. 3-12 A). Ein erster Überblick über ihren Einfluss auf das Wachstumsverhalten der 164 Testkandidaten sollte durch semiquantitative Wachstumsanalysen gewonnen werden. Hierzu wurden jeweils gleichbleibende Mengen Zellmaterial strichförmig auf SGal-Platten ausgebracht und das Wachstum nach drei Tagen Inkubation in die vier Stufen +++, ++, + und --- (Abb. 3-11) eingeteilt, wobei +++ das stärkste und --- das schwächste vorkommende Wachstum beschrieb.

Für jede Mutante wurden mit dem leeren und dem Überexpressionsplasmid transformierte Varianten verwendet und deren relatives Wachstum zueinander beurteilt. Dabei wurde unterschieden zwischen (1) Wachstumsverschlechterung durch Überexpression, (2) Wachstumsdefekt auf SGal bereits mit leerem Plasmid und (3) gleichbleibendem Wachstum trotz Überexpression. Als „positiv“ gewertet wurden Stämme der dritten Gruppe. Insgesamt konnten dadurch 14 Deletionsmutanten als überexpressionstolerant identifiziert werden (Tab. A8).

+++ ++ + ---

Abbildung 3-11: Semiquantitative Analysen zur Erfassung des Wachstums bei Überexpression von MDM33. Das Wachstum der Hefezellen wurde in die vier Stufen +++, ++, + und --- eingeteilt, wobei +++ das stärkste und --- das schwächste vorkommende Wachstum beschreibt.

Um die Ergebnisse für die potentiell interessanten Kandidaten zu verifizieren, wurden Tüpfeltests durchgeführt. Dadurch sollte die Kompensationsintensität genauer erfasst werden.

Hierzu wurden serielle Verdünnungen von Zellkulturen mit leerem und Überexpressions-plasmid auf SD- (Minimalmediumplatten mit Glukose als Kohlenstoffquelle) und SGal-Platten getropft (Abb. A1). Die ersten Befunde aus den semiquantitativen Vortests konnten

durch die Tüpfeltests nur bedingt bestätigt werden. Keine der untersuchten Mutanten zeigte bei Überexpression gleichbleibend gutes oder verbessertes Wachstum. Gemäß ihres Wachstumsverhaltens mit dem leeren Plasmid wurden die Stämme ∆ydr493w, ∆yer017c,

∆yil157c und ∆ynl168c deshalb als allgemein wachstumsbeeinträchtigt auf SGal (Gruppe 2) identifiziert und die verbleibenden fünf Stämme wurden Gruppe (1) – Wachstumsverschlech-terung bei Überexpression – zugeordnet.

Allerdings konnten mit ∆ybr039w, ∆ydr061w, ∆ygl080w, ∆ylr091w und ∆yml030w fünf Stämme detektiert werden, bei denen die überexprimierenden Zellen zumindest eine Stufe besser wuchsen als entsprechende Wildtypzellen (Abb. 3-12 A). Unter zusätzlicher Berücksichtigung der Tüpfeltests ergab sich aus den semiquantitativen Wachstumsanalysen bei Überexpression von MDM33 die in Abb. 3-12 B dargestellte Gesamtverteilung. Für den Großteil der untersuchten Stämme (143 = 87%) wurde ein wildtypanaloger Wachstumsdefekt festgestellt und 10% der Stämme (=16) wiesen einen allgemeinen Defekt auf SGal-Medium auf. Die fünf Deletionen ∆ybr039w (∆atp3), ∆ydr061w, ∆ygl080w, ∆ylr091w und ∆yml030w bewirkten eine leichte Kompensation des Wachstumsdefekts bei Überexpression von MDM33 und stellen damit mögliche genetische Interaktionspartner von Mdm33 dar (Tab. 3-5).

(A)

(B)

von 1,0 angezogen worden waren, wurden serielle Verdünnungen auf SD- und SGal-Platten aufgetropft und drei Tage bei 30°C inkubiert. Fünf Deletionsstämme zeigen bei Überexpression von MDM33 leicht besseres Wachstum als der überexprimierende Wildtyp. (B) Gesamtverteilung der Wachstumsphänotypen. Erfasst wurden eine Verschlechterung des Wachstums bei Überexpression (grau), ein allgemeiner Wachstumsdefekt auf SGal (weiß) und verbessertes Wachstum im Vergleich zum Wildtyp bei Überexpression (rot).

Die Detektion der Deletionsmutante ∆atp3 (∆ybr039w) ist wahrscheinlich nicht die Folge einer spezifischen Interaktion von Atp3 und Mdm33, sondern eines sekundären Effekts. Atp3

ist die γ-Untereinheit des F₁-Sektors der ATP-Synthase und stellt zusammen mit der Untereinheit ε als central stalk die Verbindung zwischen dem Fo- und dem F1-Sektor her. In

∆atp3-Mutanten wurde eine gravierende Destabilisierung des gesamten F1-Sektors beobachtet (Paul et al., 1994), was zum Verlust der ATPase-Funktion führt. In Abwesenheit einer funktionellen Elektronentransportkette und/oder eines funktionellen ATP-Synthasekomplexes wird das essentielle elektrische Potential der inneren Mitochondrienmembran durch den Austausch von ATP gegen ADP mittels Adenin Nukleotid Translokator aufgebaut. Der entscheidende Schritt dieses Prozesses ist die Umwandlung von ATP zu ADP in der mitochondrialen Matrix, wobei wahrscheinlich der F1-Sektor der ATP-Synthase benötigt wird (Smith & Thorsness, 2005). In der vorliegenden ∆atp3-Deletionsmutante ist dieser Vorgang deshalb stark beeinträchtigt. Die mangelnde Energetisierung der Membran wiederum wirkt sich negativ auf den mitochondrialen Proteinimport (Truscott et al., 2001) und auch die mitochondriale Fusion aus (Meeusen et al., 2004). Dadurch kommt es zu einer gravierenden Fehlstrukturierung und Fehlfunktion der Mitochondrien (fluoreszenzmikroskopisch ist eine Fragmentierung sichtbar; Tab. A10), die möglicherweise auch durch die MDM33-Überexpression nicht weiter verschlechtert werden kann. Allerdings gelangt auch Mdm33 aufgrund des Importdefekts eventuell nur eingeschränkt in die Mitochondrien, sodass der überexpressionsspezifische Wachstumsdefekt vermindert eintritt. Aufgrund der deletions-bedingten Defekte ist das Wachstum der Mutante ∆atp3 auf SGal von vorne herein auch ohne Überexpression stark beeinträchtig (nur +) und die Überexpression kann nur bedingt einen zusätzlichen negativen Einfluss auf das Wachstum ausüben. Das Wachstum nimmt nur leicht ab. Dadurch aber erscheint das Wachstum bei Überexpression im Vergleich zum Wildtyp verbessert, wo ein Wachstumsarrest eintritt.

Als potentielle Wechselwirkungspartner von Mdm33 bleiben also die vier uncharakterisierten Proteine Ydr061w, Ygl080w, Ylr091w und Yml030w, die laut GFP-Fusionsstudien (Huh et al., 2003) und Proteomanalysen (Sickmann et al., 2003; Reinders et al., 2006) mitochondrial lokalisiert sind (Tab. 3-5). Für ein besseres Verständnis wurden Datenbankrecherchen und bioinformatische Analysen vorgenommen. Die Kandidatenproteine sind zwischen ~15 und 61 kDa groß (SGD; Issel-Tarver et al., 2002) und bilden mit Ausnahme von Ygl080w vermutlich Coiled-coil-Strukturen aus (Lupas et al., 1991). Über diese Motive wären Wechselwirkungen mit anderen Proteinen inklusive Mdm33 denkbar. Durch Hydropathie-analysen (Hofmann & Stoffel, 1993) wurden für Ygl080w und Yml030w jeweils zwei Transmembranbereiche vorhergesagt, sodass es sich bei ihnen wahrscheinlich um integrale

Membranproteine handelt. Ydr061w besitzt darüber hinaus eine nukleotid-bindende Domäne (NBD) mit Ähnlichkeit zu einem ABC-Motiv (Finn et al., 2008). Allerdings fehlen Transmembrandomänen, wie sie in klassischen ABC-Transportern zu finden sind. Damit ähnelt Ydr061w den transmembranbereichslosen ABC-Motiv-Proteinen Yef3 bzw. Gcn20, die im Cytosol als Translationselongationsfaktor bzw. Translationsregulator fungieren (Bauer et al., 1999). Eine wichtige Rolle von Ydr061w in der mitochondrialen Translation ist jedoch unwahrscheinlich, zumal die Deletionsmutante respiratorische Kompetenz aufweist.

Rückschlüsse auf die Funktion von Ydr061w sind also nicht möglich.

Ylr091w wurde im ersten Teilabschnitt der vorliegenden Arbeit als Komponente identifiziert, die essentiell für den Erhalt mitochondrialer DNA ist, und als Rrg5 (required for respiratory growth) bezeichnet (3.1.2.2). Die doppelte Detektion im Rahmen dieser Arbeit zeigt eine große Bedeutung dieses Proteins für die mitochondriale Biogenese. Darüber hinaus wurde YLR091w kürzlich in einem Screen nach genetischen Interaktionspartnern der Prohibitine erfasst (Osman et al., 2009). Die Prohibitine Phb1 und Phb2 sind zwei homologe Proteine, die in multimeren, hochmolekularen ringförmigen Komplexen in der mitochondrialen Innenmembran vorliegen und regulatorische Funktionen im Rahmen der Zellproliferation sowie der Dynamik und Funktion von Mitochondrien einnehmen.

Weiterführende Untersuchungen zur ∆ylr091w-Mutante zeigten eine veränderte Lipidzusammensetzung der mitochondrialen Membranen und insbesondere der Anteil an Cardiolipin (CL) und Phosphatidylethanolamin (PE) war deutlich reduziert. Beides sind Phospholipide mit großer Bedeutung für die mitochondriale Struktur und Integrität (Osman et al., 2009). Dementsprechend wurden in der Deletionsmutante veränderte Mitochondrien beobachtet (fluoreszenzmikroskopisch war eine Fragmentierung sichtbar; Tab. A10). Mdm33 ist ein integrales Innenmembranprotein und seine mögliche Rolle als Innenmembranteilungs-komponente (Messerschmitt et al., 2003) erfordert eine Umstrukturierung der Membran.

Möglicherweise beeinträchtigt die veränderte Lipidzusammensetzung und die damit veränderten Eigenschaften der Membran die Funktionalität von Mdm33.

Die in Tab. 3-5 enthaltenen schematischen Darstellungen fassen die vorhergesagten Strukturmotive zusammen. Ylr091w ist pilzspezifisch, zu den anderen drei Proteinen existieren Homologe in Pflanzen und/oder Tieren (PSI-BLAST über SGD; Issel-Tarver et al., 2002). Eine Zusammenfassung der Datenbankrecherchen und Strukturvorhersagen ist Tab.

A9 zu entnehmen.

Tabelle 3-5: Fünf Hefestämme zeigten eine leichte Kompensation des Wachstumsdefekts bei Überexpression von MDM33.

Systematischer Name

Standardname und zelluläre Funktion des Genprodukts

Bioinformatisch vorhergesagte Strukturmotive

YBR039w ATP3, Untereinheit γ des F1 -Sektors der F1Fo-ATP-Synthase

nicht dargestellt

YDR061w mitochondriales^1,3 Protein unbekannter Funktion

YGL080w FMP37, mitochondriales^1,2,3 Protein unbekannter Funktion

YLR091w RRG5, mitochondriales^1,2,3 Protein;

mögliche Beteiligung am mtDNA-Erhalt

YML030w AIM31, mitochondriales^1,2,3 Protein unbekannter Funktion

Angegeben sind der systematische und der Standardname der entsprechenden deletierten Gene sowie Funktionen der Genprodukte und durch bioinformatische Analysen erhaltene Strukturmotive der bisher uncharakterisierten Proteine, wie Coiled-coil-Domänen (CC; Lupas et al., 1991), Transmembrandomänen (TM; Hofmann & Stoffel, 1993) und die in Ydr061w enthalte-ne ABC-Transporterdomäenthalte-ne (Finn et al., 2008). Die wahrscheinliche Membranorientierung ist durch a (Membranaußenseite) und i (Membraninnenseite) gekennzeichnet. Es ist unbekannt in welcher der beiden mitochondrialen Membranen die Proteine lokalisiert sind. Die N-Termini sind mit N markiert. Mitochondrial: Aussage aus GFP-Fusionsstudien nach ¹Huh et al. (2003) und/oder aus Proteomanalysen nach ²Sickmann et al. (2003) und ³Reinders et al. (2006).AIM:

altered inheritance rate of mitochondria; FMP: found in mitochondrial proteome; RRG: required for respiratory growth.