Für die Luftkeimmessung im Stall wurde das Filtrationsverfahren verwendet, bei dem mit Hilfe einer an einen IOM Sammelkopf und an einen SKC (Zyklon) Sammelkopf angeschlossenen Pumpe ein definiertes Luftvolumen durch einen Membranfilter ge-saugt wird. Eingesetzt wurde eine Pumpe mit einem konstanten Luftvolumenstrom von 2 l/min. Als Filtermaterialien wurden Polykarbonatfilter (Whatman, UK), verwen-det. Dieser Filtertyp weist eine Porenweite von 0,8 µm auf und besitzt einen Durch-messer von 25 mm. Die Probenahmezeit bei den Polykarbonatfiltern betrug 24 Stun-den.
3.3.2 Impingement
Für die Luftkeimmessung wurde zusätzlich der All-Glass-Impinger (AGI 30) mit 50 ml selbst hergestellter steriler 0,9 % NaCl-Lösung als Sammelmedium bei einem regel-mäßig kontrollierten Luftdurchsatz von 12,5 l/min eingesetzt. Die Probenahmezeit betrug 30 Minuten.
Die Sammelflüssigkeit wurde für 24 h bei 4 °C gelagert und am folgenden Tag vor der Aufarbeitung kurz auf dem Vortexer geschüttelt. Danach wurde je 1 ml der Aus-gangslösung auf drei Agarplatten (3fach Bestimmung) ausgespatelt. Dabei wurde darauf geachtet, dass keine Verdrängung an den Plattenrand erfolgte.
3.3.3 Sedimentationsstaub
Absetzstaub wurde auf definierten Oberflächen (Aluminiumfolien auf Sammelble-chen), die über einige Wochen im Stall aufgehängt wurden, gesammelt. Erfasst wird dabei der sedimentierfähige Staubanteil der Stallluft. Die Befunde werden in g/m²/24h angegeben. Der Absetzstaub wurde ausgewogen und auf die Sammelflä-che bezogen. Weiterhin wurde der Staub auf Keime und Endotoxine sowie auf Staubinhaltsstoffe mit der Weender Analyse untersucht.
3.3.4 Kulturelle Verfahren und weitere Laboranalysen
Der Mikroorganismennachweis erfolgte mit Hilfe der aeroben Kultivierungsmethode.
Untersucht wurde auf Gesamtkeime, Staphylokokken, E. coli als Vertreter der Ente-robakterien und mesophile und thermophile Pilze, die zusammengefasst dargestellt werden. Die Probenahmefilter (Polykarbonatfilter) wurden am Tag der Probenahme gekühlt ins Labor transportiert. Zur Keimzahlbestimmung wurde die in den Techni-schen Regeln für Biologische Arbeitsstoffe (TRBA 430, 2001) beschriebene Vorge-hensweise zur indirekten Bestimmung benutzt. Diese Vorschrift gilt eigentlich nur für den Nachweis von Schimmelpilzsporen bei Luftkeimmessungen, lässt sich jedoch mit bestimmten Modifikationen auch zum Nachweis anderer Keime verwenden. Auch die BIA- Vorschrift zum Nachweis luftgetragener Bakterien (BIA-Arbeitsmappe 9430, 1997) lautet ähnlich. Sie geht jedoch davon aus, dass die beprobten Filter noch am Ort der Messung in Lösung gebracht werden und sieht keinen Zusatz von Tween 80 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim) vor. Durch den „trockenen Transport“ der Filter und relativ lange Probenahmezeiten von 24 h muss mit einer Reduzierung aus-trocknungsempfindlicher Keime gerechnet werden. Die Verluste bei der Sammlung von Aktinomyzeten und Schimmelpilzen dürften hingegen aufgrund ihrer ausgepräg-ten Austrocknungsunempfindlichkeit auch bei langen Probenahmezeiausgepräg-ten gering sein.
Einige Bakterienspezies sind zur Sporenbildung (Dauer- oder Ruheformen) unter bestimmten Umweltbedingungen (z. B. Austrocknung, Nahrungsmangel) fähig
(HALLMANN u. BURKHARDT 1974, TRGS 908-14, 1998). Es muss also angenom-men werden, dass bei den Bakterien überwiegend Sporen gesammelt wurden.
Zur Ablösung der Partikel (Staub und Keime) von den Polykarbonatfiltern wurden die Filter am folgenden Tag morgens mit einer sterilen Pinzette in 10 ml einer 0,9 %igen Kochsalzlösung, die als Zusatz 0,01 % des Netzmittels Tween 80 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim) enthielt, überführt und anschließend 30 Minuten bei 25°C im Wasserbad geschüttelt. Anschließend erfolgte ein vierminütiges Schütteln auf dem Vortexer. Danach wurden je 0,1 ml der Keimlösung auf je drei Petrischalen (3-fach Bestimmung) mit dem jeweils ausgewählten Nährboden mit einem Drigalski-Spatel unter kreisenden Bewegungen der Platte ausgespatelt. Die Keimlösung der Filter, die im Stall beaufschlagt worden waren, wurde einer dezimalen Verdünnungs-reihe mit Tween 80 Lösung unterworfen und die einzelnen Verdünnungsstufen auf die Nährmedien ausplattiert (0,1 ml) (3-fach Bestimmung je Verdünnungsstufe).
Nach dem Ausspateln wurden die Nährböden in einem Brutschrank bebrütet. Bei dem Einsatz der Impingementmethode wurde die Sammlerflüssigkeit am folgenden Tag der Probenahme vor der Aufarbeitung kurz auf dem Vortexer geschüttelt, und auf drei Agarplatten (3-fach Bestimmung) verteilt und ausgestrichen.
3.3.5 Zusammensetzung und Gebrauch der Nährböden
Als Nährmedium für die Bestimmung der Gesamtkeime wurde Blutagar-Basis Nr. 2 (Oxoid, Wesel) verwendet. Zum Nachweis und zur Isolierung von Staphylokokken diente Mannit-Kochsalz-Agar (Oxoid, Wesel) mit einem hohen Salzanteil, um das Wachstum anderer, nicht salztoleranter Mikroorganismen, zu hemmen. Koagulase-positive Staphylokokken bilden auf diesem Nährboden Kolonien mit einem hellgelben Hof, während Koagulase-negative von einem roten oder violetten Hof umgeben sind.
Die Bebrütung erfolgte bei 36 °C für 48 h. Zur Kontrolle, ob es sich bei den gewach-senen Kolonien auch um Staphylokokken handelt, wurden Keime aus einer reprä-sentativen Anzahl an Kolonien differenziert. Zur Untersuchung der Luft auf E. Coli wurde McConkey-Nährboden Nr. 3 (Oxoid, Wesel) benutzt. Dieser Agar ist zum Nachweis und zur Koloniezahlbestimmung coliformer Keime geeignet. Der Nährbo-den enthält eine spezielle Gallsalzmischung, die mit Kristallviolett eine verbesserte Differenzierung zwischen coliformen und Lactose-negativen Keimen ermöglicht, wäh-rend das Wachstum Gram-positiver Kokken vollständig gehemmt wird. Zudem
ent-hält er Pepton, Laktose, Natriumchlorid und Neutralrot. Laktose-fermentierende Ente-robakterien erscheinen rosa mit trüber Randzone, während nicht Laktose-metabolisierende Keime eine farblos bis transparente Kolonie bilden. Die Bebrütung erfolgte für 48 h bei 36 °C. Für die Bestimmung der Zahl der Pilzsporen wurde Dich-loran-Glyzerin-Agar (DG 18, Oxoid, Wesel) eingesetzt. Dieser wird in der TRBA 430 (2001) für die Schimmelpilzsporendiagnostik vorgeschrieben. Der Zusatz von Chlo-ramphenicol hemmt das bakterielle Wachstum, insbesondere Gram-negativer Bakte-rien. Glyzerin hemmt die Wasseraktivität und Dichloran hemmt die Ausbreitung der mit Myzelien wachsenden Pilze und verhindert ein Überwachsen langsamer wach-sender Kolonien. Die Kultivierungstemperatur beträgt 25 °C für den Nachweis me-sophiler Pilze und 40 °C für den Nachweis thermophiler Pilze über einen Zeitraum von 5 Tagen. Um ein Austrocknen der Platten während der langen Bebrütungsdauer zu vermeiden, wurde das Agarvolumen pro Platte erhöht und die Agarplatten wur-den mit Kunststofftüten umhüllt.
3.3.6 Ermittlung der Keimzahlen in den Luftproben
Die erhaltenen Koloniezahlen werden, unter Einrechnung der Verdünnungsfaktoren, der jeweiligen Teilmengen und des Probenluftvolumens in Keimkonzentrationen um-gerechnet. Das Ergebnis wird als koloniebildende Einheit (KBE) pro Kubikmeter Luft angegeben.
3.4 Aufbau und Funktion des Meß- und Analysesystems in den