Autofluoreszenzkorrektur

In Vorversuchen stellte sich eine nur schwache EGFP-Expression der sehr kleinen EGFP⁺-Zellpopulationen heraus. Abbildung 14 veranschaulicht, wie sich ihre grüne Fluoreszenz in der durchflusszytometrischen Analyse nicht eindeutig von dem unspezifischen autofluoreszenten Hintergrund der EGFP^--Zellen abgrenzte.

Die EGFP⁺-Zellen waren in den Standard-Darstellungen weder in Punktdiagrammen noch in Histogrammen zu erkennen. Für die Analysen wurde daraufhin eine Darstellungsweise gewählt, die zu einer Erhöhung der Sensitivität und Spezifität der Messungen führte, indem autofluoreszente Ereignisse aus der Betrachtung und Auswertung ausgeschlossen wurden (ALBERTI et al. 1987; LYBARGER u.

CHERVENAK 1999): Voraussetzung dafür war die Gegenüberstellung der Signale aus FL1 und FL2, nachdem beide Kanäle bei einer Kompensation von Null auf die gleiche Verstärkungsrate gesetzt wurden. Obwohl keine Detektion durch FL2 erwartet wurde, wurden in diesem Kanal Signale gemessen. Unspezifische Fluoreszenzen strahlten mit gleicher Stärke in alle Kanäle, so dass diese Ereignisse im Punktdiagramm mittig zwischen der x- und y-Achse zu finden waren. Für einen bestimmten Wellenlängenbereich spezifische Fluoreszenz zeigte sich hingegen zu der jeweiligen Achse hin verlagert abseits der autofluoreszenten Population. EGFP⁺ -Zellen mit ihrem charakteristischen Emissionsspektrum grenzten sich in dieser autofluoreszenzkorrigierten Darstellung deutlich von Events mit hoher Autofluoreszenz oder toten Zellen ab (Ab.14).

Abbildung 14: Autofluoreszenzkorrektur.

Die Oct4⁺EGFP⁺-Zellen ließen sich in der durchflusszytometrischen Analyse von der Restpopulation nur durch eine autofluoreszenzkorrigierte Darstellungsweise abgrenzen (a, b). Dabei wurden die Kanäle FL1 und FL2 für grüne bzw. rote Fluoreszenzsignale einander gegenübergestellt und die Autofluoreszenz im roten Kanal als zweites Fluorochrom betrachtet. Unter Voraussetzung einer gleichen Amplifikation beider Kanäle während des Einlesens der Proben verursachten unspezifische, autofluoreszente Emissionen in beiden Detektoren die gleiche Signalstärke und kamen somit im Punktdiagramm in einem Bereich zwischen den beiden Achsen zu liegen.

Spezifische Fluoreszenzen erschienen hingegen zu dem jeweiligen Kanal verschoben. In dieser Darstellung hob sich die Oct4⁺EGFP⁺-Population der Reportermäuse (b) deutlich von dem Hintergrund und der Wildtypkontrolle (a) ohne spezifisches EGFP-Signal im grünen Kanal ab. Andere üblicherweise in der Durchflusszytometrie verwendete Diagrammtypen maskierten diese kleine, nur schwach EGFP-exprimierende Zellpopulation (c-h). In den Punktdiagrammen (c, d) und in den Histogrammen (e, f) waren keine Unterschiede zwischen den Wildtyp- (c, e) und Reportermäusen (d, f) zu erkennen. Erst eine gesonderte Markierung (d, f) der Oct4⁺EGFP⁺-Zellen aus der modifizierten Darstellungstechnik (b) ließ die Position und Existenz dieser Population in den Proben erkennen

4.2. Reihenuntersuchung auf Oct4⁺EGFP⁺-Zellen in ausgewählten Geweben und im Myokard nach experimenteller Ischämie

Tabelle 6 listet die verschiedenen Gewebe von Tieren der OG2-Linie auf, die in drei Altersstufen der durchflusszytometrischen Reihenuntersuchung zugeführt wurden. In der autofluoreszenzkorrigierten Darstellung (FL1-FL2-Plot) wurde ihr Gehalt grün-fluoreszierender Zellen miteinander verglichen. Gewebe von Wildtypmäusen diente jeweils als Negativkontrolle.

Tabelle 6: Durchflusszytometrische Reihenuntersuchung auf Oct4⁺EGFP⁺-Zellen.

Herz, Knochenmark, Milz, Hoden und Haut wurden in jeweils drei Altersstufen auf Oct4⁺EGFP⁺-Zellen untersucht. In adulten Tieren wurden außerdem experimentell ischämische Myokardinfarkte (MI) gesetzt und die Herzen drei Tage nach dem Gefäßverschluss durchflusszytometrisch analysiert.

Abbildung 15: Durchflusszytometrische Reihenuntersuchung.

Einzelzellsuspensionen aus Herz, Knochenmark, Milz, Hoden und Haut von Wildtyp- und Reportermäusen (OG2) wurden durchflusszytometrisch auf ihren Gehalt Oct4⁺EGFP⁺-Zellen untersucht. Es wurden Gewebe infantiler, pubertärer und adulter Tiere analysiert. Hoden und Haut der Reportermäuse zeigten in allen drei Altersstufen deutlich abgesetzte Oct4⁺EGFP⁺ -Populationen.

Suspensionen aus Hoden- und Hautgewebe der OG2-Mäuse wiesen in jeder Altersgruppe deutlich abgesetzte Populationen grün-fluoreszierender Zellen auf, die in den Geweben vergleichbarer Wildtypen nicht aufzufinden waren (Ab. 15, Tab. 6).

In Herz, Knochenmark und Milz konnte in keinem der untersuchten OG2-Tiere ein Unterschied zu den korrespondierenden Wildtypproben festgestellt werden (Ab. 15, Tab. 6). Auch die infarktgeschädigten Herzen zeigten das gleiche Bild in der FACS-Analyse wie der Wildtypvergleich bzw. gesundes Myokard. Abbildung 16 zeigt

exemplarisch autofluoreszenzkorrigierte Punktdiagramme von Geweben, in denen keine grün fluoreszierenden Oct4⁺EGFP⁺-Zellen nachgewiesen wurden.

Abbildung 16: Beispiele negativer Gewebe.

In keiner der Wildtypproben konnte ein EGFP-spezifisches Signal in FL1 detektiert werden. Herz, Knochenmark und Milz waren auch in den OG2-Mäusen in allen untersuchten Altersstufen ohne positiven Befund.

Das Knochenmark ist ein besonders zellreiches Gewebe und beherbergt als Ort der Hämatopoese Stammzellen und Vorläuferstadien der verschiedenen Blutzellen in großer Zahl. Naive hämatopoetische Stammzellen finden sich in der liniendepletierten Fraktion des Knochenmarks. Um sicherzustellen, dass auch geringe Mengen Oct4⁺EGFP⁺-Zellen durch die Analysen erfasst werden, wurden die Knochenmark-Zellsuspensionen vor der FACS-Analyse durch eine Liniendepletion in ihrem Stammzellgehalt angereichert. Der Erfolg dieser Liniendepletion wurde durch den gestiegenen Anteil CD117⁺-Vorläuferzellen in der Gesamtsuspension bestätigt (Ab. 17). In den durchflusszytometrischen Analysen konnte auch in der

stammzellreichen Fraktion des Knochenmarks von OG2-Tieren kein Unterschied zu Wildtypknochenmark festgestellt werden.

Abbildung 17: Liniendepletion zur Analyse der stammzellreichen Fraktion des Knochenmarks.

Knochenmark hat eine hohe Zelldichte, so dass sich große Zellzahlen isolieren lassen. Die Zellsuspensionen enthalten vor allem liniendeterminierte oder bereits differenzierte Zellen. Die Oct4⁺EGFP⁺-Zellen wurden allerdings in der wenig oder nicht linienrestringierten Population erwartet. Um deren Anteil in der Suspension vor der Durchflusszytometrie zu erhöhen, wurde eine Liniendepletion des Knochenmarkes durchgeführt. Dabei wurden linienspezifische Oberflächenmarker markiert und die entsprechenden Zellen mittels eines magnetischen Verfahrens aus der Suspension entfernt. Der Scatterplot (a, b) zeigte bereits Unterschiede in der Morphologie der Zellsuspensionen vor (a) und nach (b) der Liniendepletion. Deren Effizienz wurde durch eine CD117-APC-Färbung bestätigt (e, f). CD117 ist ein Zellmarker an der Oberfläche von Knochenmarksstammzellen. Der Anteil der durch den APC-konjugierten CD117-Antikörper markierten Zellen an der Gesamtheit der Knochenmarkszellen war vor der Liniendepletion (e) mit 0,3 % sehr gering und nach der Anreicherung (f) mit 13,1 % deutlich erhöht. Doch auch in der stammzellreichen Fraktion des OG2-Knochenmarkes (d) konnte bezüglich des EGFP-Signals kein Unterschied zur Wildtypkontrolle oder der unbehandelten Knochenmarkssuspension (c) festgestellt werden.

Zusammenfassung:

Die durchflusszytometrischen Reihenuntersuchungen haben gezeigt, dass sowohl Hoden, als auch Haut EGFP⁺-Zellpopulationen beherbergen. In Herz, Knochenmark und Milz waren diese Zellen nicht aufzufinden.