3. Geräte, Material und Methoden
3.2. Material
3.2.1. Laborbedarf
Augensalbe Bepanthen Augen- und Nasensalbe Fa. Bayer, Leverkusen
Biopsiestanze Fa. Stiefel, Offenbach
chirurgischer Faden
Ethibond Excel, Polyester, grün geflochten, 5-0
Perma-Hand-Seide, schwarz geflochten, 6-0 Fa. Ethicon, Norderstedt chirurgisches Besteck
Irisschere, fein, gebogen, 8,5 cm Pinzette, grob, gebogen, 9,5 cm
Castroviejo Nadelhalter, fein, gerade Fa. Martin, Tuttlingen Vannas Federschere, gerade, 8 cm
Crile-Wood Nadelhalter, 15 cm
Pinzette, fein, gewinkelt 0,4 mm Fa. FST, Kanada Einbettmedium Tissue Tek OCT-Compound Fa. Dako, USA Eindeckmittel Fluorescence Mounting Medium Fa. Dako, USA
Eindeckmittel Kaiser´s Glycerol Gelatine Fa. Merck, Darmstadt FACS-Röhrchen BD FACS Tubes Falcon Fa. BD Biosciences, USA
Holzgranulat BK 8/15 Fa. Rettenmaier, Rosenberg
IVC-Käfige T22 IVC-System Fa. BioZone, UK
Jodlösung Braunoderm Fa. Braun, Melsungen
Korkplatten Fa. KMF, St. Augustin
Objektträger Superfrost Plus Fa. Menzel, Braunschweig Tierfutter Altromin 1314 FORTI Zuchtfutter Fa. Altromin, Lage
Zellsiebe BD Falcon Cell Strainer, 70 µm Fa. BD Biosciences, USA 3.2.2. Reagenzien, Chemikalien
2-Mercaptoethanol (31350-010) Fa. Gibco Invitrogen, UK
2-Methylbutan Fa. Carl Roth, Karlsruhe
Aceton Fa. JT Baker, Griesheim
Acrylamid rotiophorese Gel 30 Fa. Carl Roth, Karlsruhe
Ammoniumperoxodisulfat Fa. Merck, Darmstadt
Ammoniumchlorid (A0171) Fa. Sigma, Deisenhofen
Bromphenolblau Fa. Serva Electroph., Heidelberg
BSA Albumin Fraktion V (8976,2) Fa. Carl Roth, Karlsruhe
DAPI (6335.1) Fa. Carl Roth, Karlsruhe
Dimethylformamid (D4551) Fa. Sigma, Deisenhofen Dispase neutrale Protease (LS02104) Fa. Worthington, USA
DMEM (FG0445) Fa. Biochrom, Berlin
DNAseI (DN25-1g) Fa. Sigma, Deisenhofen
dPBS w/o Ca, Mg (BE15-512D) Fa. Lonza, Schweiz
DTT Fa. Merck, Darmstadt
EDTA Dinatriumsalz Dihydrat (8043.2) Fa. Carl Roth, Karlsruhe
Eosin G Lösung (115935) Fa. Merck, Darmstadt
Ethanol Chemikalienzentrum MHH
FACS Clean Solution Fa. BD Biosciences, USA
FACS Rinse Solution Fa. BD Biosciences, USA
FACS Trägerflüssigkeit FACS Flow Fa. BD Biosciences, USA Fc-Block-Reagenz FCR block (553142) Fa. BD Biosciences, USA
FCS (S0115) Fa. Biochrom, Berlin
Glutaraldehyd solution Grade 1 (G588210) Fa. Sigma, Deisenhofen
Glycerin Fa. Carl Roth, Karlsruhe
Hämalaun Fa. Merck, Darmstadt
HBSS w/o Ca, Mg, with Phenol Red (10-543F) Fa. Lonza, Schweiz
Histopaque 1083 Fa. Sigma, Deisenhofen
IMDM (E15-819) Fa. PAA, Österreich
Kalium Ferricyanid (244023) Fa. Sigma, Deisenhofen Kalium Hexacyano-ferrate(II) trihydrate (P9387) Fa. Sigma, Deisenhofen Kaliumhydrogencarbonat (P9144) Fa. Sigma, Deisenhofen
Ketamin (Ketanest) Fa. Pfizer, Berlin
Kollagenase I (LS004196) Fa. Worthington, USA Kollagenase II (C7657-25) Fa. Sigma, Deisenhofen
Levamisol-HCl (L9756) Fa. Sigma, Deisenhofen
MACS Mouse Lineage Cell Depletion Kit mouse Fa. Miltenyi Biotec, USA
Magermilchpulver Fa. Uelzena, Uelzen
Magnesiumchloridlösung (A5076) Fa. AppliChem, Darmstadt
Methanol Fa. Carl Roth, Karlsruhe
Naphthol-AS-Bl-phosphat (N2250) Fa. Sigma, Deisenhofen Natriumhydroxid (1064981000) Fa. Merck, Darmstadt Natriumnitrit (1.065.490.500) Fa. Merck, Darmstadt
Neufuchsin (72200) Fa. Sigma, Deisenhofen
PBS w/ Ca, Mg (BE17-513F) Fa. Lonza, Schweiz
PFA (P6148) Fa. Sigma, Deisenhofen
Propandiol (8.014.640.250) Fa. Merck, Darmstadt Propidium Iodid BD PI staining solution (556463) Fa. BD Biosciences, USA Rimadyl Injektionslösung Fa. Intervet, Unterschleissheim RNA/ Protein-Kit NucleoSpin RNA/ Protein Fa. Macherey-Nagel, Düren RNA-Isolations-Kit NucleoSpin RNA XS Fa. Macherey-Nagel, Düren
Salzsäure 2N (1090631) Fa. Merck, Darmstadt
SDS Fa. Carl Roth, Karlsruhe
Stickstoff Fa. Linde, Wiesbaden
Streptavidin/ AP (D039601) Fa. Dako, USA
Sucrose (4621.1) Fa. Carl Roth, Karlsruhe
SuperSignal ELISA Femto Sensitivity Substrate Fa. Thermo Fisher Scient., USA
TrisHCl (9090.3) Fa. Carl Roth, Karlsruhe
TritonX-100 (T8787) Fa. Sigma, Deisenhofen
Trypsin (LS003667) Fa. Worthington, USA
Tween20 Fa. Carl Roth, Karlsruhe
TEMED Fa. Carl Roth, Karlsruhe
X-Gal (37-2610) Fa. Peqlab, Erlangen
Xylazin (Rompun 2 %) Fa. Bayer, Leverkusen
Ziegenserum (G9023) Fa. Sigma, Deisenhofen
3.2.3. Antikörper
Cy3-Goat anti Rabbit Antibody (111165144) Fa. Dianova, Hamburg Goat anti-rabbit immunoglobulin/ biotinylated Fa. Dako, USA
Goat anti-rabbit HRP Fa. Dako, USA
Isotype control mouse IgG1 APC Fa. BD Biosciences, USA Isotype control rat IgG2a, IgG2b APC Fa. BD Biosciences, USA mouse anti-ß1-integrin/ CD29-APC-Antibody Fa. Immunotools, Friesoythe mouse anti-SSEA-1-APC-Antibody (FAB2155A) Fa. R&D Systems, USA Oct-4 rabbit polyclonal Antibody (sc-9081) Fa. Santa Cruz, USA
rabbit anti-GFP-Antibody (SP3005P) Fa. Acris Antibodies, Herford rat anti-α6-Integrin/CD49f-APC Antibody Fa. R&D Systems, USA rat anti-CD11b-APC-Antibody (130091241) Fa. Miltenyi Biotec, USA rat anti-CD31-APC-Antibody (551262) Fa. BD Biosciences, USA rat anti-c-kit/ CD117-APC-Antibdy (130091729) Fa. Miltenyi Biotec, USA rat anti-cxcr4-APC-Antibody (FAB21651A) Fa. R&D Systems, USA rat anti-sca-1-APC-Antibody (130093223) Fa. Miltenyi Biotec, USA
3.2.4. Primer 3.2.4.1. RT-PCR muriner Oct4-Primer
Oct4 murine sense gcgttctctttggaaaggt Oct4 murine RAS agcctcatactcttctcgttgg
Die RT-PCR wurde durch Mitarbeiter der Arbeitsgruppe von Prof. Ulrich Martin, Leibniz-Forschungslaboratorien für Biotechnologie und künstliche Organe (LEBAO) der Medizinischen Hochschule Hannover, durchgeführt.
3.2.4.2. q-RT-PCR muriner Oct4-Primer
Left: gttggagaaggtggaaccaa
Right: ctccttctgcagggctttc murines c-myc
Left: cgcctagaattggcagaaat
Right: aactgagaagaatcctattcagcac murines KLF4
Left: cgggaagggagaagacact
Right: gagttcctcacgccaacg
murines Sox2
Left: tgctgcctctttaagactaggg
Right: tcgggctccaaacttctct
Die Probenanalyse erfolgte mit Light Cycler 480 Software der Fa. Roche in den Labors der Arbeitsgruppe Dr. Robert Geffers im Helmholtzzentrum für Infektionsforschung in Braunschweig.
3.2.5. Lösungen und Puffer
3.2.5.1. Lösungen und Puffer für die Durchflusszytometrie Verdaulösung a
3.2.5.2. Lösungen und Puffer für die Histologie Fixierungslösung a
PBS (w/ Ca++, Mg++) 16,25 ml
PFA (8 %) 3,75 ml
Glutaraldehyd (25 %) 80 µl Fixierungslösung b
PBS (w/ Ca++, Mg++) 16,25 ml
PFA (8 %) 3,75 ml
Glutaraldehyd (25 %) 80 µl
Sucrose 4 g
Fixierungslösung c
PBS (w/ Ca++, Mg++) 20 ml
Sucrose 4 g
Fixierungslösung d
PFA 2 %
dH2O 50 ml
Fixierungslösung e
dPBS (w/o Ca++, Mg++) 70 ml Glutaraldehyd (25 %) 560 µl Blockierungs-Puffer
PBS (w/ Ca++, Mg++) 25 ml
Ziegenserum 1,25 ml
TritonX-100 75 µl
Antikörper-Puffer a
β-Galaktosidase-Färbelösung
X-Gal 1,25 ml
Ferricyanid (0,5 M) 0,5 ml Ferrocyanid (0,5 M) 0,5 ml β-Galaktosidase-Waschpuffer 48 ml
3.2.5.3. Lösungen und Puffer für SDS-PAGE und Western Blot Trenngel 10 %
Lämmli-Puffer x3
SDS 6 %
Glycerin 30 %
Tris-HCl (pH 6,8) 150 mM Bromphenolblau 0,02 % Probenpuffer
DTT 100 µl
SDS (20 %) 100 µl
Lämmli-Puffer x3 ad 1 ml SDS-PAGE Laufpuffer
Tris-HCl 3,082 g
Glycin 14,4 g
SDS 1 g
dH2O ad 1 l
Transferpuffer x10
Glycin 1,92 M
TRIS 0,25 M
Methanol 20 %
dH2O ad 1 l
3.2.6. Versuchstiere
Die tierexperimentellen Arbeiten wurden gemäß §8 Abs.1 des Tierschutzgesetzes in der Fassung vom 21.12.2006 unter dem Aktenzeichen AZ 09/1623 durch das Niedersächsische Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit genehmigt.
Die in den Versuchen eingesetzten Mäuse gehören verschiedenen gentechnisch veränderten Mauslinien an. Allen gemeinsam ist die Integration molekularer Marker in bestimmte Abschnitte ihrer Erbinformation. Diese Tiere dienen somit als Reporterorganismen für all jene Gene, die durch den Promotor kontrolliert werden, in dessen Bereich das Transgen inseriert wurde. Die in dieser Arbeit verwendeten transgenen Tiere trugen das Enzym β-Galaktosidase und das fluoreszierende Protein EGFP als molekulare Reporter in ihrem Genom.
3.2.6.1. Molekulare Marker
Bei EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP) handelt es sich um ein fluoreszierendes Protein, dessen ursprüngliche Form (GFP) aus der Quallenart Aequora aequorea isoliert werden kann (CHALFIE et al. 1994). Das durch genetische Modifikationen entstandene EGFP zeichnet sich durch eine schnellere postranslationale Faltung, höhere Stabilität und stärkere Fluoreszenz als das natürliche Protein aus (BILLINTON u. KNIGHT 2001). Die fluoreszierenden Eigenschaften von EGFP zeigen sich bei einer Anregung von 489 nm und einem Emissionsmaximum von 508 nm. Integriert man die genetische Information für EGFP in ein Wirtsgenom, wird das wasserlösliche Protein synchron mit den Genprodukten der gleichen Promotorregion exprimiert und kann als molekularer Marker in lebenden Zellen und Organismen eingesetzt werden. Bei den üblicherweise auftretenden EGFP-Konzentrationen gibt es bisher keine Hinweise auf eine toxische Wirkung auf die transgenen Organismen oder eine Beeinflussung der normalen zellulären Funktionen. Zudem ist für die Fluoreszenz kein katalytischer Prozess oder Cofaktor notwendig, da die notwendige Faltung der Moleküle durch autokatalytische Prozesse
abläuft, die lediglich der Anwesenheit von Sauerstoff bedürfen (HEIM et al. 1994;
BRAZELTON u. BLAU 2005).
Das bakterielle Enzym β-Galaktosidase stammt aus Escherichia coli und ist das Produkt des LacZ-Gens. Seine Aktivität kann durch eine Nachweisfärbung in Gewebeproben und histologischen Präparaten sichtbar gemacht werden. Die β-Galaktosidase katalysiert hierbei die Hydrolyse von X-Gal zu Galaktose und 5-Brom-4-chlor-indoxyl. Letzteres oxidiert zu dem dunkelblauen Farbstoff 5,5´-Dibrom-4,4´-dichlor-indigo, der als Indikator für den enzymatischen Substratumsatz dient (DANNENBERG 1981). Zu berücksichtigen ist bei der Nachweisführung mit Hilfe der β-Galaktosidase, dass einige Gewebe (v.a. Leber, Niere, Pankreas, Milz, Darm) eine recht hohe endogene Enzymaktivität aufweisen und dadurch unspezifische, falsch-positive Farbreaktionen entstehen können (COHEN et al. 1952; HATTON u. LIN 1992; SANCHEZ-RAMOS et al. 2000). Allerdings ist die bakterielle β-Galaktosidase in intrazellulären Vesikeln lokalisiert, wodurch die von dem bakteriellen Enzym hervorgerufene Farbreaktion granulär erscheint. Somit ist eine Unterscheidung von unspezifischen, diffus-zytoplasmatischen Färbungen durch endogene enzymatische Reaktionen möglich (BRAZELTON u. BLAU 2005).
3.2.6.2. Mausstämme
Die Untersuchungen wurden an Mäusen der Linie B6;CBA-Tg(Pou5f1-EGFP)2Mnn/J (Synonym: OG2) durchgeführt. Die eingesetzten Tiere entstammen der abteilungseigenen Vermehrungszucht. Diese Population geht auf für das Transgen Pou5f1-EGFP homozygote Elternpaare zurück, die der Abteilung Kardiologie und Angiologie von Prof. Schöler des Max-Planck-Institutes für Molekulare Biomedizin in Münster überlassen wurden. Die OG2-Linie wurde dort durch Injektion eines Genkonstruktes in die Zygoten von (CBA/CaJ X C57Bl/6J)-Hybriden entwickelt. Das Genkonstrukt GOF-18ΔPE:EGFP besteht aus der cDNA eines etwa 18kb großen murinen Genomischen Oct4 –Fragmentes (GOF-18), das durch die Insertion der EGFP-Reporter-Sequenzen und eine Deletion im Bereich des proximalen Enhancers modifiziert wurde (YEOM et al. 1996; SZABO et al. 2002). Diese genetische Manipulation der Zygoten bewirkt, dass die unter der Kontrolle des Oct4-Promoters
stehende EGFP-Information simultan mit dem Stammzellmarker exprimiert wird. Die OG2-Mäuse stellen somit eine Reportermauslinie für Oct4-Expression dar. Durch die Deletion im proximalen Enhancer kommt es lediglich im Epiblasten von OG2-Embryonen zu keiner Oct4-synchronen EGFP-Synthese, da in dieser Zellklasse der unveränderte proximale Enhancer essentiell für Oct4-Expression ist (YEOM et al.
1996; YOSHIMIZU et al. 1999; KEHLER et al. 2005).
Für die Transplantationsexperimente wurden Tiere der Stämme OG2 und B6;129S-Gtrosa26 (RosaLacZ) gekreuzt. Diese Zucht wurde so geführt, dass alle Elterntiere homozygot für den Oct4-EGFP-Reporter waren. Die Vatertiere waren für das LacZ-Gen hemizygot, welches die Muttertiere nicht trugen. Diese genetische Konstellation war notwendig, da für das LacZ-Gen reinerbige Mäuse eine reduzierte Vitalität und Lebenserwartung aufweisen (FRIEDRICH u. SORIANO 1991). Das LacZ-Gen kodiert für das Enzym β-Galaktosidase, dessen hydrolytische Aktivität mit Hilfe einer blauen Farbreaktion dargestellt werden kann und hier als genetischer Reporter verwendet wird (GORING et al. 1987). Aus den OG2xRosaLacZ-Tieren wurden die Spenderzellen für das Transplantationsexperiment gewonnen. Die Verwendung der β-Galaktosidaseaktivität als zweiten genetischen Reporter erfolgte, um die transplantierten Zellen und ihre Abkömmlinge auch nach einer möglichen Differenzierung und dem damit verbundenen Verlust der Oct4-EGFP-Expression in den Empfängertieren detektieren zu können.
Als Empfängertiere für die Transplantationsexperimente wurden Mäuse des Stammes NMRI-nu verwendet. Ihr aufgrund des fehlenden Thymus defizitäres Immunsystem ermöglicht die Applikation von allogenem Material (z.B. Zellen einer anderen Maus) in den Organismus, ohne dass es zu Abstoßungsreaktionen kommt.
Gewebe von Mäusen der transgenen Mauslinie C57/Bl6-Tg(ACTB-EGFP)10Fb wurden als Positivkontrollen für vorhandene EGFP-Expression eingesetzt. Die EGFP-Expression wird bei diesen Tieren durch den in vielen Zelltypen aktiven β-Actin-Promotor aus dem Huhn kontrolliert und durch den Cytomegalievirus-Enhancer zusätzlich verstärkt. Dies führt zu einem hohen Anteil stark EGFP+-Zellen in fast allen Geweben dieser transgenen Mäuse, so dass bereits makroskopisch bei normalem
Licht eine grünliche Färbung der Akren zu erkennen ist. Da für das Transgen homozygote Tiere innerhalb der ersten zwei Lebenswochen versterben, wurden für die Organentnahme hemizygote Merkmalsträger verwendet (MIYAZAKI et al. 1989;
NIWA et al. 1991; OKABE et al. 1997).
Zellen und Gewebe, die in den histologischen Untersuchungen als Negativkontrolle dienten, entstammen C57Bl/6J Wildtypmäusen aus der abteilungseigenen Zucht.
Diese Kontrolltiere entsprachen in Alter, Gewicht und Geschlecht den Mäusen der jeweiligen Untersuchungsgruppe.
3.2.6.3. Tierhaltung
Die für die Experimente erforderlichen Mäuse wurden in den Gebäuden des Zentralen Tierlabors der Medizinischen Hochschule Hannover gehalten und von dem dortigen Personal versorgt. Die Tierhaltung erfolgte unter IVC-Bedingungen: Maximal fünf Tiere bzw. ein Zuchtweibchen mit ihrem Wurf wurden in Makrolonkäfigen mit individueller Zu- und Abluft in IVC-Regalen gehalten. Die Raumtemperatur betrug 20±1 °C, die Luftfeuchtigkeit lag bei 60±5 % und das Lichtregime gab jeweils zwölf Stunden Helligkeit und Dunkelheit vor. Die Käfige selbst waren mit Holzgranulat als Einstreu und Nestlets (gepresste Zellstoffpads) ausgestattet. Fütterung und Tränke erfolgten ad libitum über pelletiertes Alleinfutter aus Futterraufen bzw.
Wasserflaschen mit Tränkenippel.
Die aus Münster bezogenen OG2-Elterntiere befanden sich vor der Integration in den Bestand in einer achtwöchigen Quarantäne.
Für die Erzeugung jeweils gleichaltriger OG2- und Wildtypwürfe wurden die Zuchttiere zeitgleich verpaart und nach drei Tagen wieder voneinander getrennt. Der Wurftermin wurde durch tägliche morgendliche Kontrolle der tragenden Weibchen ermittelt. Nach 21 Tagen wurden die Wurfgeschwister von der Mutter nach Geschlechtern getrennt abgesetzt und mittels PCR genotypisiert.
3.2.7. Zellen
Als Positivkontrollen für die Genexpressionsanalysen wurde RNA pluripotenter Zelllinien aus OG2-Mäusen eingesetzt. Murine ESCs wurden von Dr. Tobias Cantz, AG Rebirth der MHH, bereitgestellt. RNA von iPS-Zellen wurde für diese Arbeiten von Dr. Dr. Axel Schambach, Abteilung experimentelle Hämatologie der MHH, zur Verfügung gestellt.
3.3. Übersicht über den Studienaufbau
Die erste Versuchsphase diente der Validierung des methodischen Ansatzes, den OG2-Mausstamm als Reporter für Oct4+-Zellen einzusetzen. In der Folge wurden Oct4+EGFP+-Stammzellen in verschiedenen Geweben dieser Mäuse quantifiziert und mit verschiedenen Methoden charakterisiert. Abbildung 6 bietet einen Überblick über den Versuchsaufbau.
Das Vorkommen von Oct4+ in Zellen des frühen Embryos und der Keimbahn wurde vielfach beschrieben (SCHÖLER et al. 1990a; NICHOLS et al. 1998; PESCE u.
SCHÖLER 2000; NIWA 2001; PESCE u. SCHÖLER 2001). Aus diesem Grund wurden die durchflusszytometrischen und histologischen Techniken zur EGFP-Detektion zunächst an Hodengewebe der transgenen Mäuse etabliert und die Oct4-Expression ihrer EGFP+-Zellen geprüft.
Die durchflusszytometrischen Reihenuntersuchungen der OG2-Mäuse wurden durchgeführt, um postnatale Oct4-Expression darzustellen und den jeweiligen Anteil Oct4+EGFP+-Zellen zu ermitteln. Die ausgewählten Gewebe werden in der aktuellen Literatur als mögliche Stammzellnischen diskutiert (TAKEDA et al. 1992; JIANG et al.
2002; GOOLSBY et al. 2003; DYCE et al. 2004; POCHAMPALLY et al. 2004; J.
JOHNSON et al. 2005; KUES et al. 2005; MORISCOT et al. 2005; D'IPPOLITO et al.
2006; IZADPANAH et al. 2006; KUCIA et al. 2006a; KUCIA et al. 2006b; LAMOURY et al. 2006; MONGAN et al. 2006; NAYERNIA et al. 2006; REDVERS et al. 2006;
REN et al. 2006; YU et al. 2006; PALLANTE et al. 2007) oder weisen ein hohes Selbsterneuerungspotential auf. Unter Berücksichtigung einer möglicherweise bestehenden alters- oder geschlechtsabhängigen Schwankung der Oct4-Gehalte
wurden die Gewebe infantiler, pubertärer und adulter Männchen und Weibchen analysiert. Zusätzlich wurden die Zellen molekularbiologisch charakterisiert und histomorphologisch dargestellt.
Abbildung 6: Versuchsaufbau.
Die experimentellen Arbeiten untergliederten sich in drei aufeinander aufbauende Versuchsabschnitte. Als erstes wurden die erforderlichen Methoden und Techniken etabliert und ihre Zuverlässigkeit überprüft. Darauf folgte die systematische durchflusszytometrische Untersuchung von Geweben aus Oct4-Reportermäusen auf das Vorkommen Oct4+EGFP+-Zellen. Positive Befunde wurden mit histologischen und molekularbiologischen Methoden verifiziert. Im Anschluss erfolgte die weitere Charakterisierung der potentiellen Stammzellpopulation. Das Expressionsmuster von Oberflächenrezeptoren und Stammzellmarkern wurde durchflusszytometrisch und mittels qRT-PCR dargestellt. Schließlich sollte in einem in vivo-Ischämie-Modell durch die Transplantation aufgereinigter Oct4+EGFP+-Zellen Informationen über das therapeutische Potential der Stammzellen gewonnen werden.
Die Eigenschaften und das Potential der Oct4+EGFP+-Zellen in vivo waren Gegenstand zweier weiterer experimenteller Ansätze: die Auswirkung eines Traumas (Wundmodell, Herzinfarktmodell) auf die Stammzellpopulation sollte Aufschluss über ihre Rolle bei Regenerations- und Reparationsprozessen geben. Erfolgreiche Stammzelltherapie setzt voraus, dass sich transplantierte Zellen abseits ihrer angestammten Gewebenische im Empfängergewebe ansiedeln können. Dieses Potential wurde in Transplantationsexperimenten (Hinterlaufischämiemodell) geprüft.
3.4. Methoden
Sofern keine abweichenden Angaben gemacht werden, wurden sämtliche in dieser Schrift beschriebenen Arbeiten von der Autorin selbst durchgeführt.
3.4.1. Tierexperimentelle Techniken 3.4.1.1. Wundmodell
Im Wundmodell sollten regenerative und reparative Prozesse der Haut provoziert werden, um die dabei auftretenden Effekte und Reaktionen von Oct4+-Stammzellen beobachten zu können. Für die Untersuchungen wurden adulte Mäuse (sechs Wochen p.n.) des Stammes OG2 eingesetzt. Als Negativkontrollen dienten C57Bl/6J-Mäuse des gleichen Alters (Tab.1).
Tabelle 1: Verteilung der Tiere im Wundmodell
Wie in Abbildung 7 dargestellt, wurden dafür in die Haut der kaudalen Rückenhälfte vier in Größe und Tiefe gleichartige Stanzlöcher gesetzt.
Das chirurgische Toleranzstadium zur schmerzfreien Durchführung des Eingriffes wurde durch eine intraperitoneale Injektionsnarkose herbeigeführt (100 mg/ kg Ketamin, 4 mg/ kg Xylazin). Zur Analgesie wurden 5 mg/ kg Carprofen (Rimadyl®) subkutan injiziert. Um einer Hypothermie vorzubeugen, befanden sich die Tiere während des Eingriffes auf einer temperierten Unterlage. Die Augen wurden durch Augensalbe geschützt (Bepanthen® Augen- und Nasensalbe). Das Operationsfeld wurde freigeschoren, entfettet und desinfiziert. Mit einer runden 4 mm-Biopsie-Stanze wurden in die Haut des kaudalen Rückenbereiches vier gleiche Läsionen gesetzt. Die dabei gewonnenen Hautproben (Haut t0) wurden nach Entfernung der Unterhaut für die folgenden FACS-Analysen in PBS mit 5 % FCS auf Eis gelagert.
Die verwundeten Mäuse wurden nach drei oder sieben Tagen (Wunde t3 bzw.
Wunde t7) getötet und die Haut durchflusszytometrisch analysiert.
Abbildung 7: Wundmodell.
Mit einer runden Biopsiestanze wurden den Tieren vier gleichartige Stanzlöcher in die kaudale Rückenhaut gesetzt. Die entfernten Hautstücke wurden direkt nach der Entnahme (Haut t0), die restliche Haut nach drei Tagen (Wunde t3) oder sieben Tagen (Wunde t7) durchflusszytometrisch untersucht.
3.4.1.2. Herzinfarktmodell
Durch die Unterbindung eines Herzkranzgefäßes wurde experimentell eine myokardiale Ischämie in den Mäuseherzen erzeugt, wie sie beim akuten Herzinfarkt des Menschen vorkommt. Diese Eingriffe sollten Aufschluss über eine Migration Oct4+-Stammzellen in den geschädigten Herzmuskel geben.
Im Rahmen des perioperativen Schmerzmanagements wurde den Tieren vor Beginn des Eingriffes Carprofen (Rimadyl®; 5 mg/ kg) subkutan injiziert (PADDLEFORD 1992; HELLEBREKERS 2001). Nachdem die Mäuse durch Einatmen eines Sauerstoff-Isoflurangemisches in einer Narkosebox ein intubationsfähiges Narkosestadium erreicht hatten, wurde die Anästhesie über einen endotrachealen Tubus mit 1,5 % Isofluran unter künstlicher Beatmung aufrechterhalten. Zur Vorbeugung einer Hypothermie befanden sich die Tiere während des Eingriffs auf einer wärmenden Unterlage. Eine Austrocknung der Augen wurde durch Augensalbe verhindert. Alle chirurgischen Tätigkeiten an den Mäusen fanden mit Hilfe eines
binokularen OP-Mikroskopes statt. Das OP-Feld wurde vor der Inzision geschoren, entfettet und desinfiziert. Der chirurgische Zugang zum Herzen erfolgte über eine linksseitige Thorakotomie im zweiten Interkostalraum. Wie in Abbildung 8 dargestellt, wurde die myokardiale Ischämie durch Ligatur des Ramus interventricularis anterior der linken Koronararterie herbeigeführt. Der Verschluss der Brusthöhle erfolgte in drei Schichten (Rippen und Interkostalmuskulatur, Pektoralismuskulatur, Haut). Bis zum Einsetzen der Spontanatmung wurden die Mäuse mit Sauerstoff beatmet und nach der Extubation in eine temperierte Aufwachbox verbracht Die weitere postoperative Versorgung umfasste Carprofen-Injektionen zur Analgesie und parenterale Flüssigkeitssubstitution mit Vollelektrolytlösungen.
Abbildung 8: Ligatur des Ramus interventricularis anterior der linken Koronararterie
Bild b dient als Legende der in Bild a dargestellten Strukturen:Die unterbrochene Kontur markiert das freiliegende Myokard nach Eröffnung des Perikards am offenen Thorax. Im Bereich des grauen Feldes befindet sich die Ischämiezone distal des durch die Ligatur L unterbundenen Gefäßes mit ihrer peripheren hyperämischen Zone (rot).
Mäuse des Stammes OG2 wurden im Alter von zwölf Wochen in diesem Modell untersucht (n = 8). Die Tiere wurden drei Tage nach der Operation getötet, die Herzen entnommen und durchflusszytometrisch untersucht.
3.4.1.3. Hinterlaufischämie-Modell und Zelltransplantation
Das therapeutische Potential Oct4+-Stammzellen wurde im Hinterlaufischämie-Modell mit nachfolgender Zelltransplantation untersucht. Der chirurgische Eingriff wurde von Dr. Anne Limbourg, Abteilung Kardiologie und Angiologie der MHH, durchgeführt.
Der Mausstamm NMRI-nu wurde für die Hinterlaufischämie-Operationen verwendet.
Die Narkose und die perioperative Versorgung der Tiere erfolgten gemäß den Ausführungen im Abschnitt „Wundmodell“. Nach Desinfektion der rechten Hintergliedmaße wurde über einen inguinalen Zugang das Gefäß-Nervenbündel aus Femoralarterie, -vene und -nerv freipräpariert. Die Femoralarterie wurde daraufhin weit proximal, einschließlich der oberflächlichen und tiefen Äste, mit einem 6-0 Seidenfaden an zwei Stellen unterbunden. Der zwischen den beiden Ligaturen befindliche Gefäßabschnitt wurde reseziert und die Hautwunde durch Einzelhefte verschlossen.
Die Zelltransplantation wurde direkt nach Verschluss der Operationswunde durchgeführt. Es wurden durch FACS-Sorting aufgereinigte EGFP+- (n = 3) und EGFP--Zellen (Kontrolltiere, n = 3) aus den OG2xRosaLacZ-Kreuzungstieren
Die Zelltransplantation wurde direkt nach Verschluss der Operationswunde durchgeführt. Es wurden durch FACS-Sorting aufgereinigte EGFP+- (n = 3) und EGFP--Zellen (Kontrolltiere, n = 3) aus den OG2xRosaLacZ-Kreuzungstieren