Identifizierung und Charakterisierung einer postnatalen Oct4 positiven Zellpopulation in der Maus
Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
( Dr. med. vet. )
vorgelegt von
Sabine Schnabel Offenbach am Main
Hannover 2010
wissenschaftliche Betreuung:
Prof. Dr. rer. nat. Hassan Y. Naim Institut für Physiologische Chemie Tierärztliche Hochschule Hannover
Prof. Dr. med. Helmut Drexler († 13.09.2009) Abteilung Kardiologie und Angiologie
Medizinische Hochschule Hannover
1. Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. Hassan Y. Naim 2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Ralph Brehm
Tag der mündlichen Prüfung: 22.11.2010
Meinen lieben Eltern.
2. Literaturübersicht ... 13
2.1. Stammzellen ... 13
2.1.1. Embryonale Stammzellen ... 14
2.1.2. Adulte Stammzellen ... 16
2.1.3. Induzierte pluripotente Stammzellen ... 25
2.1.4. Pluripotenzfaktoren ... 30
3. Geräte, Material und Methoden ... 39
3.1. Geräte ... 39
3.2. Material ... 39
3.2.1. Laborbedarf... 39
3.2.2. Reagenzien, Chemikalien ... 40
3.2.3. Antikörper ... 42
3.2.4. Primer ... 43
3.2.5. Lösungen und Puffer ... 44
3.2.6. Versuchstiere ... 49
3.2.7. Zellen ... 53
3.3. Übersicht über den Studienaufbau ... 53
3.4. Methoden ... 55
3.4.1. Tierexperimentelle Techniken ... 55
3.4.2. Durchflusszytometrische Analysen ... 59
3.4.3. Zytospin ... 72
3.4.4. Histologie ... 72
3.4.5. Molekularbiologische Arbeiten ... 75
3.4.6. Statistik ... 78
4. Ergebnisse ... 79
4.1. Methodenetablierung für die durchflusszytometrische Analyse ... 79
4.1.1. Zellisolation aus verschiedenen Geweben ... 79
4.1.2. Autofluoreszenzkorrektur ... 80
4.3. Oct4 EGFP -Zellen im murinen Hoden ... 88
4.4. Oct4+EGFP+-Zellen in der murinen Haut ... 97
4.4.1. Methodische Beeinflussung der durchflusszytometrischen Analyse ... 97
4.4.2. Kinetik der Oct4+EGFP+-Zellpopulation der Haut ... 103
4.4.3. Mikroskopische Betrachtung der Oct4+EGFP+-Zellen ... 108
4.4.4. Molekularbiologische Charakterisierung der Oct4+EGFP+-Zellen ... 116
4.5. Kinetik der Oct4+EGFP+-Zellen im Wundmodell ... 121
4.6. Transplantation Oct4+EGFP+-Zellen in ischämisches Gewebe... 124
5. Diskussion ... 129
5.1. Methodischer Ansatz ... 129
5.1.1. Oct4 als Pluripotenzmarker ... 129
5.1.2. Nachweis von Oct4 in der transgenen Reportermauslinie OG2 ... 131
5.2. Reihenuntersuchung ausgewählter Gewebe auf Oct4+EGFP+-Zellen ... 133
5.3. Oct4+EGFP+-Zellen der Haut ... 135
5.3.1. Einfluss der Probenpräparation auf die FACS-Analyse ... 135
5.3.2. Altersabhängige Populationsgröße Oct4+EGFP+-Zellen ... 137
5.3.3. Charakter der dermalen Oct4+EGFP+-Zellen ... 141
5.4. Therapeutisches Potential Oct4+EGFP+-Zellen ... 143
5.4.1. Hautwundenmodell ... 143
5.4.2. Hinterlaufischämiemodell ... 145
5.5. Schlussbetrachtung ... 146
6. Zusammenfassung ... 149
7. Summary ... 151
8. Quellenverzeichnis ... 153
9. Abkürzungsverzeichnis ... 206
10. Veröffentlichungen ... 210
11. Danksagung... 211
1. Einleitung
Nicht alle Säugetiergewebe sind in der Lage, ständige Zellverluste oder pathologisch veränderte Strukturen durch regenerative Prozesse zu kompensieren. Die funktionelle und strukturelle Spezialisierung von Zellen erfordert in vielen Organen ihre vollständige Ausdifferenzierung. Solche Zellen können nicht mehr in den Zellzyklus eintreten um sich zu teilen, sie sind postmitotisch. Dies hat zur Folge, dass eine mit Zelluntergang verbundene Schädigung postmitotischer Gewebe eine Proliferation der umliegenden stromalen Strukturen hervorruft. Am Ende dieser Reparaturprozesse steht keine restitutio ad integrum durch funktionell und strukturell gleichwertiges Gewebe, sondern lediglich eine Narbenheilung durch meist bindegewebigen Ersatz.
Die regenerative Stammzellforschung strebt nach Verfahren zur echten Wiederherstellung geschädigter Organe durch den therapeutischen Einsatz von nicht vollständig ausdifferenzierten Zellen. Ziel ist dabei eine lokale Integration transplantierter Zellen oder die Migration körpereigener Stammzellen in das geschädigte Gewebe. Die Stammzellen sollen durch Proliferation und gewebetypische Ausdifferenzierung Substanz- und Funktionsverluste ausgleichen und somit die Leistungsfähigkeit des betroffenen Organs wiederherstellen. Beispiele für Erkrankungen, deren Therapierbarkeit durch regenerative Methoden bedeutend verbessert würden, sind Parkinson, Schlaganfall und Herzinsuffizienz.
Im Hinblick auf Differenzierungsfähigkeit und Vielseitigkeit haben embryonale Stammzellen das höchste regenerative Potential. Der Erforschung und dem Einsatz dieser Zellen sind jedoch vor allem aufgrund ethischer Grundsätze enge Grenzen gesetzt. Zusätzlich sind auch pathophysiologische Charakteristika dieses Zelltyps (v.a. tumoröse Entartung) hinsichtlich ihrer therapeutischen Verwendung problematisch.
Besonders interessant und vielversprechend ist die Anwendung von Stammzellen aus dem Körper des betroffenen Patienten, da auf diese Weise das bislang noch ungelöste Problem der immunologischen Abstoßung xenogener und allogener Transplantate durch den Empfängerorganismus umgangen werden kann. Derzeit ist
allerdings noch keine adulte Stammzellpopulation bekannt, die das erforderliche therapeutische Potential reproduzierbar aufweist.
Die vorliegende Arbeit bezweckt deshalb die Erschließung eines primitiven Stammzellpools im postnatalen Organismus, der die Vorteile der bisher bekannten Zellherkünfte in sich vereint, ohne die jeweiligen, einem klinischen Einsatz widersprechenden Merkmale aufzuweisen.
Eine durchflusszytometrische Reihenuntersuchung diente dabei der Identifizierung von Geweben, die eine solche Stammzellpopulation beherbergen. Als Indikator wurde Oct4, ein Schlüsselstammzellmarker für hohes Entwicklungspotential, gewählt. An die Isolation der Oct4+-Zellen aus Oct4-EGFP-Reportermäusen schloss sich die weitere Erfassung ihrer charakteristischen Merkmale an. Die Überprüfung der Zellen auf ihre therapeutische Eignung erfolgte in Transplantationsstudien. In einem Verletzungsmodell wurden weitere Informationen über die Beteiligung dieser Zellen an Reparations- und Regenerationsprozessen ermittelt.
Diese Beschreibung einer bislang unbekannten Population Oct4+-Zellen in der adulten Maus bezweckt einen grundlegenden Beitrag zur Etablierung klinisch relevanter Verfahren der regenerativen Stammzelltherapie zu leisten.
2. Literaturübersicht
Zellen gehören grundsätzlich dem teilungsaktiven (intermitotisch) oder nicht- teilungsaktiven Typ (postmitotisch) an (HAM 1965; LOO et al. 1987). Letztere können vollständig teilungsinkompetent (fixiert postmitotisch) sein (z.B. Haarzellen des Hörorgans, obere Zellschichten der Epidermis) oder sich in einem Ruhestadium, der G0-Phase des Zellzyklus, befinden. Bei Bedarf treten diese reversibel postmitotischen Zellen wieder in das Teilungsgeschehen ein (STÜNZI u. WEISS 1990). Zellersatz und Geweberegeneration erfolgen in Mausergeweben mit hohem Zellverschleiß (z.B. Knochenmark, Haut) durch intermitotische Gewebestammzellen.
In Organen mit geringer Zellerneuerungsrate (z.B. Leber, Niere, Knochen) erfüllen reversibel postmitotische Zellen diese Aufgaben (STÜNZI u. WEISS 1990).
2.1. Stammzellen
Stammzellen sind autoregenerative Populationen, die durch asymmetrische Teilungsprozesse stärker spezialisierte Zelltypen hervorbringen können (BISHOP et al. 2002). Bei diesen Zellteilungen entstehen im Regelfall jeweils eine sich weiter vermehrende und schließlich differenzierende Tochterzelle und eine die Mutterzelle ersetzende Stammzelle (ALISON et al. 2002). Stammzellen selbst sind relativ undifferenziert und zeigen im Gegensatz zu ihren Abkömmlingen keine funktionelle Spezialisierung (ALISON et al. 2002). Abhängig von ihrem Entwicklungs- und Differenzierungspotential werden verschiedene Stammzellklassen unterschieden (PAN et al. 2002):
Die primitivste aller Stammzellen ist die Zygote. Die befruchtete Eizelle kann alle Gewebe des Embryos inklusive seiner plazentären Derivate bilden und ist somit totipotent. Bis zum Morulastadium sind auch die ersten Furchungszellen noch in der Lage, wie die Zygote einen kompletten Organismus zu formen.
Die Blastomeren der inneren Zellmasse der Blastozyste sind pluripotent. Sie bilden die drei Keimblätter aus und sind somit Vorläufer aller Zelltypen des späteren Organismus. Sie sind jedoch nicht zur Plazentabildung fähig. Embryonale Stammzellen sind kultivierte Blastomeren der inneren Zellmasse und ebenso
pluripotent. Pluripotente Stammzellen existieren nur kurze Zeit während der Embryonalentwicklung. In extraembryonalen Geweben bilden sie Stammzelltumoren aus (SOLTER et al. 1970; DIWAN u. STEVENS 1976). Die aktuelle Literatur nennt folgende Kriterien die erfüllt sein müssen, um Zellen als pluripotent zu bezeichnen:
Teratombildung außerhalb des Embryos, Chimärenbildung mit Beteiligung an der Keimbahn nach Blastozysteninjektion und tetraploide Komplementierung (LENGNER et al. 2008).
Die gewebeständigen Stammzellen adulter Organismen sind häufig multipotent. Sie sind Vorläufer verschiedener differenzierter und spezialisierter Zelltypen eines bestimmten Gewebes, können sich jedoch nicht mehr in alle Zelltypen des Körpers entwickeln. Die Stammzellen der Dünndarmschleimhaut sind ein solches Beispiel:
Ihre Tochterzellen differenzieren sich in alle Zelltypen des Jejunumepithels (ALISON et al. 2002).
Unipotente Stammzellen (z.B. Fibroblasten) haben nur die Möglichkeit, einen differenzierten Zelltyp hervorzubringen (WAGERS u. WEISSMAN 2004).
Die hier dargestellte klassische Hierarchie zur Einordnung von Stammzellen nach ihrem Entwicklungspotential bedarf allerdings seit Beschreibung der sog.
Transdifferenzierung von Zellen einer Überarbeitung (BLAU et al. 2001; BISHOP et al. 2002). Als Transdifferenzierung wird die Umwandlung eines bereits differenzierten Zelltyps in eine Zelle einer anderen Linie bezeichnet (BROCKES u. KUMAR 2002).
Dabei verliert die Ursprungszelle alle Charakteristika und Funktionen ihrer „alten“
Identität und erwirbt stattdessen vollständig den neuen Phänotyp (WAGERS u.
WEISSMAN 2004).
2.1.1. Embryonale Stammzellen
Embryonale Stammzellen (embryonic stem cells, ESCs) wurden vor knapp dreißig Jahren erstmals aus frühen murinen Embryonen isoliert und kultiviert (EVANS u.
KAUFMAN 1981; MARTIN 1981). 1998 wurde dieses Verfahren erfolgreich auch auf menschliche Zellen übertragen (THOMSON et al. 1998).
ESCs werden aus der inneren Zellmasse der Blastozyste gewonnen. Als pluripotente Zellen sind sie Vorläufer aller fetaler Zelltypen, einschließlich der Keimzellen (BRADLEY et al. 1984; GARDNER u. BEDDINGTON 1988; NAGY et al. 1990). In vitro können sie in ein breites Spektrum differenzierter Zelltypen transformiert werden (BEDDINGTON u. ROBERTSON 1989; ODORICO et al. 2001; WOBUS et al. 2001).
Deren Populationen sind allerdings stets heterogen, so dass vor einem denkbaren therapeutischen Einsatz Aufreinigungen notwendig wären (BISHOP et al. 2002).
Die Verwendung humaner ESCs für Forschungs- und Therapiezwecke ist in vielerlei Hinsicht problematisch. Ethische, immunologische und medizinische Einwände widersprechen nach dem jetzigen Kenntnisstand einer Etablierung klinisch relevanter Verfahren:
Die Isolation der pluripotenten Stammzellen aus Blastozysten setzt immer eine Zerstörung des Keimes voraus (YAMANAKA 2007). Über die moralische Rechtmäßigkeit des Einsatzes menschlicher Embryonen und die ethische Grenzziehung, ab wann menschliches Leben existiert und schützenswert ist, sind seither politische und gesellschaftliche Diskussionen entbrannt (ANNAS et al. 1999;
MCLAREN 2001; ROBERTSON 2001; KANATSU-SHINOHARA u. SHINOHARA 2006).
Die Applikation von ESCs oder aus ihnen abgeleiteter Gewebe- oder Zelllinien stellt immer eine allogene Transplantation dar (KANATSU-SHINOHARA u. SHINOHARA 2006). Das Immunsystem des Empfängers erkennt das Material als körperfremd und leitet Abwehrreaktionen ein. Ohne eine mit schweren Nebenwirkungen und einem erhöhten Infektionsrisiko behaftete Unterdrückung des Immunsystems führen diese Mechanismen zur Abstoßung des Transplantates (ALISON et al. 2002; DRUKKER u.
BENVENISTY 2004; LERI et al. 2005).
Pluripotente Zellen sind, auch wenn sie nur vorübergehend im Embryo vorhanden sind, potentiell unsterblich. Nach ihrer ektopen Verpflanzung entwickeln sie sehr häufig Stammzelltumoren, Teratome und Teratokarzinome - ein Umstand, der in der klinischen Anwendung nicht toleriert werden kann (SOLTER et al. 1970; DIWAN u.
STEVENS 1976; THOMSON et al. 1998; REUBINOFF et al. 2000; TAKADA et al.
2002).
ESCs sind die ersten pluripotenten Zellen, die in Kultur vermehrt und untersucht werden konnten. Sie besitzen ein großes Entwicklungs- und Differenzierungspotential. Das breite Spektrum dieser Zellen ist jedoch für klinische Belange aufgrund ungelöster ethischer und medizinisch-biologischer Probleme nicht nutzbar.
2.1.2. Adulte Stammzellen
Adulte Gewebestammzellen erhalten ihre Gewebe in einem dynamischen Gleichgewicht (POTTEN u. LOEFFLER 1990). Sie liefern in Organen wie Haut und Dünndarm kontinuierlich Ersatz für Zellverluste durch Trauma, Alter oder Krankheit (FUCHS u. SEGRE 2000; WEISSMAN 2000).
Adulte Stammzellen sind nur in sehr geringer Zahl in den jeweiligen postmitotischen Geweben vertreten. Selbst das hochregenerative Dünndarmepithel enthält nur vier bis fünf Stammzellen pro Krypte, was knapp zwei Prozent der jejunalen Gesamtpopulation entspricht (BJERKNES u. CHENG 1999). Im Knochenmark kommt sogar nur eine multipotente hämatopoetische Stammzelle auf 10.000 Gesamtblutzellen (ALISON et al. 2002). Der Anteil von Typ A-Spermatogonien an der Gesamtzahl testikulärer Zellen beträgt im adulten Hoden eine pro 4000 Zellen (TEGELENBOSCH u. DE ROOIJ 1993). Diese Gewebestammzellen durchlaufen ihre Teilungszyklen langsam (slow cycling cells), wodurch die DNA-replikationsassoziierte Fehlerrate minimiert wird (LAVKER u. SUN 2000). Der große Bedarf spezialisierter Tochterzellen wird durch hoch teilungsaktive Zwischengenerationen erreicht (ALISON et al. 2002).
Seit den ersten Hinweisen, dass adulte Stammzellen möglicherweise ein sehr viel breiteres Differenzierungsspektrum besitzen als lange Zeit angenommen, hat sich die Erforschung dieses Potentials zu einem der intensivsten Felder der regenerativen Medizin entwickelt (BLAU et al. 2001; TADOKORO et al. 2002). Dennoch sind die regulatorischen Mechanismen von Stammzelldifferenzierung und -proliferation nicht
aufgeklärt (TADOKORO et al. 2002). Ebenso ist bislang noch kein zuverlässiger, universeller Marker für adulte Stammzellen definiert worden (LAVKER u. SUN 2000;
BLAU et al. 2001).
Trotz vielversprechender Berichte über die Transdifferenzierung somatischer adulter Gewebezellen konnte keine der zahlreichen Studien über regenerative Therapieverfahren eine Transdifferenzierung dieser linienrestringierten Stammzellen beweisen (ORLIC et al. 2001a; BALSAM et al. 2004; MURRY et al. 2004; NYGREN et al. 2004; PLANAT-BENARD et al. 2004; LIMBOURG et al. 2005; YOON et al.
2005; ANVERSA et al. 2006; LEOR et al. 2006; MENDEZ-FERRER et al. 2006;
MURRY et al. 2006; TEMPLIN et al. 2006). Ebenso bleibt die Existenz pluripotenter Stammzellnischen post partum umstritten: Bisher wurde noch keine somatische Stammzellpopulation beschrieben, welche die Pluripotenzkriterien wie ESCs erfüllt (LENGNER et al. 2008). Eine zuverlässige Generierung von Chimären nach Blastozysteninjektion gelingt mit keiner der bekannten adulten Stammzellen (RATAJCZAK et al. 2008).
2.1.2.1. Hämatopoetisches System
Das Knochenmark als Ort lebenslanger Hämatopoese ist rasch in den Fokus der Stammzellforschung gerückt (NAYERNIA et al. 2006). Vielfältige Modellvorstellungen wurden erarbeitet, die diesen Stammzellpool als mögliche Quelle pluripotenter Vorläuferzellen betrachten (HUGHES 2002).
Im adulten Knochenmark finden sich verschiedene Zellpopulationen mit regenerativem Potential (FORBES et al. 2002): hämatopoetische Stammzellen (hematopoietic stem cell, HSC), mesenchymale Stammzellen (mesenchymal stem cell, MSC), (PITTENGER et al. 1999; TOMITA et al. 1999; JIANG et al. 2002), side population Zellen (SP-Zellen) (JACKSON et al. 2001) und endotheliale Progenitorzellen (BARBASH u. LEOR 2006). HSCs stellen die Vorläufer der lymphatischen und myeloischen Blutzellreihen dar, MSCs sind fibroblastische Zellen, die das Mikromilieu für die HSCs gestalten und sich zu Osteoblasten, Chondrozyten und Myozyten der Skelettmuskulatur (ZIMMET u. HARE 2005) entwickeln können.
Die stromale Stammzellpopulation im Knochenmark ist sehr vielseitig und nicht mit einem eindeutigen Markerset isolier- und charakterisierbar. Dies führt neben den großen methodischen Variabilitäten zu Schwierigkeiten bei dem Vergleich unterschiedlicher Studien, die sich mit diesen Zellen beschäftigen. Möglicherweise ist dies der Grund für die gegensätzlichen Bewertungen des Potentials dieser Stammzellen (BELEMA BEDADA et al. 2005).
Zahlreiche Untersuchungen zeigten, dass adulte Knochenmarkstammzellen funktionale Plastizität besitzen und abhängig von ihrem Umgebungsmilieu nicht- hämatopoetische Zellcharakteristika entwickeln können (PEREIRA et al. 1995;
BITTNER et al. 1999; PETERSEN et al. 1999; LAGASSE et al. 2000; KUCIA et al.
2006a). Experimentell ist es z.B. gelungen, MSCs in Zellen aus Leber, Niere, Herz und Gehirn zu entwickeln (JIANG et al. 2002; GROVE et al. 2004). Andere Autoren beobachten die dauerhafte Einwanderung von MSCs in das Herz (TOMITA et al.
1999; WANG et al. 2000; TOMA et al. 2002) oder die Beteiligung von MSC- Abkömmlingen an allen drei Keimblättern (JIANG et al. 2002). Es wird sogar berichtet, Zellen mit Ähnlichkeit zu männlichen Keimzellen aus adultem Knochenmark entwickelt zu haben (NAYERNIA et al. 2006). Einige Gruppen beschreiben Zellpopulationen im Knochenmark adulter Mäuse, die embryonale Marker exprimieren (KUCIA et al. 2006a; ZENG et al. 2006; ZUBA-SURMA et al.
2008).
Verschiedene Studien beobachteten sogar kardiale Regeneration nach Herzinfarkt durch HSCs im Mausmodell (ORLIC et al. 2001a; ORLIC et al. 2001b; KAJSTURA et al. 2005; IWASAKI et al. 2006). Andere Gruppen konnten diese Ergebnisse in ihren Untersuchungen jedoch nicht nachvollziehen (BALSAM et al. 2004; MURRY et al.
2004; NYGREN et al. 2004; GRUH et al. 2006), so dass diese Arbeiten nach wie vor kontrovers diskutiert werden (ALISON et al. 2002; WAGERS u. WEISSMAN 2004;
ANVERSA et al. 2006; MENASCHE 2006; ANVERSA et al. 2007). Dabei erwies sich die Verabreichung von Knochenmarkstammzellen nach Herzinfarkt in ersten klinischen Studien an Menschen als sicher und therapeutisch vielversprechend (ASSMUS et al. 2002; WOLLERT u. DREXLER 2005). Möglicherweise liegen diesen positiven Effekten auf das geschädigte Myokard aber gar keine echte Ansiedlung
oder Transdifferenzierung transplantierter Zellen zugrunde sondern vielmehr parakrine Effekte der Stammzellen (BEHFAR et al. 2002; LIMBOURG et al. 2005;
YOON et al. 2005).
2.1.2.2. Keimdrüsen
Keimzellen stellen eine besondere Stammzellpopulation dar. Ihre Aufgabe ist es, die gesamte Erbinformation von einer Generation zur nächsten weiterzugeben und damit den Erhalt der Art sicherzustellen (KUBOTA u. BRINSTER 2006). Aus der Vereinigung von Spermium und Eizelle entsteht die totipotente Zygote, aus der ein vollständiger neuer Organismus entstehen kann. Die Keimzellen gehen auf Primordialkeimzellen zurück, die sich schon in der embryonalen Entwicklungsphase separat von den drei Keimblättern entwickeln (LAWSON u. HAGE 1994; MCLAREN 2000). Sie sind auch die einzigen Zellen, die während der gesamten Entwicklung (exklusive bestimmter meiotischer Reifungsstadien) den Pluripotenzfaktor Oct4 exprimieren. In anderen Zellen wird Oct4 nach der Formierung der inneren Zellmasse im Zuge von Differenzierungsvorgängen herunterreguliert.
Auch die Gameten sind in das Blickfeld regenerativer Stammzellforschung gerückt:
Embryonale Keimzellen und aus neonatalen murinen Hoden gewonnene Keimbahn- Stammzellen wurden als pluripotent beschrieben (MATSUI et al. 1992; KANATSU- SHINOHARA et al. 2004). Ebenso aus den Hoden adulter Säugetiere konnten bereits pluripotente Stammzellen gewonnen werden (GUAN et al. 2006; IZADYAR et al. 2008). Nach Kultur unter ESC-ähnlichen Bedingungen wurden typische ESC- Zellmarker exprimiert (Oct4, SSEA-1, Nanog). Diese multipotenten adulten Keimbahn-Stammzellen (multipotent adult germ stem cells, maGSCs) zeigten zudem die Pluripotenzmerkmale Derivatbildung aller drei Keimblätter in vitro, Teratombildung in immundefizienten Mäusen und Chimärenbildung mit Keimbahnbeteiligung nach Blastozysteninjektion (GUAN et al. 2006; IZADYAR et al.
2008).
Hochproliferative adulte Spermatogonien-Vorläufer-Zellen (spermatogonial progenitor cells, SPCs) werden durch Kultur von Hodenzellen auf mitotisch inaktivierten testikulären Feeder-Zellen gewonnen (SEANDEL et al. 2007).
Diese SPCs (Oct4-) besitzen sowohl die Fähigkeit zur testikulären Repopulation, als auch die Möglichkeit, multipotente adulte spermatogonienabgeleitete Stammzellen (multipotent adult spermatogonial-derived stem cells, MASCs) nach Langzeitkultur hervorzubringen (Oct4+) (SEANDEL et al. 2007). GPR125+-MASCs lassen sich in Derivate aller drei Keimblätter differenzieren und bringen Chimären hervor, was jeweils mit einer Abnahme von GPR125 einhergeht (SEANDEL et al. 2007). Sowohl SPCs als auch MASCs exprimieren den G-Protein gekoppelten Rezeptor GPR125.
Dies ist ein Oberflächenmarker, der in differenzierten Keimzellen nicht mehr zu finden ist (SEANDEL et al. 2007).
Das Potential von Spermatogonien, ESC-ähnliche Populationen in Kultur auszubilden, konnte kürzlich bestätigt werden. Zudem wurde gezeigt, dass in Spermatogonien die vier für die Generierung von iPS-Zellen notwendigen Stammzellfaktoren Oct4, Sox2, c-myc und KLF4 bereits in einem geringen Maße aktiv sind (KANATSU-SHINOHARA et al. 2008). Der Gehalt Oct4+-Typ A Spermatogonien nimmt mit steigendem Alter ab. Der in Oct4-EGFP-Reportermäusen durchflusszytometrisch ermittelte Gehalt Oct4+-Zellen sinkt von knapp 9 % in Neonaten auf 0,05 % in adultem Hodengewebe (OHMURA et al. 2004; SHIMIZU et al. 2006; IZADYAR et al. 2008)
Lange ist man davon ausgegangen, dass in adulten Ovarien keine Keimbahnstammzellen mehr vorhanden sind (KUBOTA u. BRINSTER 2006). Die Zellen in Primordialfollikeln stellen in der Meiose I arretierte Eizellen dar die nur noch reifen, aber keine Teilungsvorgänge mehr durchlaufen. Seit verschiedene Studien über die Existenz von Keimbahnstammzellen in Eierstöcken berichteten (BUKOVSKY et al. 2004; JOHNSON et al. 2004; JOHNSON et al. 2005) wird kontrovers diskutiert (TELFER et al. 2005; KUBOTA u. BRINSTER 2006), ob nicht von einem Verbleib der Keimbahnstammzellen im Ovar ausgegangen werden muss (LACHAM-KAPLAN 2004).
2.1.2.3. Herz
Lange Zeit galt das Herz als terminal differenziertes Organ, das sich nur durch Hypertrophie seiner Kardiomyozyten veränderten Leistungsansprüchen anpassen
könne. Eine Steigerung der Zellzahl oder ein Ersatz zugrunde gegangenen Herzmuskelgewebes durch Hyperplasie sollte nach der Geburt nicht mehr möglich sein (ZAK 1974; SOONPAA u. FIELD 1998; RUBART u. FIELD 2006).
Seit verschiedene Studien über Kardiomyozytenregeneration nach Myokardinfarkt berichteten (BELTRAMI et al. 2001; LINKE et al. 2005; URBANEK et al. 2005), wird lebhaft über die weitere Gültigkeit der Betrachtung des Herzens als postmitotisches Organ diskutiert (ANVERSA et al. 2006). Adulte Stammzellen wurden bereits in den Herzen von Ratten, Mäusen und Hunden nachgewiesen (BELTRAMI et al. 2003; OH et al. 2003; MARTIN et al. 2004; MATSUURA et al. 2004; MESSINA et al. 2004;
LINKE et al. 2005; PFISTER et al. 2005), ihr therapeutischer Nutzen und Mechanismus ist aber noch nicht ausreichend geklärt (DAWN et al. 2005; ANVERSA et al. 2006). Uneinigkeit besteht auch über die wahre Herkunft dieser Zellen - so ist noch nicht bewiesen worden, dass es sich nicht um aus dem Knochenmark in das Herz eingewanderte Zellen handelt (BARBASH u. LEOR 2006).
Auch wenn der therapeutische Einsatz kardialer Stammzellen zur Regeneration des Herzens zunächst naheliegend erscheint, bestehen jedoch Schwierigkeiten hinsichtlich der Gewinnung und Expansion der entsprechenden Gewebeproben in ausreichender Menge (LERI et al. 2005).
2.1.2.4. Haut
Die Epidermis als sich kontinuierlich regenerierendes Epithel und auch der Haarfollikel benötigen Stammzellen, um den ständigen Verlust ihrer zellulären Substanz auszugleichen (BLAU et al. 2001). Keratinozyten-Stammzellen sind eine sich selbsterneuernde Population (LAVKER u. SUN 2000). Sie durchlaufen ihre Teilungszyklen langsam (niedrige Zyklusrate), besitzen jedoch ein sehr hohes proliferatives Potential. Ihre Aufgabe ist es, das Zellgleichgewicht im Gewebe zu erhalten und zerstörte Haut während der Wundheilung zu regenerieren (POTTEN u.
HENDRY 1973; WATT 1998).
Zwei Subpopulationen von Keratinozytenvorläufern können unterschieden werden:
Keratinozytenstammzellen (keratinocyte stem cell, KSC) sind eine kleine, sich
selbsterneuernde Population langsam zyklischer Zellen mit einem hohen proliferativen Potential. TA-Zellen (transit amplifying, TA) besitzen eine limitierte proliferative Kapazität und eine schnelle Teilungsrate, bei der sie nach vier bis fünf Tagen den Kontakt zur Basalmembran verlieren (MORRIS u. POTTEN 1999; TANI et al. 2000).
Dermale Stammzellen sind in der interfollikulären Epidermis und im Haarfollikel lokalisiert, wobei letztere bei Bedarf auch in den interfollikulären Bereich einwandern können (JONES et al. 1995). Die Haarfollikel stellen somit eine wichtige Stammzellnische für die Regeneration verletzter Epidermis dar (COTSARELIS et al.
1990; YANG et al. 1993; TAYLOR et al. 2000). Ob diese beiden Kompartimente der Haut einen gemeinsamen Stammzellpool darstellen oder aus unterschiedlichen Einheiten bestehen ist noch nicht ausreichend geklärt (ROCHAT et al. 1994).
Zunächst war allgemein die Auffassung gültig, dass die Stammzellen zur Erneuerung des Haares im unteren Bereich des Haarfollikels zu finden sind (REYNOLDS u.
JAHODA 1991; HARDY 1992). Die langsam zyklischen KSCs behaarter Maushaut konnten jedoch am oberen Bereich des Haarfollikels lokalisiert werden, nahe der Insertion des Musculus arrector pili und der Talgdrüse im unteren Teil der permanenten Region des Haarfollikels, dicht unter der Hautoberfläche (Ab.1) (COTSARELIS et al. 1990; OSHIMA et al. 2001). Diese Region wurde entsprechend ihrer histologischen Morphologie als „Bulge-Region“ (bulge = Wulst) bezeichnet (COTSARELIS et al. 1990; MORRIS u. POTTEN 1999). Die Bulge-Region gehört der äußeren Wurzelscheide des Haares an, einer Fortsetzung der Epidermis (FUCHS u.
SEGRE 2000; LAVKER u. SUN 2000). Die Zellen dieses Haarbalges zyklieren langsam, zeigen eine höhere proliferative Kapazität als die Epidermis, weisen eine primitive Ultrastruktur auf und sind durch den Haarmuskel in einer physikalisch gut geschützten Region lokalisiert (COTSARELIS et al. 1990; MILLER et al. 1993; YANG et al. 1993).
Das spezifische Marker-Profil der Bulge--Zellen konnte bislang noch nicht sicher definiert werden (MA et al. 2004; COTSARELIS 2006; OHYAMA 2006; KLOEPPER et al. 2008; JIANG et al. 2010). Als mögliche Positivmarker werden von einigen
Autoren Zytokeratin (CK) 15, CK19, CD34, CD200 und als Negativmarker CD71 diskutiert (COTSARELIS et al. 1990; MICHEL et al. 1996; LYLE et al. 1998;
PORTER et al. 2000; LIU et al. 2003; TREMPUS et al. 2003; WEBB et al. 2004;
JIANG et al. 2010). Jedoch weist keines dieser Merkmale die erforderliche Spezifität auf, um als alleiniges Charakteristikum bei Zellseparationen eingesetzt zu werden (COTSARELIS et al. 1990; LYLE et al. 1998; PORTER et al. 2000). Andere experimentelle Einschränkungen bestehen beispielsweise bei dem als relativ „Bulge- Zell-typisch“ geltenden CK15 aufgrund der zytoplasmatischen Lokalisation (JIANG et al. 2010) und der absinkenden Expression bei älteren Tieren (LIU et al. 2003; WEBB et al. 2004). CD34, auch als hämatopoetischer Stammzellmarker bekannt, wird auf Bulge-Zellen der Maus, nicht jedoch beim Menschen nachgewiesen (TREMPUS et al. 2003; COTSARELIS 2006).
Von den Zellen der Bulge-Region werden alle epithelialen Zelltypen des unteren Haarfollikels generiert (MORRIS et al. 2004). Es wurde gezeigt, dass in Mäusen Vorläufer der Bulge-Zellen nach Verwundung in die adulte Epidermis einwandern (TAYLOR et al. 2000). Unter Normalbedingungen (z.B. in nicht-traumatisierter Haut) regeneriert sich die Epidermis aus ihrem eigenen Stammzellpool, ohne die Beteiligung von Haarfollikelstammzellen (ITO et al. 2005; LEVY et al. 2005). Der epidermale Progenitorzellpool befindet sich im Infundibulum, dem oberflächlichen Teil des Haarfollikels (NIJHOF et al. 2006).
Abbildung 1: Lokalisation der Bulge-Region.
Die Basalmembran setzt sich im Bereich der Haarwurzel als äußere Wurzelscheide fort. Die stammzellreiche Bulge-Region ist direkt unterhalb der Talgdrüse in die äußere Wurzelscheide eingebettet. (nach ALONSO u.
FUCHS 2003)
Bulge-Zellen sind gemäß o.g. Definition multipotent - sie sind in der Lage, alle Zellformen des Haarfollikels, der Talgdrüse und der Epidermis auszubilden (BLANPAIN et al. 2004; TUMBAR et al. 2004). Aus der Dermis adulter Mäuse wurden in Kultur multipotente Stammzellen generiert, die sich sogar in Zellen der neuroektodermalen und mesodermalen Linie differenzieren ließen (TOMA et al.
2001; AMOH et al. 2005a; AMOH et al. 2005b). In einer anderen Studie konnten
knochenmarkdepletierte Mäuse mit dermalen Zellkulturderivaten therapiert werden (LAKO et al. 2002). Aus der Haut fetaler Schweine wurden Zellaggregate kultiviert, die neuronale Progenitormarker und den Pluripotenzfaktor Oct4 exprimieren (DYCE et al. 2004). Auch in menschlichen Haarfollikeln konnten Oct4+-Zellen in C_K15 gefärbten Regionen kolokalisiert werden (YU et al. 2006).
Die Gewinnung und Nutzung von dermalen Stammzellen für therapeutische Zwecke wäre durch ihre leichte Zugänglichkeit eine einfache Methode zur Gewinnung von Regeneraten aus patienteneigenem Gewebe (LAKO et al. 2002). Indes wurde bei der Transplantation humaner Haarfollikel in einen Patienten in der Folge ein normales Haarwachstum beobachtet, ohne dass es zu immunologischen Abstoßungsreaktionen gekommen ist (REYNOLDS et al. 1999). Dies lässt vermuten, dass dermale Stammzellen möglicherweise einen besonderen immunologischen Status besitzen, durch den sie besonders geeignet für stammzellbasierte Therapieverfahren sind (LAKO et al. 2002).
2.1.3. Induzierte pluripotente Stammzellen
Induced pluripotent stem cells (iPS-Zellen) stellen derzeit die vielversprechendste Quelle pluripotenten patientenspezifischen Materials für regenerative Therapieverfahren dar (YAMANAKA 2007; GEOGHEGAN u. BYRNES 2008).
IPS-Zellen wurden zuerst durch den retroviralen Transfer vier bestimmter Stammzellfaktoren (Oct4, Sox2, c-myc und KLF4) in Mäuse-Fibroblasten der Haut generiert (TAKAHASHI u. YAMANAKA 2006; OKITA et al. 2007). Diese Modifikation führt zur ektopischen Expression dieser vier Pluripotenzfaktoren und einer nachfolgenden Aktivierung ihrer Zielgene, die sich in somatischen Zellen normalerweise im Ruhezustand befinden (GEOGHEGAN u. BYRNES 2008). Die ersten Pluripotenzfaktoren, die während der Generierung dieser iPS-Zellen exprimiert werden, sind die Alkalische Phosphatase (AP), gefolgt von stage-specific embryonic antigen (SSEA-1). Die Gene für Oct4 und Nanog werden erst in vollständig reprogrammierten Zellen aktiv (BRAMBRINK et al. 2008). Wichtig ist dabei die Modifikation der endogenen Genexpression: Somatische Zellen gelten erst
als reprogrammiert, wenn das endogene Oct4-Gen aktiv ist (GEOGHEGAN u.
BYRNES 2008).
Diese Veränderung der Fibroblasten wird durch genetische Reporter (EGFP, β- Galaktosidase, Neomycinresistenz) unter Kontrolle eines endogenen Pluripotenzmarkers (Fbx15, Oct4, Nanog) angezeigt. Die systematische Kombination dieser Marker und Merkmale erlaubt eine gezielte Selektion jener Zellen, die tatsächlich erfolgreich „umprogrammiert“ wurden (Fbx15-iPS, Oct4-iPS, Nanog-iPS).
Dieses Verfahren wurde nach seiner Etablierung an Mäusefibroblasten (TAKAHASHI u. YAMANAKA 2006) rasch auf Zellen aus humanen Bioptaten übertragen (TAKAHASHI et al. 2007; YU et al. 2007; LOWRY et al. 2008; MALI et al. 2008;
PARK et al. 2008). Mittlerweile wurden bereits murine iPS-Zellen aus adulten Zellen der Leber und des Magenepithels (AOI et al. 2008), pankreatischen β-Zellen (STADTFELD et al. 2008) und unter Verwendung eines weiteren Faktors (C/EBP- alpha) aus reifen B-Lymphozyten (HANNA et al. 2008) generiert.
Hinsichtlich ihrer molekularen Eigenschaften (Expressionslevel verschiedener Gene, epigenetische Marker) zeigte bereits die erste iPS-Zell-Generation (selektiert auf endogene Fbx15-Expression) große Ähnlichkeit mit embryonalen Stammzellen (GEOGHEGAN u. BYRNES 2008). Trotz weitreichender Parallelen ist das Entwicklungspotential dieser Fbx15-iPS-Zellen nicht vollständig mit dem der ESCs gleichzusetzen: In Kultur lassen sich iPS-Zellen zu den für pluripotente Zellen typischen sog. embryoid bodies entwickeln, die differenzierte Zelltypen aller drei Keimblätter enthalten. Vergleichbar mit ESCs entstehen aus iPS-Zell-Transplantaten in Nacktmäusen Teratome. Fbx15-iPS-Zellen bilden nach Blastozysteninjektion Embryonen, die jedoch nach dreizehn Tagen absterben (TAKAHASHI u.
YAMANAKA 2006). Durch Modifikationen und Veränderungen der Selektionsmarker (Oct4- und Nanog-iPS) ist es in der Folge jedoch gelungen, die Qualität der iPS- Zellen immer weiter zu verbessern, so dass kaum noch Unterschiede zu embryonalen Stammzellen bestehen (MAHERALI et al. 2007; OKITA et al. 2007;
WERNIG et al. 2007). Diese verbesserten iPS-Zellen können nach Blastozysteninjektion sogar Embryonen hervorbringen, deren Zellen inklusive der Plazenta vollständig aus iPS-Zellen hervorgegangen sind (WERNIG et al. 2007).
Solche iPS-Zellen werden als vollständig reprogrammiert bezeichnet (GEOGHEGAN u. BYRNES 2008).
Vollständig reprogrammierte iPS-Zellen besitzen wie ESCs pluripotente Entwicklungsmöglichkeiten, werden aber nicht aus Embryonen, sondern unter Verwendung adulter somatischer Zellen erstellt (TAKAHASHI et al. 2007). Dies erspart bei der Arbeit mit iPS-Zellen die Konflikte und Einschränkungen, die im Zusammenhang mit dem Gebrauch humaner Embryonen unumgänglich sind und als kaum lösbar erscheinen (WERNIG et al. 2007; YAMANAKA 2007). Ein weiterer großer Vorteil der iPS-Zellen gegenüber den embryonalen Stammzellen ist die Tatsache, dass sie aus Gewebeproben des adulten Patienten generiert werden. Da hierbei Spender- und Empfängerorganismus identisch sind, sind keine immunologischen Abstoßungsreaktionen auf die Transplantate zu erwarten (WERNIG et al. 2007).
Dessen ungeachtet ist die Erprobung von iPS-Zellen in klinischen Studien aus verschiedenen Gründen noch nicht absehbar:
Die vier Stammzellfaktoren werden nach der bisher bekannten Methode über ein Retrovirus in die zu reprogrammierenden Zellen eingebracht. Dieses Verfahren ist für Patienten nicht ohne Risiko. Zwar handelt es sich hierbei um die bislang effektivste bekannte Methode zur Integration neuer genetischer Informationen, die zufällige Lokalisation dieser Insertion birgt jedoch das Risiko unkontrollierter Mutationen, Aktivierung von Proto-Onkogenen und Krebsentstehung (NIENHUIS et al. 2006;
GEOGHEGAN u. BYRNES 2008).
Bei c-myc als einen der erforderlichen Reprogrammierungsfaktoren handelt es sich um ein Proto-Onkogen. Das in Verbindung mit der Zelltransplantation stehende hohe Risiko maligner Neoplasien ist für Patienten nicht tragbar (OKITA et al. 2007). Auch KLF4 ist mit seiner Funktion als Tumorsuppressor und Onkogen zugleich in diesem Zusammenhang umstritten (ROWLAND et al. 2005). Bei der Generierung von iPS- Zellen wird eine gegenseitige Wechselwirkung proliferativer und antiproliferativer Effekte von c-myc und KLF4 mit folgender Immortalisierung der Zellen vermutet (ROWLAND et al. 2005; GEOGHEGAN u. BYRNES 2008). So würden durch die
alleinige Verwendung von KLF4 und c-myc Tumorzellen statt iPS-Zellen generiert (GEOGHEGAN u. BYRNES 2008). Generell sind ESCs und iPS-Zellen phänotypisch malignen Tumorzellen ähnlich: sie sind potentiell unsterblich und hochproliferativ (YAMANAKA 2007). In aktuellen Arbeiten ist es kürzlich gelungen, Nanog-iPS-Zellen mit ESC-Charakter ohne das c-myc-Transgen aus embryonalen Mausfibroblasten zu produzieren. Dies erfolgte allerdings mit einer deutlich reduzierten Reprogrammierungsrate (NAKAGAWA et al. 2008; WERNIG et al. 2008). Tatsächlich haben die chimären iPS-Zell-Mäuse ohne den c-myc-Faktor hundert Tage nach der Geburt keine Tumoren ausgebildet. IPS-Zell-Chimären, die mit allen vier Faktoren produziert wurden, entwickelten in diesem Zeitraum hingegen regelmäßig Neoplasien (NAKAGAWA et al. 2008). In einer anderen Untersuchung ist es gelungen, iPS-Zellen aus adulten neuralen Stammzellen (NSC) lediglich mit dem Stammzellfaktor Oct4 zu reprogrammieren (KIM et al. 2009). Die Reprogrammierungseffizienz ist allerdings auch mit dieser Modifikation etwa zehnmal niedriger als bei dem ursprünglich etablierten Verfahren mit allen vier Faktoren.
Außerdem exprimieren die adulten NSCs ohnehin Sox2, c-myc, KLF4, AP und SSEA-1, so dass eine Übertragbarkeit dieses Protokolls auf andere Zellpopulation fraglich ist (SHI et al. 2008a).
Zurzeit werden genetische Reporter für die Selektion und Aufreinigung erfolgreich reprogrammierter iPS-Zellen eingesetzt. Dieses Verfahren kann so nicht auf menschliche Patienten übertragen werden. Ein vielversprechender Schritt Richtung klinischer Anwendbarkeit ist daher eine Studie, in der die Reprogrammierung und Selektion somatischer Zellen lediglich nach morphologischen Kriterien ohne genetische Markierung gelungen ist (MEISSNER et al. 2007).
Eine weitere Problematik bezüglich des Transfers der iPS-Zell-Technologie in die Klinik besteht in der extrem niedrigen Reprogrammierungseffizienz. Derzeit werden weniger als 1 % der Zellen pluripotent (TAKAHASHI u. YAMANAKA 2006; OKITA et al. 2007). Erklärungsmodelle für diese geringe Reprogrammierungsrate sind noch nicht bestätigt worden. Möglicherweise stellen Fibroblasten gar nicht die Ursprungszellen für die iPS-Zellen dar, sondern eine kleine Gewebsstammzellpopulation, die in diesen Kulturen koexistiert (OKITA et al. 2007).
Eine andere Theorie vermutet ganz spezifische Expressionsstärken der jeweiligen Faktoren, die dann tatsächlich die Pluripotenz induzieren können und somit mit den bekannten Protokollen eher zufällig und somit selten auftreten. Es wird auch daran gearbeitet, weitere Faktoren zu finden, die die Reprogrammierungseffizienz steigern könnten (OKITA et al. 2007).
Verschiedene Ansätze werden verfolgt, um das vielversprechende Potential der iPS- Zellen für therapeutische Belange nutzen zu können. Hauptziele sind dabei der Verzicht auf onkogene Faktoren, die Reduktion der erforderlichen Faktoren und Alternativen zum retroviralen Gentransfer. Eine Modifikation der Faktorenkombination zur Reprogrammierung somatischer Zellen kann durch die Verwendung von Zellen erreicht werden, in denen ohnehin einige der erforderlichen Transkriptionsfaktoren aktiv sind (KIM et al. 2009).
Die Aktivität von Transkriptionsfaktoren hängt maßgeblich von der Zugänglichkeit ihrer Zielgene ab. In Abhängigkeit von Modifikationen der DNA, der Histone oder der Chromatinstruktur sind diese besser oder schlechter erreichbar (JAENISCH u. BIRD 2003). Eine weitere Perspektive zur Reduktion der erforderlichen Reprogrammierungsfaktoren bietet die Anwendung kleiner chemischer Moleküle (SHI et al. 2008a; SHI et al. 2008b; TADA 2008). Es hat sich gezeigt, dass die Kombination von BIX und BayK eine effiziente Reprogrammierung von MEF-Zellen (mouse embryonic fibroblast, MEF) mit nur noch zwei Faktoren, KLF4 und Oct4, ermöglicht. BIX (BIX-01294) wirkt als Inhibitor der G9a-Histon-Methyltransferase (G9aHMTase) (KUBICEK et al. 2007). Die G9aHMTase methyliert Histone mit nachfolgender Heterochromatinbildung. Dies führt zu einer epigenetischen Blockade des Oct4-Gens (FELDMAN et al. 2006). Hemmt BIX dieses Enzym, wird das Oct4- Gen auf epigenetischer Ebene freigelegt (SHI et al. 2008a). BayK (Bayk8644) ist ein Calciumkanal-Agonist (SCHRAMM et al. 1983), der bei der Induktion der Stammzellen eine Rolle als fördernder Kofaktor zu spielen scheint (SHI et al. 2008a).
In einer anderen Untersuchung hatte Valproat als Histon-Deacetylase-Inhibitor eine stark effizienzsteigernde Wirkung (HUANGFU et al. 2008).
2.1.4. Pluripotenzfaktoren
Sox2, c-myc, KLF4 und Oct4 bewirken gemeinsam die Reprogrammierung adulter Fibroblasten zu iPS-Zellen (TAKAHASHI et al. 2007). Diese vier Faktoren interagieren dabei miteinander und lösen bestimmte Veränderungen in den somatischen Zellen aus. Oct4 kommt dabei eine zentrale Schlüsselrolle als Induktor und Indikator für Pluripotenz zu. Zum einen ist Oct4 einer der vier essentiellen Faktoren, deren Einschleusung die „Dedifferenzierung“ adulter somatischer Zellen zu einem embryonalen Phänotyp hervorruft. Zum anderen wird im Zuge dieser Reprogrammierung das endogene Oct4-Gen aktiviert – ein Vorgang der für die Stabilität der Pluripotenz von iPS-Kulturen von großer Bedeutung ist (WERNIG et al.
2007). Eine Studie über die Reprogrammierung adulter NSCs allein mit dem Stammzellfaktor Oct4, unterstreicht zusätzlich dessen Bedeutung und Unverzichtbarkeit für den pluripotenten Status von Stammzellen (KIM et al. 2009).
2.1.4.1. Oct4
Die embryonale Entwicklung wird durch regulatorische Gene kontrolliert, deren Genprodukte als Transkriptionsfaktoren z.T. selbst wiederum die Aktivität anderer DNA-Abschnitte regulieren (SCHÖLER et al. 1990b; SCHÖLER 1991). Oct4 gilt seit seiner Entdeckung 1990 als entscheidender Wegweiser zwischen Pluripotenz und Differenzierung von Stammzellen (PESCE u. SCHÖLER 2000, 2001). Die regulierte Transkription des Oct4-Gens findet in einer sehr frühen Phase der murinen Embryonalentwicklung statt (SCHÖLER et al. 1989a; OKAMOTO et al. 1990;
ROSNER et al. 1990), in der nach dem Stand der Wissenschaft noch kein anderer Transkriptionsfaktor aktiv ist (SCHÖLER et al. 1990a; BREHM et al. 1997). Aus dem zeitlichen und räumlichen Expressionsmuster lässt sich schließen, dass Oct4 entscheidend an der Aufrechterhaltung des undifferenzierten pluripotenten Status von Zellen beteiligt ist (SHIMAZAKI et al. 1993; TAM u. BEHRINGER 1997; PESCE et al. 1998a; NIWA et al. 2000).
Abbildung 2: Oct4-Expression während der frühen Embryonal- entwicklung und in ESC-Kulturen.
Bis zum Morula-Stadium exprimieren alle embryonalen Zellen einheitlich Oct4 (rot). Synchron zur Formation der inneren Zellmasse und des Trophoblasten beschränkt sich die Oct4-Expression auf die innere Zellmasse. Die aus der inneren Zellmasse gewonnenen ESCs sind bis zum Eintritt von Differenzierungsvorgängen ebenso Oct4+. (nach PAN et al. 2002)
Lange Zeit wurde postuliert, dass Oct4 ausschließlich in ESCs und Keimzellen exprimiert wird (SCHÖLER et al. 1990a; NICHOLS et al. 1998; PESCE u. SCHÖLER 2000; NIWA 2001). Eine Oct4-Expression durch adulte differenzierte Zellen wurde ausgeschlossen (MITSUI et al. 2003; TAI et al. 2005). Die in präimplantatorischen Embryonen bis zum 8-Zell-Stadium enthaltenen Oct4-Moleküle entstammen der mütterlichen Eizelle (YEOM et al. 1991; PALMIERI et al. 1994; PESCE et al. 1998b).
Der Oct4-mRNA-Gehalt der reifen Eizelle sinkt nach der Befruchtung ab, da der Embryo erst ab dem 8-Zellstadium der Morula mit der eigenen Oct4-Synthese beginnt (SCHÖLER et al. 1990a; PALMIERI et al. 1994). Danach ist Oct4 zunächst in allen Zellen des frühen Embryos vorhanden. Ab dem Blastozystenstadium
beschränkt sich die Oct4-Expression auf die innere Zellmasse (Ab. 2). Im Trophoblasten hingegen ist der Transkriptionsfaktor nicht aktiv. Nach dem achten Tag p.c. findet sich Oct4 nur noch in den primordialen Keimzellen (ROSNER et al.
1990; SCHÖLER et al. 1990a; YEOM et al. 1996).
Mit Erlangen der körperlichen Reife beobachten einige Autoren Oct4-Expression ausschließlich in Keimzellen (PESCE u. SCHÖLER 2000, 2001). In weiblichen Gameten fällt die Oct4-Konzentration zwischen dem Eintritt in die Meiose an Tag 14,5 p.c. bis zum zweiten Tag nach der Geburt ab. Während der späteren Eizellreifung kommt es wieder zu einem Anstieg (PESCE et al. 1998b). In männlichen Keimzellen sistiert die Oct4-Expression ebenso mit dem Eintritt in die Meiose, setzt jedoch anders als in Eizellen zu einem späteren Zeitpunkt nicht wieder ein, so dass im Hoden A-Spermatogonien die einzigen Oct4+-Zellen darstellen (PESCE et al. 1998b).
In vitro wird Oct4 von embryonalen Karzinomzellen (embryonal carcinoma cell, EC), ESCs, embryonalen Keimzellen (embryonic germ cell, EG) und iPS-Zellen exprimiert (OKAMOTO et al. 1990; ROSNER et al. 1990; YEOM et al. 1996; YAMANAKA 2007).
Allen bisher bekannten Oct4+-Zellen ist gemeinsam, dass sie die Fähigkeit zur Differenzierung in verschiedene Linien besitzen (ROSNER et al. 1990). Mit steigendem Differenzierungsgrad sinkt in vivo und in vitro der Oct4-Gehalt (ROSNER et al. 1990; PESCE u. SCHOLER 2000), bzw. ist eine Unterdrückung der Oct4- Expression Voraussetzung für Linienspezifizierung und Differenzierung pluripotenter Stammzellen (YEOM et al. 1996). Oct4 gilt als unverzichtbar für den pluripotenten Status von Zellen (OVITT u. SCHÖLER 1998; NIWA et al. 2000).
Die essentielle Funktion von Oct4 in der Embryonalentwicklung und auch dessen Bedeutung für den pluripotenten Zellstatus hat die experimentelle Blockade des Oct4-Gens in Mäusen aufgezeigt: In Oct4-defizienten Embryonen entstehen keine pluripotenten Zellen in der inneren Zellmasse (NICHOLS et al. 1998). Dabei beruhen die zellulären Effekte des Transkriptionsfaktors nicht auf einem einfachen An-Aus- Mechanismus. Eine Bewahrung des pluripotenten Status ist nur bei einer bestimmten
Stärke der Oct4-Expression gegeben. Eine zweifache Erhöhung der Oct4- Expressionsaktivität veranlasst die Zellen zu einer Entwicklung in extraembryonales Mesoderm oder Endoderm, niedrige Expressionsraten (ca. 50 %) führen hingegen zur Formation des Trophoektoderms (Ab. 3) (NIWA et al. 2000; NIWA 2001).
Abbildung 3: Beziehung zwischen der Stärke der Oct4-Expression und den Stammzelleigenschaften der Zellen.
Die Oct4-Expressionsstärke darf zur Beibehaltung des pluripotenten Status nicht um mehr als 50 % von der normalen diploiden Intensität abweichen.
Oberhalb dieser Marke beginnt eine Entwicklung in Endoderm und Mesoderm, niedrigere Expressionsraten leiten die Zellen Richtung Trophoektoderm. (nach NIWA et al. 2000)
Studien an humanen und murinen Blastozysten zeigen, dass sich die beiden Spezies bezüglich des relativen Oct4-Expressionsniveaus in innerer Zellmasse und Trophoektoderm stark ähneln (HANSIS et al. 2000; HANSIS et al. 2001). Ebenso weisen die Oct4-codierenden Gene von Mensch und Maus eine große Homologie
hinsichtlich der Proteinsequenz (87 %) (TAKEDA et al. 1992; VAN EIJK et al. 1999), der genomischen Organisation (fünf Exons) (OKAZAWA et al. 1991) und chromosomalen Lokalisation (in der Nähe des MHC-Komplexes) auf (SCHÖLER et al. 1990a; TAKEDA et al. 1992; PESCE et al. 1998a). Auch das Expressionsmuster des Oct4-Gens von Mensch und Maus ähnelt sich in Keimzellen und im frühen Embryo (PESCE u. SCHÖLER 2000).
Abbildung 4: Totipotenter Zyklus.
Alle im Zyklus befindlichen Zelltypen exprimieren Oct4 und sind über die Generationen hinweg an der Arterhaltung und Entwicklung neuer Lebewesen mit all ihren verschiedenen Zelltypen beteiligt. (YEOM et al. 1996)
Eine modellhafte Verdeutlichung der Rolle von Oct4 für die Pluripotenz ist der totipotente Zyklus (Ab. 4) (YEOM et al. 1996). Er stellt dar, wie totipotente Zellen während der Entwicklung im Organismus persistieren und über Generationen hinweg im Verlauf der Keimbahn weitergegeben werden. Alle Glieder in diesem Zyklus exprimieren Oct4 und tragen potentiell zu der Ausbildung neuer Organismen bei.
Sistiert die Oct4-Expression einer Zelle, verlässt diese den Zyklus und differenziert sich in eine somatische Zelle (PESCE et al. 1999). Daraus wird abgeleitet, dass aus der vorhandenen Oct4-Expression einer Zelle auf ihr uneingeschränktes Entwicklungspotential rückgeschlossen werden kann.
Oct4 (Syn. Oct-3, Oct4, Pou5f1) gehört zu der Familie der POU- Transkriptionsfaktoren (benannt nach den Säugetier-Transkriptionsfaktoren Pit-1, Oct-1, Oct-2 und dem Nematoden-Protein Unc-86) (HERR et al. 1988; SCHÖLER et al. 1990b; SCHÖLER 1991; RYAN u. ROSENFELD 1997). Diese Moleküle beeinflussen die Zielgenexpression durch Bindung der oktameren DNA-Sequenz (ATGCAAAT) in dessen regulatorischen Promotorregion (SCHÖLER et al. 1989b;
SCHÖLER et al. 1990a; SCHÖLER 1991; PESCE u. SCHÖLER 2001). Allen Transkriptionsfaktoren der POU-Familie ist die aus zwei Untereinheiten bestehende POU-Domäne zur DNA-Bindung gemeinsam (Ab. 5) (BODNER et al. 1988; HERR et al. 1988; PESCE et al. 1998b): Sie beinhaltet die aminoterminale POU-spezifische Region (POUs) und die carboxyterminale POU-Homeo-Domäne (POUh) (SCHÖLER 1991). Die beiden Bestandteile sind durch eine bewegliche Aminosäurenkette unterschiedlicher Länge miteinander verbunden und können dadurch unabhängig voneinander über eine Helix-Turn-Helix-Struktur mit der Ziel-DNA in Kontakt treten (KLEMM et al. 1994; HERR u. CLEARY 1995). Sieben Unterfamilien können aufgrund von Homologien in der POU-Domäne und der verbindenden Aminosäurenkette unterschieden werden. Oct4 wird Unterfamilie V zugeordnet (HERR u. CLEARY 1995; RYAN u. ROSENFELD 1997).
Abbildung 5: Aufbau des Oct4-Moleküls. (PAN et al. 2002)
Das Oct4-Protein umfasst 352 Aminosäuren (OKAMOTO et al. 1990; ROSNER et al.
1990; SCHÖLER et al. 1990b). Innerhalb des Oct4-Moleküls unterscheiden sich die
aminoterminale (N-Domäne) und die carboxyterminale (C-Domäne) Region hinsichtlich ihrer Zellspezifität und Aktivität, was die große funktionelle Diversität der Oct4-Wirkung erklären könnte (BREHM et al. 1997; PAN et al. 2002). Oct4 ist mit 623 aktivierenden und inhibierenden Promotorregionen in ESCs assoziiert.
Aktivierende Effekte könnten dabei auf pluripotenzfördernde Gene wirken, hemmende hingegen auf differenzierungseinleitende Strukturen (BOYER et al.
2005).
Oct4 kann auf unterschiedliche Weise auf das Zielgen wirken: Indirekt über Neutralisierung des eigentlichen Aktivators, direkt durch Synergismus mit anderen Transkriptionsfaktoren und durch Bindung an Promotoren, d.h. durch die Anlagerung an die oktameren Sequenzen proximal oder distal der codierenden Abschnitte (PESCE et al. 1999; PAN et al. 2002). Das FGF-4-Gen (Fibroblast growth factor 4) wird durch einen solchen Synergismus von Oct4 und Sox2 (Sry-related Sox factors family) aktiviert (YUAN et al. 1995; AMBROSETTI et al. 1997). Auch der Zink-Finger- Transkriptionsfaktor Rex-1 gehört zu den Zielgenen, deren Aktivierung eines zusätzlichen Faktors bedarf, in diesem Falle Rox-1 (HOSLER et al. 1993; BEN- SHUSHAN et al. 1998). Am Osteopontin-Gen aktiviert Oct4 als Dimer die Transkription, Sox2 unterdrückt hier die Osteopontin-Synthese durch Verhinderung der Dimerbildung (BOTQUIN et al. 1998). Fbx15 und Nanog sind weitere Zielgene von Oct4 und Sox2 (TOKUZAWA et al. 2003; KURODA et al. 2005; RODDA et al.
2005)
Die zelltypspezifische Expression des Oct4-Gens wird in vivo und in vitro durch den proximalen (PE) und den distalen (DE) Enhancer reguliert. Diese beiden regulatorischen Elemente werden von einer Vielzahl verstärkender und hemmender Faktoren beeinflusst, um das jeweils erforderliche Oct4-Expressionslevel einzustellen (NIWA 2007). Der distale Enhancer ist essentiell für die Oct4-Gen-Aktivierung in ESCs, der Morula, Zellen der inneren Zellmasse und primordialen Keimzellen. In embryonalen Karzinomzellen und dem Epiblasten ist hingegen der proximale Enhancer aktiv (OKAZAWA et al. 1991; YEOM et al. 1996). YEOM et al. schließen aus ihren Untersuchungen, dass der PE phasen- und gewebespezifisch, der DE hingegen linienspezifisch ist (YEOM et al. 1996). Welche Faktoren wiederum die
Oct4-Expression im frühen Embryo regulieren, ist noch nicht vollständig aufgeklärt.
Einige Untersuchungen weisen auf einen Mechanismus hin, bei dem die Oct4- Expression durch die Lage und Position der embryonalen Zellen beeinflusst wird (PESCE et al. 1999).
2.1.4.2. Sox2
Sox2 ist ein wichtiger Transkriptionsfaktor für die Aufrechterhaltung des pluripotenten Status von Zellen. Gemeinsam mit dem Oct4-Protein reguliert Sox2 als Heterodimer einige für pluripotente Zellen typische Gene (Nanog, Sox2, Oct4, Fbx15) (GEOGHEGAN u. BYRNES 2008). Auf eine Veränderung der Sox2- Expressionstärke folgt in ESCs deren Differenzierung (IVANOVA et al. 2006; KOPP et al. 2008). Interessanterweise kann der Transkriptionsfaktor Oct4 die Deletion von Sox2 kompensieren. Die Hauptwirkung von Sox2 besteht somit wahrscheinlich in einer Aktivierung des Oct4-Gens (MASUI et al. 2007).
2.1.4.3. c-myc
C-myc ist ein Transkriptionsfaktor mit vielfältigen Funktionen in Zellwachstum, - differenzierung und -proliferation (GEOGHEGAN u. BYRNES 2008). So existieren mehr als 25.000 c-myc-Bindungsstellen im Genom (KNOEPFLER et al. 2006). C-myc beschleunigt z.B. den Zellzyklus durch Überführung der Zellen von der G1- in die S- Phase der Mitose (HOOKER u. HURLIN 2006) und ist Teil verschiedener Signalketten zur Aufrechterhaltung der Pluripotenz (GEOGHEGAN u. BYRNES 2008). Dabei scheint c-myc ein Gegengewicht zur antiproliferativen Wirkung von KLF4 darzustellen (YAMANAKA 2007). Zugleich handelt es sich bei c-myc um ein Proto-Onkogen und ist an der Entstehung zahlreicher menschlicher maligner Tumorerkrankungen beteiligt. Pluripotente Stammzellen haben üblicherweise offenes Chromatin (MESHORER et al. 2006). Besonders wichtig erscheint daher die Auflockerung der Chromatinstruktur durch c-myc, damit Oct4 und Sox2 ihre Zielgene für die erfolgreiche Umprogrammierung zu iPS-Zellen erreichen können (GEOGHEGAN u. BYRNES 2008).
2.1.4.4. KLF4
Der Transkriptionsfaktor KLF4 inhibiert Differenzierungsprozesse embryonaler Stammzelllinien (LI et al. 2005) und kooperiert dabei mit Oct4 und Sox2 (NAKATAKE et al. 2006). KLF4 ist interessanterweise sowohl als Tumorsuppressor, als auch als Onkogen bekannt (ROWLAND et al. 2005). Entgegen der ursprünglichen Rollenzuweisung, scheint KLF4 für die Aufrechterhaltung der Pluripotenz von murinen ESCs verzichtbar zu sein. Seine Rolle wird jetzt vielmehr in der Selbsterneuerung dieser Zellen gesehen (JIANG et al. 2008). Bei der Generierung von iPS-Zellen wird eine gegenseitige Wechselwirkung zum Ausgleich proliferativer und antiproliferativer Effekte von c-myc und KLF4 vermutet, die die Immortalisierung der Zellen hervorruft (ROWLAND et al. 2005; GEOGHEGAN u. BYRNES 2008). So würden durch die Verwendung von KLF4 und c-myc alleine Tumorzellen und nicht iPS-Zellen generiert (GEOGHEGAN u. BYRNES 2008).
3. Geräte, Material und Methoden 3.1. Geräte
Auflichtmikroskop Stemi DV4 Spot Fa. Carl Zeiss, Jena Durchflusszytometer FACScalibur Fa. BD Bioscience, USA
Elektrophoresekammern Fa. Bio-Rad, USA
FACS-Sorter FACSaria Fa. BD Bioscience, USA
Kryotom CM 1900 Fa. Leica, Wetzlar
Mikroskop Observer Z1 Fa. Carl Zeiss, Jena
Reinstwasseranlage Milli-Q Synthesis A10 Fa. Millipore, USA Spectrophotometer ND-1000 Fa. Nanodrop, USA 3.2. Material
3.2.1. Laborbedarf
Augensalbe Bepanthen Augen- und Nasensalbe Fa. Bayer, Leverkusen
Biopsiestanze Fa. Stiefel, Offenbach
chirurgischer Faden
Ethibond Excel, Polyester, grün geflochten, 5-0
Perma-Hand-Seide, schwarz geflochten, 6-0 Fa. Ethicon, Norderstedt chirurgisches Besteck
Irisschere, fein, gebogen, 8,5 cm Pinzette, grob, gebogen, 9,5 cm
Castroviejo Nadelhalter, fein, gerade Fa. Martin, Tuttlingen Vannas Federschere, gerade, 8 cm
Crile-Wood Nadelhalter, 15 cm
Pinzette, fein, gewinkelt 0,4 mm Fa. FST, Kanada Einbettmedium Tissue Tek OCT-Compound Fa. Dako, USA Eindeckmittel Fluorescence Mounting Medium Fa. Dako, USA
Eindeckmittel Kaiser´s Glycerol Gelatine Fa. Merck, Darmstadt FACS-Röhrchen BD FACS Tubes Falcon Fa. BD Biosciences, USA
Holzgranulat BK 8/15 Fa. Rettenmaier, Rosenberg
IVC-Käfige T22 IVC-System Fa. BioZone, UK
Jodlösung Braunoderm Fa. Braun, Melsungen
Korkplatten Fa. KMF, St. Augustin
Objektträger Superfrost Plus Fa. Menzel, Braunschweig Tierfutter Altromin 1314 FORTI Zuchtfutter Fa. Altromin, Lage
Zellsiebe BD Falcon Cell Strainer, 70 µm Fa. BD Biosciences, USA 3.2.2. Reagenzien, Chemikalien
2-Mercaptoethanol (31350-010) Fa. Gibco Invitrogen, UK
2-Methylbutan Fa. Carl Roth, Karlsruhe
Aceton Fa. JT Baker, Griesheim
Acrylamid rotiophorese Gel 30 Fa. Carl Roth, Karlsruhe
Ammoniumperoxodisulfat Fa. Merck, Darmstadt
Ammoniumchlorid (A0171) Fa. Sigma, Deisenhofen
Bromphenolblau Fa. Serva Electroph., Heidelberg
BSA Albumin Fraktion V (8976,2) Fa. Carl Roth, Karlsruhe
DAPI (6335.1) Fa. Carl Roth, Karlsruhe
Dimethylformamid (D4551) Fa. Sigma, Deisenhofen Dispase neutrale Protease (LS02104) Fa. Worthington, USA
DMEM (FG0445) Fa. Biochrom, Berlin
DNAseI (DN25-1g) Fa. Sigma, Deisenhofen
dPBS w/o Ca, Mg (BE15-512D) Fa. Lonza, Schweiz
DTT Fa. Merck, Darmstadt
EDTA Dinatriumsalz Dihydrat (8043.2) Fa. Carl Roth, Karlsruhe
Eosin G Lösung (115935) Fa. Merck, Darmstadt
Ethanol Chemikalienzentrum MHH
FACS Clean Solution Fa. BD Biosciences, USA
FACS Rinse Solution Fa. BD Biosciences, USA
FACS Trägerflüssigkeit FACS Flow Fa. BD Biosciences, USA Fc-Block-Reagenz FCR block (553142) Fa. BD Biosciences, USA
FCS (S0115) Fa. Biochrom, Berlin
Glutaraldehyd solution Grade 1 (G588210) Fa. Sigma, Deisenhofen
Glycerin Fa. Carl Roth, Karlsruhe
Hämalaun Fa. Merck, Darmstadt
HBSS w/o Ca, Mg, with Phenol Red (10-543F) Fa. Lonza, Schweiz
Histopaque 1083 Fa. Sigma, Deisenhofen
IMDM (E15-819) Fa. PAA, Österreich
Kalium Ferricyanid (244023) Fa. Sigma, Deisenhofen Kalium Hexacyano-ferrate(II) trihydrate (P9387) Fa. Sigma, Deisenhofen Kaliumhydrogencarbonat (P9144) Fa. Sigma, Deisenhofen
Ketamin (Ketanest) Fa. Pfizer, Berlin
Kollagenase I (LS004196) Fa. Worthington, USA Kollagenase II (C7657-25) Fa. Sigma, Deisenhofen
Levamisol-HCl (L9756) Fa. Sigma, Deisenhofen
MACS Mouse Lineage Cell Depletion Kit mouse Fa. Miltenyi Biotec, USA
Magermilchpulver Fa. Uelzena, Uelzen
Magnesiumchloridlösung (A5076) Fa. AppliChem, Darmstadt
Methanol Fa. Carl Roth, Karlsruhe
Naphthol-AS-Bl-phosphat (N2250) Fa. Sigma, Deisenhofen Natriumhydroxid (1064981000) Fa. Merck, Darmstadt Natriumnitrit (1.065.490.500) Fa. Merck, Darmstadt
Neufuchsin (72200) Fa. Sigma, Deisenhofen
PBS w/ Ca, Mg (BE17-513F) Fa. Lonza, Schweiz
PFA (P6148) Fa. Sigma, Deisenhofen
Propandiol (8.014.640.250) Fa. Merck, Darmstadt Propidium Iodid BD PI staining solution (556463) Fa. BD Biosciences, USA Rimadyl Injektionslösung Fa. Intervet, Unterschleissheim RNA/ Protein-Kit NucleoSpin RNA/ Protein Fa. Macherey-Nagel, Düren RNA-Isolations-Kit NucleoSpin RNA XS Fa. Macherey-Nagel, Düren
Salzsäure 2N (1090631) Fa. Merck, Darmstadt
SDS Fa. Carl Roth, Karlsruhe
Stickstoff Fa. Linde, Wiesbaden
Streptavidin/ AP (D039601) Fa. Dako, USA
Sucrose (4621.1) Fa. Carl Roth, Karlsruhe
SuperSignal ELISA Femto Sensitivity Substrate Fa. Thermo Fisher Scient., USA
TrisHCl (9090.3) Fa. Carl Roth, Karlsruhe
TritonX-100 (T8787) Fa. Sigma, Deisenhofen
Trypsin (LS003667) Fa. Worthington, USA
Tween20 Fa. Carl Roth, Karlsruhe
TEMED Fa. Carl Roth, Karlsruhe
X-Gal (37-2610) Fa. Peqlab, Erlangen
Xylazin (Rompun 2 %) Fa. Bayer, Leverkusen
Ziegenserum (G9023) Fa. Sigma, Deisenhofen
3.2.3. Antikörper
Cy3-Goat anti Rabbit Antibody (111165144) Fa. Dianova, Hamburg Goat anti-rabbit immunoglobulin/ biotinylated Fa. Dako, USA
Goat anti-rabbit HRP Fa. Dako, USA
Isotype control mouse IgG1 APC Fa. BD Biosciences, USA Isotype control rat IgG2a, IgG2b APC Fa. BD Biosciences, USA mouse anti-ß1-integrin/ CD29-APC-Antibody Fa. Immunotools, Friesoythe mouse anti-SSEA-1-APC-Antibody (FAB2155A) Fa. R&D Systems, USA Oct-4 rabbit polyclonal Antibody (sc-9081) Fa. Santa Cruz, USA
rabbit anti-GFP-Antibody (SP3005P) Fa. Acris Antibodies, Herford rat anti-α6-Integrin/CD49f-APC Antibody Fa. R&D Systems, USA rat anti-CD11b-APC-Antibody (130091241) Fa. Miltenyi Biotec, USA rat anti-CD31-APC-Antibody (551262) Fa. BD Biosciences, USA rat anti-c-kit/ CD117-APC-Antibdy (130091729) Fa. Miltenyi Biotec, USA rat anti-cxcr4-APC-Antibody (FAB21651A) Fa. R&D Systems, USA rat anti-sca-1-APC-Antibody (130093223) Fa. Miltenyi Biotec, USA
3.2.4. Primer 3.2.4.1. RT-PCR muriner Oct4-Primer
Oct4 murine sense gcgttctctttggaaaggt Oct4 murine RAS agcctcatactcttctcgttgg
Die RT-PCR wurde durch Mitarbeiter der Arbeitsgruppe von Prof. Ulrich Martin, Leibniz-Forschungslaboratorien für Biotechnologie und künstliche Organe (LEBAO) der Medizinischen Hochschule Hannover, durchgeführt.
3.2.4.2. q-RT-PCR muriner Oct4-Primer
Left: gttggagaaggtggaaccaa
Right: ctccttctgcagggctttc murines c-myc
Left: cgcctagaattggcagaaat
Right: aactgagaagaatcctattcagcac murines KLF4
Left: cgggaagggagaagacact
Right: gagttcctcacgccaacg
murines Sox2
Left: tgctgcctctttaagactaggg
Right: tcgggctccaaacttctct
Die Probenanalyse erfolgte mit Light Cycler 480 Software der Fa. Roche in den Labors der Arbeitsgruppe Dr. Robert Geffers im Helmholtzzentrum für Infektionsforschung in Braunschweig.
3.2.5. Lösungen und Puffer
3.2.5.1. Lösungen und Puffer für die Durchflusszytometrie Verdaulösung a
DMEM 100 ml
DNAseI 360 U/ml
KollagenaseII 0,25 % (w/v) Verdaulösung b
PBS (w/ Ca++, Mg++) 8 ml dPBS (w/o Ca++, Mg++) 12 ml HCl (0,001 N) 200 µl
Dispase 1,2 U/ml
KollagenaseI 250 U/ml
Trypsin 150 U/ml
DNAseI 360 U/ml
Verdaulösung c
HBSS 5 ml
DNAseI 360 U/ml
KollagenaseII 560 U/ml Lysepuffer
Ammoniumchlorid 8,29 g Kaliumhydrogenkarbonat 1 g
EDTA 0,037 g
dH2O 1 l
FACS-Puffer
Na-EDTA 2 mM
FCS 5 %
dPBS (w/o Ca++, Mg++) 1 l
3.2.5.2. Lösungen und Puffer für die Histologie Fixierungslösung a
PBS (w/ Ca++, Mg++) 16,25 ml
PFA (8 %) 3,75 ml
Glutaraldehyd (25 %) 80 µl Fixierungslösung b
PBS (w/ Ca++, Mg++) 16,25 ml
PFA (8 %) 3,75 ml
Glutaraldehyd (25 %) 80 µl
Sucrose 4 g
Fixierungslösung c
PBS (w/ Ca++, Mg++) 20 ml
Sucrose 4 g
Fixierungslösung d
PFA 2 %
dH2O 50 ml
Fixierungslösung e
dPBS (w/o Ca++, Mg++) 70 ml Glutaraldehyd (25 %) 560 µl Blockierungs-Puffer
PBS (w/ Ca++, Mg++) 25 ml
Ziegenserum 1,25 ml
TritonX-100 75 µl
Antikörper-Puffer a
PBS (w/ Ca++, Mg++) 40 ml
BSA 0,4 g
TritonX-100 120 µl
Antikörper-Puffer b
BSA 1 %
TBS 1 l
DAPI-Lösung
DAPI 5 ng/ml
dH2O 100 ml
TBS
TrisHCl 78,8 g
NaCl 86,6 g
dH2O 10 l
pH (NaOH) 7,4 Entwicklerlösung
Tris-HCl 88 ml
Propandiol 30 ml
Levamisol 40 mg
Natriumnitrit 25 mg
dH2O 624 µl
Neufuchsin 50 µl
Naphthol 62 mg
Dimethylformamid 750 µl β-Galaktosidase-Waschpuffer
MgCl2 1 ml
dPBS (w/o Ca++, Mg++) 499 ml
β-Galaktosidase-Färbelösung
X-Gal 1,25 ml
Ferricyanid (0,5 M) 0,5 ml Ferrocyanid (0,5 M) 0,5 ml β-Galaktosidase-Waschpuffer 48 ml
3.2.5.3. Lösungen und Puffer für SDS-PAGE und Western Blot Trenngel 10 %
dH2O 6,15 ml
Acrylamid 5,15 ml
Tris-HCl (1,5 M) pH 8,8 3,85 ml
SDS (10 %) 155 µl
TEMED (10 %) 11,5 µl
APS (10 %) 155 µl
Sammelgel
dH2O 5,2 ml
Acrylamid 1,3 ml
Tris-HCl (1 M) pH 6,8 0,96 ml
SDS (10 %) 76,6 µl
TEMED (10 %) 7,6 µl
APS (10 %) 76,6 µl
Protease-Inhibitor
Phenylmethylsulfonylfluorid 1 mM
Pepstatin 1 µg/ml
Aprotinin 1 µg/ml
Antipain 5 µg/ml
Leupeptin 5 µg/ml
Trypsin-Chymotrypsin-
Inhibitor 100 µg/ml
Lämmli-Puffer x3
SDS 6 %
Glycerin 30 %
Tris-HCl (pH 6,8) 150 mM Bromphenolblau 0,02 % Probenpuffer
DTT 100 µl
SDS (20 %) 100 µl
Lämmli-Puffer x3 ad 1 ml SDS-PAGE Laufpuffer
Tris-HCl 3,082 g
Glycin 14,4 g
SDS 1 g
dH2O ad 1 l
Transferpuffer x10
Glycin 1,92 M
TRIS 0,25 M
Methanol 20 %
dH2O ad 1 l
